Artículo de método

Un ensayo libre de células Utilizando

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DOI:

10.3791/54173

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8 de agosto de 2016

 , 
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

En este artículo

Resumen

Los mecanismos de escalamiento celular e intracelular siguen siendo esquivos. El uso de extractos de embriones de Xenopus se ha vuelto cada vez más común para dilucidar los mecanismos de regulación del tamaño de los orgánulos. Este método describe la preparación de extractos embrionarios y un nuevo ensayo de escalamiento nuclear a través del cual se pueden identificar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.

Resumen

Una pregunta fundamental en biología celular es cómo se regulan los tamaños de células y orgánulos. Durante mucho tiempo se ha reconocido que el tamaño del núcleo escalas generalmente con el tamaño de la celda, en particular durante la embriogénesis cuando se producen reducciones dramáticas en tanto celular y tamaños nucleares. Mecanismos de regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocida y puede ser relevante para el cáncer, donde el tamaño nuclear alterada es un parámetro clave de diagnóstico y pronóstico. En vivo para la identificación de los reguladores nucleares de tamaño se complica por la naturaleza esencial y compleja de la función nuclear. El enfoque in vitro descrito aquí para estudiar el control del tamaño nuclear se aprovecha de las reducciones normales en tamaño nuclear que se producen durante el desarrollo de Xenopus laevis. En primer lugar, los núcleos se ensamblan en X. laevis extracto de huevo. A continuación, estos núcleos se aíslan y se resuspendieron en el citoplasma de embriones de etapa tardía. Después de un 30 - 90 min período de incubación, la superficie nucleardisminuye en 20 a 60%, proporcionando un ensayo útil para identificar los componentes citoplasmáticos presentes en embriones de etapa tardía que contribuyen al desarrollo de escala tamaño nuclear. Una ventaja importante de este enfoque es la facilidad relativa con la que los extractos de huevo y embrión puede ser bioquímicamente manipulados, lo que permite la identificación de nuevas proteínas y actividades que regulan el tamaño nuclear. Como con cualquier enfoque en vitro, la validación de los resultados en un sistema in vivo es importante, y la microinyección de X. laevis embriones es particularmente apropiado para estos estudios.

Introducción

Los tamaños de los orgánulos celulares típicamente escala con el tamaño de la célula, y esto ha sido quizás mejor documentado para el escalado de tamaño nuclear con tamaño de celda 1-10. Esto es particularmente cierto durante la embriogénesis y la diferenciación celular, cuando reducciones dramáticas en tanto celular y tamaño nuclear se observan a menudo 11,12. Además, alterado tamaño nuclear es un parámetro clave en el diagnóstico de cáncer y el pronóstico 13-17. Mecanismos que contribuyen a la regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocidos, en parte debido a la complejidad y la naturaleza esencial de la estructura y la función nuclear. El método aquí descrito se desarrolló como un ensayo in vitro para la escala del tamaño nuclear que es susceptible a la manipulación bioquímica y la elucidación de los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.

Xenopus laevis extracto de huevo es un sistema bien establecido para recapitular y estudiar procesos celulares complejos en un in vitro Contexto. Estos extractos han revelado nueva información fundamental acerca de varios procesos celulares, incluyendo el montaje y la función del huso mitótico, retículo endoplasmático, y el núcleo 18-22. Una ventaja clave del sistema es que el extracto de X. extractos de huevo laevis representan un citoplasma casi sin diluir cuya composición puede ser alterado fácilmente, por ejemplo mediante la adición de proteínas o immunodepletion recombinantes. Además, uno es capaz de manipular los procesos esenciales mediante el empleo de tratamientos que de otro modo podrían ser letales en un contexto in vivo. Las modificaciones del procedimiento de extracto de huevo permiten para el aislamiento de extractos de X. laevis embriones en lugar de huevos, y estos extractos de embriones son igualmente susceptibles de manipulación bioquímica 23. Durante X. laevis desarrollo, el embrión fertilizado de una sola célula (~ 1 mm de diámetro) se somete a una serie de doce divisiones celulares rápidas (etapas 1-8) para generar varios miles de 50 μm de diámetro y células más pequeñas, llegando a una etapa de desarrollo denominan la transición midblastula (MBT) o 24-26 de la etapa 8. El MBT se caracteriza por el inicio de la transcripción cigóticos, la migración celular, divisiones celulares asíncronos, la adquisición de fases Gap, y el establecimiento de tamaños de estado estable nucleares en lugar de la expansión nuclear continua como en el embrión de pre-MBT. Desde la etapa 4 a la gastrulación (etapas 10,5-12), el volumen de los núcleos individuales se reduce en más de 10 veces 11.

