Artículo de método

Mejora Técnica Swiss-laminación para la preparación del tejido intestinal para inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia

DOI:

10.3791/54161

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13 de julio de 2016

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1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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La identificación exacta y la ubicación de las células epiteliales a lo largo del revestimiento de la mucosa intestinal son esenciales para definir diferentes linajes celulares. de formación de imágenes adecuado de los tejidos intestinales es crucial para la identificación de patrones de expresión de proteínas con la máxima resolución. Este estudio tiene como objetivo delinear los métodos y condiciones óptimas para el procesamiento de tejidos intestinales de ratón.

Resumen

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Es importante comprender el papel de los factores que regulan la homeostasis del epitelio intestinal y la respuesta a las lesiones y la regeneración. La literatura actual describe varios enfoques metodológicos diferentes para obtener imágenes de tejidos intestinales para la validación de datos. En este artículo, delineamos un protocolo común relacionado con la derivación y el procesamiento de tejidos intestinales de ratón. Se discute la fijación adecuada de los tejidos intestinales y las técnicas de Swiss-roll que mejoran la morfología epitelial intestinal. El procesamiento posterior a la resección y la reorientación de los tejidos intestinales incrustados son fundamentales para obtener bloques incluidos en parafina que muestran características estructurales intestinales intactas después del corte. La técnica de balanceo suizo ayuda en la evaluación histológica de las secciones intestinales o colónicas completas examinadas. La capacidad de diferenciar las características estructurales intestinales puede ser vital en las mediciones cuantitativas de la inflamación intestinal y la tumorigénesis a lo largo de toda la longitud. Por último, las secciones incluidas en parafina son ideales para un procesamiento robusto mediante métodos de detección inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes. Las secciones inmunohistoquímicas no fluorescentes proporcionan una imagen vibrante del tejido, detallando diferentes características estructurales celulares, pero no proporcionan flexibilidad para los experimentos de colocalización intracelular. Múltiples canales fluorescentes se pueden utilizar adecuadamente con la detección de inmunofluorescentes para experimentos de colocalización, lo que brinda apoyo a los estudios mecanicistas.

Introducción

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El epitelio intestinal de mamíferos comprende una única capa de células columnares. En el intestino delgado, las células proliferativas se limitan a las criptas mientras que las células diferenciadas ocupan la región de las vellosidades. Sin embargo, porque no hay vellosidades en el intestino grueso, las células proliferativas se localizan en la parte inferior de las criptas y células diferenciadas ocupan la región superior de las criptas. El epitelio intestinal se somete a la reposición rápida (aproximadamente 3 - 5 días) que es impulsado por la división continua de las células proliferativas en las criptas. Las células proliferativas de las criptas no son una pobla....

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Protocolo

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1. Los ratones

  1. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC). Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas.
    1. Comercialmente obtener ratones C57BL / 6. Obtener C57BL / 6 ratones portadores de alelos KLF5 flanqueado por sitios loxP (KLF5 f l / f l). Estos ratones fueron descritos anteriormente 21 y amablemente proporcionados por el doctor Ryozo Nagai.
  2. Compra ratones C57BL / 6 que llevan el gen inducible Cre recombinasa bajo....

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Resultados

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Esta técnica de grabado suizo en combinación con tinción inmunohistoquímica permite el análisis exhaustivo de tejido intestinal pequeña o grande. El ejemplo de tinción H & E de un intestino grueso de un ratón C57BL / 6 (Figura 1) es una ilustración de la viabilidad y la eficacia de esta técnica. Como se muestra en la Figura 1, la imagen es capaz de capturar todas las porciones del colon: proximal, medio y distal. Por lo tanto, permite la evaluación h.......

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Discusión

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La técnica de laminación Swiss es un método poderoso para la preparación de tejido intestinal para la evaluación histológica y morfológica en gran escala. En contraste con la técnica de Swiss-laminación anteriormente descrito, que fue desarrollado originalmente para la preparación de secciones congeladas 18,19, el procedimiento que aquí se presenta permite la preparación del tejido intestinal rápido y fijación para la fijación con formalina y la incrustación de parafina (FFPE). En comparación con tejido conge.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer a Ainara Ruiz de Sabando por proporcionar imágenes de H&E. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (DK052230, DK093680 y CA172113) otorgadas al Dr. Vincent W. Yang.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kits de disección de acero inoxidableVWR25640-002
Cámara de desobstrucciónBiocare MedicalDC2012
Jeringa 10 mlVWR89215-218
Swingsette Casete de incrustación/procesamiento de tejidos con tapaPortaobjetos SimportM515
Superfrost Plus [tamaño: 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
Juego de tinción manual para portaobjetosTissue-Tek/Sakura4451
Plato de tinción verdeTissue-Tek/Sakura4456
Plato de tinción WhiteTissue-Tek/Sakura4457
Portaobjetos de 24 carros con asa desmontableHorno Tissue-Tek/Sakura4465
ThermoScientific6243para hornear portaobjetos a 65 grados
Microscopio de disecciónZeissStemi 2000C
Microscopio de fluorescenciaNikonEclipse 90iLuz brillante y fluoerescente, con objetivos: 10X, 20X
Pluma PAP Bloqueador de superlíquidos MiniFisherScientific DAI-PAP-S-M
Etanol 200 pruebaAAPR111000200
MetanolVWRBDH1135-4LP
Ácido acético glacialAAPR281000ACS
XilenoFisher ScientificX5P-1GAL
Peróxido de hidrógeno al 25% solución en aguaACROS202465000
10% formalina buferadaFisher Scientific22-026-213
Fracción V del suero bovino, choque térmicoRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Citrato de sodioFisherScientific S279
Aguja de sonda VWR20068-624
Anticuerpo anti Klf5de conejo Santa Cruz Biotechnologysc-22797Dilución 1:150
Anticuerpo anti EGFP de polloMilliporeAB16901Dilución 1:500
Anticuerpoanti Ki67 de conejoBiocare MedicalCRM325B Dilution 1:500
Mach3 conejo AP kit de detección de polímerosBiocare MedicalM3R533L
Warp kit de cromógeno rojoBiocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 ratones Laboratorios Jackson008875 
Procesador automatizadoLeicaLeica TP1020

Referencias

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  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. ....

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