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Artículo de método

Mejora Técnica Swiss-laminación para la preparación del tejido intestinal para inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia

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DOI:

10.3791/54161

⸱

13 de julio de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La identificación exacta y la ubicación de las células epiteliales a lo largo del revestimiento de la mucosa intestinal son esenciales para definir diferentes linajes celulares. de formación de imágenes adecuado de los tejidos intestinales es crucial para la identificación de patrones de expresión de proteínas con la máxima resolución. Este estudio tiene como objetivo delinear los métodos y condiciones óptimas para el procesamiento de tejidos intestinales de ratón.

Resumen

Es importante comprender el papel de los factores que regulan la homeostasis del epitelio intestinal y la respuesta a las lesiones y la regeneración. La literatura actual describe varios enfoques metodológicos diferentes para obtener imágenes de tejidos intestinales para la validación de datos. En este artículo, delineamos un protocolo común relacionado con la derivación y el procesamiento de tejidos intestinales de ratón. Se discute la fijación adecuada de los tejidos intestinales y las técnicas de Swiss-roll que mejoran la morfología epitelial intestinal. El procesamiento posterior a la resección y la reorientación de los tejidos intestinales incrustados son fundamentales para obtener bloques incluidos en parafina que muestran características estructurales intestinales intactas después del corte. La técnica de balanceo suizo ayuda en la evaluación histológica de las secciones intestinales o colónicas completas examinadas. La capacidad de diferenciar las características estructurales intestinales puede ser vital en las mediciones cuantitativas de la inflamación intestinal y la tumorigénesis a lo largo de toda la longitud. Por último, las secciones incluidas en parafina son ideales para un procesamiento robusto mediante métodos de detección inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes. Las secciones inmunohistoquímicas no fluorescentes proporcionan una imagen vibrante del tejido, detallando diferentes características estructurales celulares, pero no proporcionan flexibilidad para los experimentos de colocalización intracelular. Múltiples canales fluorescentes se pueden utilizar adecuadamente con la detección de inmunofluorescentes para experimentos de colocalización, lo que brinda apoyo a los estudios mecanicistas.

Introducción

El epitelio intestinal de mamíferos comprende una única capa de células columnares. En el intestino delgado, las células proliferativas se limitan a las criptas mientras que las células diferenciadas ocupan la región de las vellosidades. Sin embargo, porque no hay vellosidades en el intestino grueso, las células proliferativas se localizan en la parte inferior de las criptas y células diferenciadas ocupan la región superior de las criptas. El epitelio intestinal se somete a la reposición rápida (aproximadamente 3 - 5 días) que es impulsado por la división continua de las células proliferativas en las criptas. Las células proliferativas de las criptas no son una población homogénea y se subdividen en células madre y células de tránsito de amplificación (TA) 1. Las células madre residen en la parte inferior de la cripta, dentro de los primeros 4 - 5 células de la parte inferior 2. El modelo actual apoya la existencia de dos tipos de células madre: células madre de las criptas columnar base (CBC) y las células madre latentes de reserva. El CBC stem células proliferan activamente y están marcados por la proteína G que contiene la repetición rica en leucina-receptor acoplado a 5 (LGR5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 y Achaete escudo 2 similar (ascl2) 5. Por otro lado, las células madre latentes de reserva están etiquetados por B sitio específico de la célula murina de Moloney virus de la leucemia de integración 1 (Bmi1) 6, la telomerasa de ratón transcriptasa inversa (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-like y CAM quinasa -Como 1 (Dclk1) 9, y ricos en leucina repite y dominios similares a inmunoglobulina 1 (LRIG1) 10. Las células madre proliferan activamente dan lugar a células TA entonces someterse a una diferenciación en células de absorción (enterocitos) y células secretoras (enteroendocrinas, caliciformes, células Paneth y Tuft). la división celular continua en la zona de proliferación resulta en el movimiento hacia arriba de las células epiteliales a lo largo del eje cripta-vellosidad hasta que llegan a la parte superior de las vellosidades, donde se someten a apoptosis y sondesprendido de la superficie del epitelio. Los diferentes tipos de células del epitelio intestinal se caracterizan por la expresión de proteínas distintas (por ejemplo, células caliciformes intestinales pueden ser reconocidos por la tinción con anticuerpo contra las células de Paneth y Muc2 con anticuerpo contra lisozima). Se estudia el papel de Krüppel-como factores (KLFs) en la homeostasis y patobiología del epitelio intestinal 11-13. Los resultados presentados aquí el apoyo a la viabilidad de una técnica de Swiss-balanceo modificado se basan en estudios anteriores de la función de factor de Krüppel-como 5 (KLF5) en el mantenimiento de las células madre epiteliales intestinales proliferación activa 14. KLF5 es un factor de transcripción con dedo de zinc que está altamente expresado en el tallo intestinal activa y células TA 12. Estudios anteriores demostraron que KLF5 es co-expresada con Ki-67, un marcador de proliferación conocido en las criptas intestinales.