Aquí, el objetivo es identificar los mecanismos responsables de estas reducciones en el tamaño nuclear durante la progresión del desarrollo. El enfoque es montar primero núcleos en X. laevis huevo y el extracto de aislar esos núcleos desde el citoplasma del huevo / extracto. Estos núcleos se resuspendieron a continuación en el citoplasma de embriones en estadio de gástrula tardía. Después de un período de incubación, los núcleos de extracto de huevo se hacen más pequeños a finales de extracto de la etapa embrionaria. Pensamos que este would ser un ensayo útil para la identificación de los componentes citoplasmáticos presentes en los embriones en etapas avanzadas que contribuyen al desarrollo de escala del tamaño nuclear. Utilizando este ensayo, junto con la validación in vivo, hemos demostrado que la proteína quinasa C (PKC) contribuye a la reducción del desarrollo en el tamaño nuclear en X. laevis 23.

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Protocolo

Todos los procedimientos y estudios de Xenopus se llevaron a cabo en cumplimiento de la Guía de la NRC para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 8 ª edición. Protocolos fueron aprobados por la Universidad de Wyoming Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Aseguramiento # A-3216-01).

1. Preparación de X. Extracto de huevo laevis (adaptado de 27,28)

  1. X. primordial de mujeres laevis ranas un mínimo de tres días y un máximo de dos semanas antes de la recolección de huevos con una sola inyección de 100 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG).
  2. Un día antes del experimento, inyectar ranas cebó con 800 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) y el lugar a 16 ° C en 1 L por la rana de 1 / 3x timbres modificados de Marc (MMR). Ver Tabla 1 para todas las composiciones de amortiguamiento.
    Nota: Algunas ranas no ponen huevos o ponen huevos de mala calidad. Por lo general 2 - 3 ranas se inyectan para asegurar al menos una rana sentará suficient número de huevos de buena calidad. La rana promedio pondrá huevos suficientes para producir al menos 1 ml de extracto de huevo.
  3. Prepare 1 L 1 / 3x MMR con agua destilada desionizada fría (ddH 2 O), 500 ml de tampón B, 1 L de tampón C, 500 ml de tampón D, y 100 ml de tampón E.
  4. Transferencia puso huevos a un plato de cristalización de vidrio (150 x 75 mm). El uso de un plástico pipeta Pasteur con la punta cortada, la granja a cabo hinchados activado huevos blancos o huevos lisadas. Sólo retener los huevos con polos animales oscura distintas e iguales y polos blancos vegetales.
  5. Preparar 13 x 51 mm tubos de centrífuga con 1 ml de Tampón E suplementado con 355 mM citocalasina D añaden justo antes de usar en el paso 1.7.
  6. Dejelly y lavar los huevos.
    1. Lavar los huevos brevemente con frío 1 / 3x MMR en un vaso de precipitados de tamaño adecuado, cambiando el tampón 3 - 4 veces.
    2. Retirar las capas de la jalea de los huevos de incubación con tampón B. Esto se llevará a cualquier lugar del 3 - 10 minutos a. Como las capas de gelatina nublado se liberan del huevos, cambiar el tampón.
      Nota: Dejellying se completa cuando los huevos aparecen apretujada en la esquina del plato cuando se inclina y polos vegetales están orientados hacia abajo. Los huevos son mucho más frágiles después dejellying, por lo que no incuban los huevos con tampón B por más de lavados necesarios y posteriores deben realizarse con mucho cuidado.
    3. Lavar los huevos brevemente con 3 - 4 cambios de tampón C.
    4. Lavar los huevos brevemente con 2 cambios de tampón D.
    5. Wash huevos brevemente con 2 cambios de tampón E.
  7. Llenar los tubos de centrífuga con huevos usando una amplia pipeta de vidrio orificio o un gotero de plástico. Aspirar el exceso de tampón. Para empaquetar los huevos y eliminar la mayor cantidad de tampón como sea posible, de centrifugación en rotor de cubeta oscilante a 212 xg durante 60 seg y luego a 478 xg durante 30 seg. Aspirar el exceso de tampón.
    Nota: Es importante eliminar la mayor cantidad de tampón en exceso de lo posible en este paso para asegurar el extracto de huevo se diluye mínimamente.
  8. En un balanceo rotor cubo, ultracentrífuga a vacío durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C para aplastar los huevos abierto y se separan en diferentes capas, con el citoplasma de ser la capa de color ámbar en el medio. Retire los tubos de centrífuga y colocar inmediatamente en hielo.
  9. Recoger el extracto.
    1. El uso de una aguja de calibre 18 y una jeringa, perforar el tubo de centrífuga justo por encima de la capa pigmentada oscura en la parte inferior del tubo y eliminar la capa citoplasmática de color ámbar medio. No se debe recoger cualquiera de la capa lipídica superior. Recoger el citoplasma en un tubo de tamaño apropiado.
      Nota: Por lo general, 1 rana produce al menos 1 ml de extracto.
    2. citoplasma suplemento con 1 / 1.000 del volumen de 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 el volumen de LPC de valores, y 1/50 del volumen de 50x combinación de energías. Invierta suavemente el tubo para mezclar. No pipetear en exceso el extracto.
    3. Mantenga el extracto sobre hielo y usarlo a menos de 3 h de preparación para obtener los mejores resultados.
_TITLE "> 2. Preparación de esperma Demembranated X. laevis (adaptado de 29)

