Las mucinas son glicoconjugados de alto peso molecular, con un tamaño que oscila entre 0,2 y 200 megadalton (MDa). Debido a su tamaño, las mucinas no penetran en los geles de poliacrilamida convencionales y requieren poros más grandes para su separación. Proporcionamos un protocolo detallado para la electroforesis en gel de mucina agarosa para evaluar la cuantificación relativa y estudiar el ensamblaje de polímeros.
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Artículo de método
La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular
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Resumen
Resumen
Las mucinas, las proteínas fuertemente glicosiladas que recubren las superficies mucosas, se han desarrollado como un componente clave en la defensa innata mediante la protección del epitelio contra los patógenos invasores. La función principal de estas macromoléculas es el de facilitar la captura de partículas y la limpieza, mientras que la promoción de la lubricación de la mucosa. Durante la síntesis de proteínas, las mucinas se someten intensa O-glicosilación y la multimerización, que aumentan dramáticamente la masa y el tamaño de estas moléculas. Estas modificaciones post-traduccionales son esenciales para las propiedades viscoelásticas de moco. Como resultado de la naturaleza compleja bioquímicas y biofísicas de estas moléculas, trabajando con mucinas ofrece muchos retos que no se pueden superar por métodos de análisis de proteínas convencionales. Por ejemplo, su alto peso molecular impide la migración electroforética a través de geles de poliacrilamida regulares y su naturaleza pegajosa provoca la adhesión a un tubo experimental. Sin embargo, la investigación del papel de las mucinas en la salud(Por ejemplo., El mantenimiento de la integridad de la mucosa) y la enfermedad (por ejemplo., Hiperconcentración, mucoestasis, cáncer) ha ganado recientemente el interés y las mucinas se están investigando como una diana terapéutica. Una mejor comprensión de la producción y función de macromoléculas de mucina puede conducir a enfoques farmacéuticos nuevos, por ejemplo, inhibidores de mucina exocitosis de gránulos y / o agentes mucolíticos. Por lo tanto, los protocolos coherentes y fiables para investigar la biología de mucina son fundamentales para el progreso científico. Aquí, se describen los métodos convencionales para separar macromoléculas de mucina por electroforesis utilizando un gel de agarosa, la transferencia de la proteína en la membrana de nitrocelulosa, y detectar la señal con anticuerpos de mucina específica, así como lector de gel fluorescente en el infrarrojo. Estas técnicas son ampliamente aplicables para determinar mucina cuantificación, la multimerización y para poner a prueba los efectos de compuestos farmacológicos sobre mucinas.
Introducción
Las mucinas se producen normalmente por las superficies de la mucosa que recubren las cavidades expuestas al ambiente externo (por ejemplo., Respiratorio, tracto digestivo, reproductivos, superficie ocular), así como los órganos internos (por ejemplo, páncreas, vesícula biliar, glándulas mamarias). La presencia de estas glicoproteínas mantiene la hidratación de la superficie y forma una barrera física contra los patógenos. Aunque la producción de mucina es esencial para la mucosa de la salud, hiperconcentración de mucina y / o propiedades del moco aberrantes puede conducir a la obstrucción de los conductos, la colonización bacteriana y la inflamació....
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Protocolo
1. Preparar Los tampones de mucina Gel Western Blotting
- Preparar 1 litro de 50x tampón TAE (Tris-acetato-EDTA).
- En 700 ml de agua destilada (dH 2 O) añadir 242 g de base Tris (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso de líquido) (0,2 M) y 14,61 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (50 mM).
- Ajustar el pH a 8,0 y completar el volumen hasta 1 litro con dH 2 O.
- Preparar 10 ml de tampón de carga 10x.
- Preparar 5 ml de tampón 1x TAE. Para ello, añadir 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), y 100 mg de dodecilsulfato de sodio (SDS) (1%).
- Prep....
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Resultados
Mostramos los resultados representativos de la expresión de mucina siguientes electroforesis en gel de agarosa en BALF de los pulmones de los ratones (Figura 1). En este ejemplo, se utilizó el gel de agarosa para mostrar la regulación positiva de la producción de mucina después del tratamiento de IL-13 de el modelo de ratón Tg-Muc5ac. La transferencia Western muestra una representación visual de la expresión de mucina, que puede ser utilizado para un análisis cuantitativ.......
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Discusión
El protocolo de transferencia de Western de mucina se describe en este vídeo combina técnicas convencionales utilizados en biología molecular para separar y transferir grandes macromoléculas, tales como ADN, con las técnicas habituales para la detección de proteínas, es decir., Inmunotransferencia. La misma técnica se podría aplicar para estudiar la biología de los glicosaminoglicanos complejos, tales como la descomposición de ácido hialurónico de alto peso molecular 18. Aunque esta técnica podría se.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. John Sheehan y a la Dra. Lubna Abdullah por su orientación y tutoría que fueron fundamentales para completar este trabajo. Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (P01HL108808, UH2HL123645) y la Fundación Terapéutica de la Fibrosis Quística, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey cuenta con el apoyo de una beca de investigación temprana de NHMRC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Ácido Acético Glacial | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma EDS-100g | 100g | |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromofenol Azul | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Citrato Salino Sódico) Tampón | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Citrato Trisódico (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg 10 |
| mM DTT (ditiotreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Leche en polvo | Saco | Leche en polvo desnatada instantánea | |
| Dulbecco Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anticuerpo primario de cabra anti-GFP (muestras de ratón) | Anticuerpos y ensayos de Rockland | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anticuerpo primario de conejo anti-Muc5b (muestras de ratón) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Anticuerpos primarios (muestras humanas) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μ g |
| 45M1 Anticuerpos primarios anti-MUC5AC (muestras humanas) | Abcam | ab3649 | 100 μ g |
| Burro Anti-conejo 800CW Tinte | IR LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Burro Anti-ratón 680LT Tinte IR | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electroforesis Caja de Gel y Bandeja de Fundición Búho | Sistemas | ||
| Caja de Alimentación | Biorad | Modelo 200/20 | |
| Papel de transferencia de membrana | Amersham | 10600016 | |
| Membrana de papel y nitrocelulosa Whatman | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Secante al vacío 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Sistema de fluorescencia infrarroja | LI-COR Biosciences |
Referencias
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotei....
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Reimpresiones y permisos