El tr gastrointestinal acto no es un tejido homogéneo estructural o funcionalmente. El intestino delgado se divide en el duodeno, el yeyuno y el íleon y el intestino grueso en ciego y colon, con este último aún más dividido en proximal, media y distal. Cada una de estas secciones tiene características histológicas únicos y desempeña funciones distintas 15. Como tal, los efectos de insultos y el grado de la respuesta del epitelio intestinal puede depender de la región de tejido estudiado 16. Además, varias cepas de ratones demuestran la diversidad de la respuesta a nivel histológico basado en el tipo de insulto utilizado en los estudios 16. Por lo tanto, como corresponde a la preparación del tejido es necesaria para permitir histológico apropiado y el análisis molecular de los tejidos intestinales. Como tal, el suizo-line subvenciones técnica de análisis de la longitud completa del epitelio intestinal a la vez y por lo tanto verificaba conclusiones bien informadas sobre la base de una información completa.

e_content "> La técnica Swiss-rodillo se mencionó por primera vez por Magnus 17, y se describe en detalle por Moolenbeck y Ruitenberg y Park et al., como un método para preparar los tejidos y la realización de análisis histológicos del intestino roedor 18,19, respectivamente. El protocolo delineado en esta publicación presenta una versión mejorada del método original que permite para la preparación del tejido a tiempo y fiable para fines de diagnóstico. esta técnica modificada permite para las colecciones y preparación del epitelio intestinal de técnicas utilizadas universalmente, como la inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, así eficientes como la hibridación in situ (fluorescente y cromogénico 20). Además, el tejido modificado espécimen método de preparación utiliza reactivos fácilmente disponibles y relativamente baratos, mientras que ofrecen un método de fijación del tejido de rápida y permite la recuperación de la proteína, ADN, y ARN para la evaluación adicional. Tomado juntos, this técnica es excelente para la evaluación completa de las características histopatológicas, patológicos y moleculares del epitelio intestinal.

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Protocolo

1. Los ratones

  1. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC). Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas.
    1. Comercialmente obtener ratones C57BL / 6. Obtener C57BL / 6 ratones portadores de alelos KLF5 flanqueado por sitios loxP (KLF5 f l / f l). Estos ratones fueron descritos anteriormente 21 y amablemente proporcionados por el doctor Ryozo Nagai.
  2. Compra ratones C57BL / 6 que llevan el gen inducible Cre recombinasa bajo la regulación del promotor LGR5 (LGR5-EGFP / CreERT2 ratones).
  3. Establecer f l / f l ratones LGR5-EGFP / Creer T2 / KLF5, cruce KLF5 fl / f l ratones con ratones LGR5-EGFP / Creer T2 y luego la progenie de retrocruzamiento para KLF5 fl / f l ratones.
  4. Tratar a los ratones con el tamoxifeno como por el protocolo descrito previamente 22. Inyectar ratones de control experimental y 8 semanas de edad por vía intraperitoneal (IP) con 1 mg de tamoxifeno (10 mg / ml), disuelto en aceite de maíz estéril, durante 5 días consecutivos.
  5. En el día 14 después de la primera inyección tamoxifeno, sacrificar ratones utilizando asfixia con CO2, colocándolos en una cámara conectada a CO 2 fuente de gas. Permitir que el gas fluya en la cámara hasta que los ratones son inconscientes y todo movimiento cesa. Para asegurar la eutanasia realizar dislocación cervical.