Nota: Los volúmenes se explica a continuación son para un máximo de 8 testículos.

  1. Retire 0,05% benzocaína (10% benzocaína de stock preparado en etanol y se diluyó a 0,05% en agua tanque de rana) a partir de 4 ° C y se calienta a temperatura ambiente. Anestesiar y sacrificar masculina X. laevis ranas en solución benzocaína a temperatura ambiente durante 20 - 30 min. Asegurar la muerte por la ausencia de latidos del corazón mediante el examen y la sensación de la zona del pecho, por la falta de respuesta a la estimulación mecánica, y / o por decapitación.
  2. Se practica una incisión en forma de U a lo largo del abdomen. Retire la masa de los cuerpos tubulada grasas amarillas. En la parte superior de los riñones, localizar los testículos, que son masas de color rosa pálido alrededor de 1 cm de longitud 29 de forma ovalada. Extirpar los testículos y rodar sobre papel secante para eliminar la sangre y otros tejidos.
  3. Lavar los testículos en Tampón T. Uso una mano de mortero ajustado equipado para picar testículos con 1 ml de tampónT en un tubo de 1,5 ml hasta que sea homogénea (10 golpes o más). Centrifugar 5 a 10 seg en una mini centrífuga y se recoge el sobrenadante, la eliminación de grandes piezas de tejido. Repetir la centrifugación una vez más y se recoge el sobrenadante.
  4. Transferir la solución que contiene espermatozoides a un tubo de plástico 15 ml. Aumentar el volumen a un total de 2 ml con tampón T. Se centrifuga a 1.411 xg durante 10 minutos a 16 ° C para sedimentar los espermatozoides.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 l de tampón T. Se centrifuga a 1.411 xg durante 10 minutos a 16 ° C. Repita este paso una o dos veces como sea necesario para limpiar el sedimento de glóbulos rojos y somáticas.
  6. Resuspender el precipitado en 100 l de tampón T y 300 l de tampón de S. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    Nota: Buffer S contiene lisolecitina, que es responsable de demembranation.
  7. Añadir tres volúmenes de tampón I (preparado fresco antes de su uso). Invertir el tubo exactamente una vez. Se centrifuga a 1.411 xg durante 15 minutos a 16 y# 176; C.
  8. Resuspender el precipitado en 400 l de tampón R y luego agregar un adicional de 2 ml de solución tampón R. Se centrifuga a 1.411 xg durante 15 minutos a 16 ° C.
  9. Resuspender el precipitado en 50 l de tampón T.
  10. Diluir 1 l demembranated núcleos de los espermatozoides con 9 l de tampón T. Aplicar esta dilución a un hemocitómetro. Contar el número de núcleos de los espermatozoides en forma de S-finas en una gran cuadrícula de 4 x 4, y multiplicar el resultado por 100 para obtener la concentración de la población en núcleos de los espermatozoides por l.
  11. Diluir la población de 100.000 núcleos de los espermatozoides por l con tampón T, lo que resulta en una acción de 200x. Preparar 3 - 5 ml de alícuotas. congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

