Artículo de método

subtipificación de Campylobacter jejuni Ssp. doylei El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

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30 de octubre de 2016

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1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

En este artículo

Resumen

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Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).

Resumen

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MALDI-TOF MS ofrece la posibilidad de diferenciar algunas bacterias no sólo a nivel de especies y subespecies, sino incluso por debajo, a nivel de cepa. isoformas alélicas de los iones detectables de biomarcadores resultan en desplazamientos en masa aislante específica. phyloproteomics de masas basado en la espectrometría (MSPP) es una nueva técnica que combina las masas de espectrometría de masas de biomarcadores detectables en un esquema que permite la deducción de las relaciones phyloproteomic de los cambios de masa específica del aislante en comparación con un genoma secuenciado cepa de referencia. Las secuencias de aminoácidos deducidas se utilizan entonces para calcular dendrogramas basados ​​en MSPP.

A continuación se describe el flujo de trabajo del MSPP escribiendo un ssp Campylobacter jejuni. Doylei colección aislado de siete cepas. Todos los siete cepas eran de origen humano y la secuencia de multilocus (MLST) demostrado su diversidad genética. MSPP tipificación resultó en siete diferentes tipos de secuencias del MSPP, lo que refleja suficientemente su grafíalas relaciones logenetic.

El C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP incluye 14 diferentes iones de biomarcadores, proteínas ribosomales en su mayoría en el rango de masa de 2 a 11 kDa. MSPP puede, en principio, ser adaptado a otras plataformas de espectrometría de masa con un rango de masa extendida. Por lo tanto, esta técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta útil para la tipificación microbiana nivel de cepa.

Introducción

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Durante la última década, láser asistida por matriz de desorción ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) ha avanzado a ser un método estándar de gran valor para el género microbiano y la identificación de las especies en microbiología clínica 1, 2. La identificación de especies se basa en el registro de huellas digitales pequeñas proteínas de las células intactas o lisados ​​celulares. El rango de masa típica de un espectrómetro de masas utilizado en microbiología clínica habitual es de 2-20 kDa. Además, el espectro resultante se puede utilizar para discriminar las cepas en las siguientes especies y de ....

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Protocolo

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1. Preparar un lugar de trabajo seguro, considerando bioseguridad Condiciones

  1. Familiarizarse con los reglamentos de laboratorio y de seguridad que son de relevancia para el trabajo con microorganismos. La mayoría de los microorganismos patógenos humanos deben ser manejados a nivel de bioseguridad 2 condiciones, pero algunos, como la Salmonella enterica serovar Typhi, requieren de bioseguridad de nivel 3. La información sobre el nivel de manejo de cada patógeno se puede acceder en www.cdc.gov/biosafety.
  2. Independientemente de la clasificación de riesgo biológico de microorganismos específicos, considerar todos los materiales que estuvieron....

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Resultados

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Anteriormente, hemos establecido con éxito un esquema de MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. En este caso, el objetivo fue extender el método a la hermana subespecie C. ssp jejuni. doylei. En esta configuración específica, siete C. jejuni ssp. doylei los aislados fueron adquiridos de la colección belga de microorganismos / Laboratorio de Microbiología UGent BCCM / LMG Gante, Bélgica. Todos los siete aislam.......

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Discusión

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El paso más crítico en el establecimiento de un régimen de MSPP es la determinación genética inequívoca de las identidades de iones de biomarcadores. Si no es posible identificar un biomarcador, sin duda, entonces debe ser excluido del régimen 13.

El C. ssp. doylei esquema jejuni incluye 14 diferentes iones de biomarcadores. Estos son 5 menos en comparación con la C. jejuni ssp. esquema de jejuni MSPP 13 .La diferencia más si.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Estamos agradecidos a Hannah Kleinschmidt por su excelente soporte técnico. Este artículo fue financiado por el programa de apoyo al Acceso Abierto de la Deutsche Forschungsgemeinschaft y el fondo de publicaciones de la Georg August Universität Göttingen.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
acetonitriloSigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania34967
Sistema Autoflex III TOF/TOF 200Bruker Daltonics, Bremen, AlemaniaGT02554 G201Espectrómetro de masas
patrón de prueba bacteriana BTSBruker Daltonics, Bremen, Alemania604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Alemania263564 Paquete de software
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, Bremen, Alemania82901905 tubos
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislar Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, BélgicaLMG8843ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; cepa 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, BélgicaLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, BélgicaLMG7790ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, BélgicaLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado Bélgica coordinación de la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Gante, BélgicaLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado Bélgica coordinación de la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Gante, BélgicaLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, BélgicaLMG8870NCTC A613/87
Columbia agar base Merck, Darmstadt, Alemania1.10455 .0500500 g
para FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Alemania251419 Paquetede
sangre de oveja desfibrinada Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, AlemaniaSR0051
etanolSigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania02854 Ácido
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemaniaF0507
Matriz HCCABruker Daltonics, Bremen, Alemania604531
Kimwipes papel tisúKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Bremen, Alemania259935Paquete de software Mástil
Viales CryobankMast Diagnostica, Reinfeld, AlemaniaObjetivo de acero pulido CRYO/B
MSP 96Bruker Daltonics, Bremen, Alemania224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Alemania51304
insulina humana recombinanteSigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemaniaI2643
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemaniaT6508
agua, de grado de biología molecularSigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemaniaW4502
Brújula de software fórmico Fluka Z188956 Ácido trifluoroacético

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O.

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