2. Preparación del tejido y Swiss balanceo

  1. El uso de pinzas de disección y tijeras, corte de una incisión en la piel de la parte abdominal. Con un par de pinzas, mantenga la piel en la incisión y tirar suavemente lejos del tejido muscular abdominal. Use un par de tijeras para cortar la piel del abdomen y exponer los músculos abdominales.
  2. Sostener y levantar el PEritoneum con las pinzas. Asegúrese de no aguantar y tirar de los intestinos. Con cuidado, hacer una incisión en el tejido peritoneal y continuar cortando la piel para exponer los músculos abdominales. Con cuidado, hacer una incisión en los músculos abdominales y continuar cortarlos para exponer los intestinos.
  3. Identificar el colon y rastrear al extremo distal donde se une con el recto / ano. Con un par de tijeras, corte tan cerca de la abertura anal como sea posible.
  4. Identificar el estómago y rastrear donde se une con el intestino delgado. Con un par de tijeras, corte sin el intestino alrededor de 1 cm de distancia desde el estómago. Transferencia de toda la longitud del intestino delgado y el colon liberado a un plato limpio Petri que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  5. Con una mano o un par de fórceps, sujetar el extremo distal del colon y utilizar la otra mano para desentrañar suavemente toda la longitud del colon de cualquier tejido conectivo y / o grasa mesentérica.
  6. Identificar el ciego(Pequeña bolsa entre el intestino delgado y grueso) y cortar en el ciego y el colon se unen (el extremo proximal del colon) para liberar el colon.
  7. Con una mano o un par de pinzas, mantenga el intestino delgado y utilizar la otra mano para desentrañar suavemente toda la longitud del intestino delgado a partir de cualquier tejido conectivo y / o grasa mesentérica. Cortar el ciego y desechar si no hay necesidad de hacerlo.
    Nota: El proceso se puede detener aquí mediante la incubación de los intestinos diseccionados a cabo en fijador de Bouin modificado (50% / 5% de ácido acético en etanol dH 2 O) durante la noche y continuar el procedimiento el día siguiente.
  8. Manejo de un segmento del intestino (intestino delgado o el colon), llenar una jeringa de 10 ml con fijador de Bouin modificado y adjuntar una aguja de sonda a la misma. Insertar la aguja alrededor de medio centímetro en la abertura anterior del segmento intestinal.
  9. Mantenga la aguja de sonda dentro del segmento intestinal mediante la aplicación de una presión firme con un instrumentoen el segmento intestinal. Con la otra mano sostiene la jeringa, aplique una presión suave pero constante para eliminar el contenido del segmento intestinal usando el fijador de Bouin modificado. Este paso permite la limpieza simultánea del segmento intestinal y la fijación inmediata. Utilice una placa de Petri para recoger los residuos de flujo continuo. La fijación se puede observar por el color de colon girando opaco.
    Nota: Asegúrese de no aplicar demasiada presión durante la limpieza o el segmento intestinal podría estallar.
  10. Con unas tijeras, cortar el segmento intestinal longitudinalmente a lo largo de la línea mesentérica. Sostenerlo con un par de pinzas y enjuagar brevemente en una placa de Petri que contiene PBS.
    1. Cortar el intestino delgado en 3 segmentos iguales: proximal, media y distal. El segmento proximal es el que inmediatamente después de la estómago, y el segmento distal es el que inmediatamente antes de los dos puntos. El segmento proximal es equivalente al duodeno, mediados en el yeyuno y el distal ael íleon.
    2. Para cada segmento de marcar el proximal y el extremo distal. El extremo proximal es la que apuntaba originalmente hacia el estómago y el distal apuntado hacia el colon.
  11. Utilice la parte superior de una placa de Petri para colocar el segmento intestinal limpiado y abierto. Coloque el segmento intestinal con el lado luminal hacia arriba.
    1. Para el colon, identificar el lado luminal de los variegaciones / salientes que se extienden a través de su anchura y están presentes en el extremo proximal. Las regiones medios y distales tienen algunos variedad cromática que corren longitudinalmente. Para el intestino delgado, identificar el lado luminal por la superficie de apariencia áspera, que marca las vellosidades.