3. Asamblea Nuclear

  1. Suplemento 100 l de extracto de huevo con 1,5 l 35,5 cicloheximida mM (concentración final 0,5 ~ mM), 6 l de 20x solución stock de calcio (concentración final de ~ 0,6 mM), y 0,7 l de 200x esperma (concentración final 700 ~esperma núcleos / l). Escalar el volumen de reacción hacia arriba o hacia abajo según sea necesario. Invertir o golpear suavemente para mezclar.
    Nota: Extracto de ciclado de la metafase en la interfase proporciona una plataforma más robusta y fiable para el montaje nuclear.
  2. Incubar en un baño de agua a 16 - 20 En ° C durante 90 minutos. Mezclar golpeando suavemente cada 15 minutos para asegurar núcleos permanecen suspendidas en el extracto.
  3. Monitorear el progreso del equipo nuclear a los 45 minutos mediante la preparación de una calabaza de la siguiente manera.
    1. Pipetear 2 l de extracto sobre un portaobjetos de vidrio y añadir 2 l solución núcleo.
    2. Superponer con un cubreobjetos de 22 mm 2. Imagen en un microscopio de epifluorescencia usando agua, aceite o aire 20 - 100X objetivos y un filtro DAPI.
      Nota: Los núcleos puede ser visualizada mediante formación de imágenes de campo brillante, pero son mucho más fáciles de visualizar por fluorescencia.
    3. Utilizar inmediatamente o núcleos de congelación alícuotas de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
      Nota: La adición de 4% de glicerol a la pr núcleosIOR a la congelación puede ayudar a mantener su integridad. núcleos congelados son por lo general sigue siendo viable y capaz de importación nuclear, sin embargo, el proceso de congelación puede dar lugar a núcleos frágiles interrumpidos o más estructuralmente. Los núcleos de hasta un año después de la congelación puede ser utilizado.