      Nota: Para el intestino delgado, no hay demarcación anatómica macroscópica externa de proximal, media y distal regiones. Sin embargo, estas regiones pueden ser pueden identificarse en las secciones bajo el microscopio. Las vellosidades son más largo de la región proximal y distal se vuelven progresivamente más corto donde estánlos más cortos en longitud. Microscópicamente, las criptas colónicas son más cortos en la región proximal que también puede ser identificado por la presencia de crestas. Las criptas colónicas son más alto de la sección media y más corto en la región distal y aún más alta que en la región proximal.
  12. Proceder con Swiss rodando los dos puntos:
    1. Mantener el colon plana abierta y tire de él con unas pinzas desde su extremo proximal hacia el borde de la placa de Petri.
    2. Mantenga lado luminal hacia arriba y mantenga el extremo proximal de la pinza con una mano y con la otra mano sostener un palillo de dientes.
    3. Envolver el borde del extremo proximal alrededor del palillo de dientes usando fórceps y pellizcar ligeramente el borde envuelta contra el palillo de dientes para mantenerla en su lugar.
    4. Suavemente y poco a poco comenzará a rodar el palillo de dientes con los dedos para rodar los dos puntos alrededor del palillo para formar un brazo de gitano.
    5. Una vez que toda la longitud del colon se ha enrollado, utilice un par de pinzas para deslizar con cuidado el cOlón brazo de gitano de la palillo de dientes y en una de procesamiento de tejido / cassette -embedding. Coloque el casete en 10% de formalina tamponada durante la noche a temperatura ambiente.
  13. Proceder con Swiss rodar el intestino delgado:
    1. Manejo de un segmento a la vez, mantener el segmento plano abierto con cara luminal y tire de él con unas pinzas desde su extremo proximal hacia el borde de la placa de Petri.
    2. Proceder con el balanceo suizo como se describe para el colon.
  14. Proceder con el procesamiento de tejidos fijados en formalina para la inclusión en parafina. Proceder de la siguiente:
    NOTA: Utilice un procesador automático (ver materiales y equipos de para más detalles).
    1. Mientras que el tejido está en el cassette, enjuague tejido con PBS hasta que el fijador se elimina por completo.
    2. Deshidratar tejido usando etanol en la secuencia siguiente: 50% de etanol durante 10 min, 70% de etanol durante 10 min, 80% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min , y 100% de etanol durante 10 min.
    3. etanol Exchange con xileno en la siguiente secuencia: 2: 1 etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 1 etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 2 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 100% de xileno para 10 - 15 min, 100% de xileno durante 10 - 15 min, y 100% de xileno durante 10 - 15 min. PRECAUCIÓN: El xileno es un peligro para la salud, por lo tanto el lugar de trabajo debe estar equipado con un sistema de ventilación aspirante local, con una capucha adecuada y el equipo de protección adecuado debe ser llevaba por el personal.
    4. xileno Exchange con parafina. Realice los siguientes pasos en el vacío creado horno de 54 - 58 ° C: 2: 1 xileno: parafina durante 30 min, 1: 1 de xileno: parafina durante 30 min, 1: 2 xileno: parafina durante 30 min, 100% parafina para 1 - 2 horas, y el 100% de parafina por 1 - 2 horas o durante la noche.
      Nota: No permita que la parafina exceda de 60 ° C durante períodos prolongados de tiempo, ya que esto degradará los polímeros de parafina y que sea duro y quebradizo.
    5. Incrustar en parafina nueva y orientar tejido fresco como eldeseada antes endurece la parafina. Para los bollos suizos, siguiendo paraffinization tejido, es importante cambiar la posición de cada rodillo en su lado durante la inclusión en parafina. Esto asegura que durante el corte, se producen secciones de toda la longitud de cada rollo.
  15. Para la tinción, cortar secciones gruesas 5-micras utilizando microtomo. Recoger las secciones en portaobjetos cargados y secarlos (hornear) en un 65 ° C durante la noche del horno; dejar enfriar a temperatura ambiente y posteriormente se haya utilizado para la tinción.
    Nota: El tiempo de cocción se puede acortar en 1 - 2 horas dependiendo de cómo recién cortado las diapositivas son. Si hay menos de un mes desde el corte, entonces es aconsejable para cocer al horno durante la noche. Si han pasado más de un mes, a continuación, 1 - 2 horas de cocción es suficiente para ahorrar tiempo. Si acaba el tiempo, respaldo durante la noche siempre se puede utilizar.