4. Preparación de X. laevis extracto de embrión de

  1. Inducir X. femenina laevis ranas para poner sus huevos como se describe en 1.1 y 1.2.
  2. Aislar los testículos masculinos de X. laevis ranas como se describe en 2.2. Sumergir testículos en los medios de comunicación L15 suplementado con 50 UI / ml de penicilina y estreptomicina en un vaso 35 plato x 10 mm Petri. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos semanas.
  3. Recoger y fertilizar los óvulos.
    1. Recoger los huevos recién puestos mediante la celebración de ranas sobre un plato de vidrio reutilizable Petri y promover la puesta de huevos mediante la aplicación de una presión suave a la baja de la espalda, cerca de la cloaca. Exprimir la rana demasiado fuerte puede provocar lesiones, dando lugar a un abdomen hinchado y requiring la eutanasia 29.
    2. Apuntalar el plato en un aproximado de 45 ° de ángulo, permiten que los huevos se acumulen en el borde del plato, eliminar todo el exceso de tampón, y añadir una cantidad suficiente MMR 1 / 3x para cubrir apenas los huevos. Fertilizar los óvulos dentro de los 15 min de la colección.
    3. Utilice una mano de mortero ajustado firmemente para macerar y homogeneizar 1/4 de un testículo en un tubo de 1,5 ml con 500 l de sal de alta Modificados salina de Barth (alta concentración de sal MBS). Añadir testículos macerados a los huevos y permitir que ocurra la fertilización a temperatura ambiente durante 15 a 20 min, a continuación, inundar huevos con 1 / 3x MMR.
      Nota: Eficacia de los testículos disminuye con el tiempo de almacenamiento, por lo tanto, se puede requerir más testículos tejido para una fertilización exitosa cuando se usa testículos que se han almacenado durante más de una semana.
    4. Confirmar la fertilización mediante la comprobación de la contracción del polo animal pigmentada oscura y por la rotación de los embriones con sus polos animales hacia arriba, por lo general alrededor 20 - 30 min después de la adición de teste triturados. Esperar de la primera escisión de células que se produzca dentro de los 90 min.
    5. Utilizando una amplia pipeta de vidrio orificio eliminar diligentemente muerto (blanco e hinchado o la distribución desigual de la yema de huevo y pigmento), se lisaron, o huevos no fertilizados (es decir, no escindido), ya que se inducen rápidamente la muerte en embriones de vecinos.
    6. En cualquier lugar 1-2,5 horas después de la fertilización, dejelly embriones en 2-3% de cisteína disuelven en 1/3 x MMR y se ajustaron a pH 7,9 con 10 N de KOH. Realice dos cambios de tampón que son cada uno 3 - 4 min. Es necesario lavar los embriones con 6 - 10 breves cambios de 1 / 3x MMR para eliminar todos los restos de cisteína.
      Nota: embriones dejellied tienen una membrana vitelina y no son tan frágiles como huevos dejellied.
  4. Utilizando una amplia pipeta de vidrio ánima, transferir (es decir, escindida), los embriones fecundados sanos de una placa de Petri que contiene frescos 1 / 3x MMR y permitir que se desarrollan a la etapa deseada a temperatura ambiente o, si se prefiere un desarrollo más lento, 16 ° C. Continuar para eliminar muerto o Lyembriones sed indicados por falta de primera división o la apariencia hinchada blanca.
  5. Verificar la etapa de los embriones mediante la comprobación de cierre casi completo de la blastopore y comparando a los dibujos de embriones por etapas disponibles en materiales de referencia 24.
    Nota: los embriones cultivados a 16 ° C alcanzará la etapa 11.5 - 12 de aproximadamente 12 horas.
  6. Incubar etapa 11.5 - 12 embriones en fresco 1 / 3x MMR suplementado con cicloheximida 0,5 mM durante 1 hora a RT, para detener los embriones a finales de la interfase.
  7. Transferir con el vidrio grueso calibre o pipeta de plástico de un mínimo de 15 (preferiblemente 30 o más) embriones en interfase a detener a un tubo de microcentrífuga.
    Nota: 15 embriones son suficientes para producir aproximadamente 20 l de extracto. Ampliar según sea necesario.
  8. Añadir 1 ml de tampón de lisis de huevo (ELB) suplementado con 1 l de LPC de valores. Invertir suavemente para lavar los embriones, embriones para permitir que caen hacia el fondo del tubo, y retirar el tampón. Repita este paso de lavado dos veces más.
  9. Volver a suspender los embriones en 500 l de ELB más 0,5 l de LPC de valores, 5 l de cicloheximida 19,7 mm y 5 l de 35,5 mM citocalasina D (para inhibir la polimerización de la actina). Centrifugar a 200 xg durante 1 min en una microcentrífuga de mesa.
  10. Eliminar el exceso de tampón y el uso de una mano de mortero para machacar a fondo los embriones. Centrífuga en un rotor de cubo oscilante durante 10 minutos a 10.000 x g y 16 ° C.
  11. Perforar la capa lipídica de la parte superior con una punta de pipeta de 200 l. Con una punta de pipeta de 200 l limpia, eliminar la capa de color ámbar citoplasmática medio de un tubo de tamaño adecuado.
  12. extracto de embrión de suplemento con 1/50 del volumen de 50x mezcla de energía (para proporcionar un sistema de regeneración de ATP), un centésimo del volumen de ciclohexamida 35,5 mM, 1/500 del volumen de 19,7 mM citocalasina D, y 1 / 1.000 el volumen de LPC de valores.
  13. Preparar una calabaza como se describe en 3.3 a visualizar los núcleos de embriones endógenos en el extracto.
    Nota: extracto de embriones se pueden congelar con los núcleos endógenos en este punto. Alícuota para reducir la congelación / descongelación y se almacena a -80 ° C.
  14. Para eliminar los núcleos a partir del extracto de embrión, diluir el extracto con un volumen igual de ELB que contiene 1/50 del volumen de 50x mezcla de energía, centésima del volumen de ciclohexamida 35,5 mM, 1/500 del volumen de 19,7 mM citocalasina D, y 1 / 1.000 el volumen de LPC de valores. Centrífuga en un rotor de cubo oscilante a 17.000 xg durante 15 minutos a 16 ° C.
  15. Recoger el sobrenadante con cuidado de evitar cualquier lípido que queda en la parte superior. No molestar los núcleos sedimentados en la parte inferior del tubo. Preparar una calabaza como se describe en 3.3 para asegurar que la mayoría de los núcleos se han eliminado. El uso del extracto fresco o alícuota y se almacena a -80 ° C.
  16. Para calentar inactivar extracto de embrión para los experimentos de control, de calor 30 - 100 ml de alícuotas de extracto a 56 ° C durante 30 min usando un termociclador. Dejar que el extracto inactivado por calor para volver a la temperatura ambiente antes de su uso.
_TITLE "> 5. nuclear Shrinking Ensayo e inmunofluorescencia

  1. Aislar núcleos reunidos en extracto de huevo mediante la dilución de 25 - 150 l de núcleos pre-ensamblados en 1 ml ELB en un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 1600 xg durante 3 min a 4 ° C en una microcentrífuga de mesa. Eliminar el tampón, teniendo cuidado de no perturbar el pellet frágil de los núcleos en la parte inferior del tubo.
  2. Resuspender los núcleos en un volumen de extracto de embrión igual al volumen original de extracto de huevo utilizado en 5.1. Uso ELB o extracto inactivado por calor para las reacciones de control, según proceda.
  3. Golpear suavemente el tubo para disolver el sedimento y volver a suspender los núcleos. Incubar a temperatura ambiente durante 90 min, golpeando suavemente el tubo para mezclar cada 15 - 30 min. Nota: La mayor parte de la contracción nuclear se produce en los primeros 30 minutos.
  4. Monitorear el progreso de reducción nuclear mediante la preparación de una calabaza.
    1. Pipetear 2 l de extracto sobre un portaobjetos de vidrio y añadir 2 l solución núcleo.
    2. Superposición con un 22 mm2 cubreobjetos. Imagen en un microscopio de epifluorescencia.
  5. Toca el tubo para resuspender los núcleos justo antes de la adición de 500 l de fijador que consiste en ELB, 15% de glicerol, y 2,6% de paraformaldehído. Invertir inmediatamente, y colocar el tubo en un rotador durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  6. Preparar tubos de girar mediante el equipamiento de tubos de 15 ml cristal con fondo redondo con insertos de plástico de fondo redondo (diseño y esquemas disponibles bajo petición). Añadir 5 ml de tampón de cojín nuclear. Caída de un cubreobjetos circular de 12 mm en el tubo, asegurándose de que quede plana en la parte superior de la pieza de plástico.
  7. la capa suavemente la solución que contiene núcleos fijos en la parte superior de la almohadilla nuclear utilizando una punta de pipeta de gran calibre. Centrífuga en un rotor de cubo oscilante durante 15 minutos a 1.000 xg y 16 ° C.
  8. Utilice un aspirador para eliminar todo el tampón y tire de la pieza de plástico a la parte superior del tubo. Retire el cubreobjetos con un par de pinzas finas, teniendo cuidado de observar el lado de la tapase deslizan sobre la que los núcleos se centrifugaron. Post-fix en metanol frío (almacenado a -20 ° C) durante 5 min a TA.
  9. Transferir el lado núcleo cubreobjetos arriba sobre una lámina de película plástica de parafina que recubre una gran placa de Petri de plástico. Coloque toallitas desechables húmedas a lo largo del lado del plato para evitar la deshidratación.
  10. Rehidratar núcleos en el cubreobjetos con 500 l de PBS-NP40 (1x PBS más 0,1% de NP40) y aspirado después de 5 a 10 seg.
  11. capa cuidadosamente 75 l de PBS-3% albúmina de suero bovino (BSA) en el cubreobjetos. Permitir bloquear 1 hr a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
  12. Retirar la solución de bloqueo, y se incuba con el anticuerpo primario (por ejemplo, mAb414 contra el complejo del poro nuclear, 1: 1000) diluido en PBS-BSA al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Lavar con cinco cambios inmediatos de PBS-NP40.
  13. Incubar con anticuerpo secundario diluido en PBS-BSA al 3% durante 1 hora a RT. Lavar con cinco cambios inmediatos de PBS-NP40.
  14. Incubarcon 10 mg / ml Hoechst diluido en PBS-BSA al 3% durante 5 min a RT. Lavar cinco veces con PBS-NP40. Eliminar todo el exceso de tampón.
  15. Montar el cubreobjetos sobre un portaobjetos con medio de montaje 5 l antifade. Sellar con esmalte de uñas transparente. Imagen inmediatamente utilizando un microscopio de epifluorescencia con 20 - 100x objetivos o se almacena a 4 ° C para obtener imágenes más tarde.
    Nota: Realizar la cuantificación como se ha descrito previamente 23.