3. Análisis histológico y tinción de inmunofluorescencia

Realizar el análisis histológico y immunoflutinción orescence como se describió previamente 23,24, con modificaciones. Para mejorar la proteína verde fluorescente de inmunofluorescencia (EGFP):

  1. Hornear los portaobjetos en un horno a 65 ° C durante 1 hora para inactivar la actividad fosfatasa alcalina endógena y, posteriormente, Desparafinar en xileno.
  2. Incubar las secciones en un baño de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol para bloquear las peroxidasas endógenas de tejido; luego rehidratar mediante incubación en una serie decreciente baño de alcohol (100%, 95%, 70%), seguido de la recuperación de antígeno en solución tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C durante 10 min usando una cámara de destape.
  3. Dibuje un círculo alrededor de secciones de tejido usando pluma de marca que proporciona barrera hidrófoba e incubar las secciones con tampón de bloqueo (2,5% de albúmina de suero bovino [BSA] en TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C y luego con el anticuerpo primario contra EGFP (dilución 1 : 500) a 4 ° C durante la noche en una cámara húmeda mientras se agita suavemente.
  4. Lavar las secciones y se incuba con el anticuerpo secundario fluorescente marcada con a la concentración apropiada durante 30 min a 37 ° C.
  5. Lavar los portaobjetos después del tratamiento con anticuerpos y la tinción de los núcleos secundarios con Hoechst y montar con un medio de montaje.
    1. Para KLF5 / EGFP / Ki-67 co-tinción, los portaobjetos de proceso como se describe en los pasos 3.1 - 3.3 y llevar a cabo la tinción de KLF5 por incubación con anticuerpo KLF5 (dilución 1: 150) durante la noche.
    2. Aplicar la detección de polímero AP conejo para diapositivas como por protocolo.
    3. Reveal Klf4 tinción utilizando tinción inmunohistoquímica cromógeno según el protocolo del fabricante.
    4. Realizar la elución del anticuerpo usando el protocolo descrito previamente 25. Incubar los portaobjetos a 50 ° C en glicina-SDS (pH 2,0) solución con agitación durante 1 hr.
    5. Lavar los portaobjetos a fondo con agua destilada y se incuba con tampón de bloqueo (2,5% de BSA en TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C.
    6. Añadir Ki-67 (dilución 1: 500) y EGFP (dilución 1:500) anticuerpos simultáneamente y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
    7. Realizar la detección fluorescente con anticuerpos secundarios apropiados antes de la tinción con Hoechst (datos no mostrados) y montar con medio de montaje.
  6. Observar la morfología histológica de los tejidos en la tinción de secciones de 5 micras con hematoxilina y eosina (H & E) 26. Para las imágenes fluorescentes, utilizar longitudes de onda de emisión de 535, 646, y 700 para visualizar EGFP, KLF5, y Ki-67 tinción, respectivamente.

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Resultados

Esta técnica de grabado suizo en combinación con tinción inmunohistoquímica permite el análisis exhaustivo de tejido intestinal pequeña o grande. El ejemplo de tinción H & E de un intestino grueso de un ratón C57BL / 6 (Figura 1) es una ilustración de la viabilidad y la eficacia de esta técnica. Como se muestra en la Figura 1, la imagen es capaz de capturar todas las porciones del colon: proximal, medio y distal. Por lo tanto, permite la evaluación h...

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Discusión

La técnica de laminación Swiss es un método poderoso para la preparación de tejido intestinal para la evaluación histológica y morfológica en gran escala. En contraste con la técnica de Swiss-laminación anteriormente descrito, que fue desarrollado originalmente para la preparación de secciones congeladas 18,19, el procedimiento que aquí se presenta permite la preparación del tejido intestinal rápido y fijación para la fijación con formalina y la incrustación de parafina (FFPE). En comparación con tejido conge...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Ainara Ruiz de Sabando por proporcionar imágenes de H&E. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (DK052230, DK093680 y CA172113) otorgadas al Dr. Vincent W. Yang.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kits de disección de acero inoxidableVWR25640-002
Cámara de desobstrucciónBiocare MedicalDC2012
Jeringa 10 mlVWR89215-218
Swingsette Casete de incrustación/procesamiento de tejidos con tapaPortaobjetos SimportM515
Superfrost Plus [tamaño: 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
Juego de tinción manual para portaobjetosTissue-Tek/Sakura4451
Plato de tinción verdeTissue-Tek/Sakura4456
Plato de tinción WhiteTissue-Tek/Sakura4457
Portaobjetos de 24 carros con asa desmontableHorno Tissue-Tek/Sakura4465
ThermoScientific6243para hornear portaobjetos a 65 grados
Microscopio de disecciónZeissStemi 2000C
Microscopio de fluorescenciaNikonEclipse 90iLuz brillante y fluoerescente, con objetivos: 10X, 20X
Pluma PAP Bloqueador de superlíquidos MiniFisherScientific DAI-PAP-S-M
Etanol 200 pruebaAAPR111000200
MetanolVWRBDH1135-4LP
Ácido acético glacialAAPR281000ACS
XilenoFisher ScientificX5P-1GAL
Peróxido de hidrógeno al 25% solución en aguaACROS202465000
10% formalina buferadaFisher Scientific22-026-213
Fracción V del suero bovino, choque térmicoRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Citrato de sodioFisherScientific S279
Aguja de sonda VWR20068-624
Anticuerpo anti Klf5de conejo Santa Cruz Biotechnologysc-22797Dilución 1:150
Anticuerpo anti EGFP de polloMilliporeAB16901Dilución 1:500
Anticuerpoanti Ki67 de conejoBiocare MedicalCRM325B Dilution 1:500
Mach3 conejo AP kit de detección de polímerosBiocare MedicalM3R533L
Warp kit de cromógeno rojoBiocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 ratones Laboratorios Jackson008875 
Procesador automatizadoLeicaLeica TP1020

Referencias

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Mejora Técnica Swiss-laminación para la preparación del tejido intestinal para inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia
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