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Resultados

Asamblea de los núcleos en extracto de huevo

Los primeros pasos de este protocolo son para preparar X. extracto de huevo laevis (Protocolo 1) y núcleos de los espermatozoides demembranated (Protocolo 2). Estos reactivos se utilizan para ensamblar núcleos de novo (Protocolo 3). La figura 1 muestra algunos datos representativos. La adición de calcio conduce el extracto...

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Discusión

Aquí se presenta un método novedoso para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear durante el desarrollo de X. laevis . La progresión del desarrollo se asocia con cambios dramáticos en la fisiología celular, el metabolismo, las tasas de división y la migración, así como alteraciones en el tamaño de las células y las estructuras intracelulares. Estos procesos variados son complejos y esenciales, por lo que es difícil estudiar solo uno de estos aspectos del desarrollo en un entorno in vivo ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los miembros de los laboratorios Levy y Gatlin, así como colegas del Departamento de Biología Molecular, ofrecieron consejos útiles y debates. Rebecca Heald brindó apoyo en las primeras etapas del desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por los NIH/NIGMS (R15GM106318) y la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-15-035-01-DDC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor 568 Burro anti-ratón Sondas moleculares IgGA10037
Sal disódica ATPSigma AldrichA2383
BenzocaínaSigma AldrichE1501
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA3059
CaCl2Sigma AldrichC3306
CentrífugaBeckmanJ2-21M
Rotor centrífugoBeckmanJS 13.1
quimostatinaSigma AldrichC7268
fosfato de creatina disódicoCalbiochem2380
cicloheximidaSigma AldrichC6255
citocalasina DSigma AldrichC8273
desechable toallitas (kimwipes)Sigma AldrichZ188956
L-cisteínaSigma AldrichW326306
EGTASigma AldrichE4378
FormaldehídoSigma AldrichF8775
Plato de cristal de vidrio (150 x 75 mm)VWR89090-662
GlicerolMacron5094-16
HEPESSigma AldrichH4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 triclorhidrato SigmaAldrichB2261
HCG - Gonadotropina coriónica humana Prospechor-250-c
L15 MediaSigma AldrichL4386
leupeptinaSigma AldrichL2884
LysolecithinSigma AldrichL1381
mAb414Abcamab24609
MgCl2EMDMX0045-2
MgSO4 Sigma AldrichM9397
MaltosaSigma AldrichM5885
NP40BDH56009
de la Microscopía Electrónicade Paraformaldehído15710
Penicilina + EstreptomicinaSigma AldrichPp0781
pepstatinaSigma AldrichP5318
PIPASSigma AldrichP6757
Película de parafina plástica (parafilm)Sigma AldrichP7793
KClSigma AldrichP9541
KH2PO4Mallinckrodt70100
KOHBaker5 3140
PMSG - Suero de yegua embarazada GonadotropinProspechor-272-a
NaClSigma AldrichS3014
NaHCO3FisherBP328
Na2HPO4EMDSX0720-1
NaOHEMDSX0590
MortleThomas Scientific3411D56
Tubos de vidrio de fondo redondo, 15 mlCorex8441
Anticuerpo secundario (Alexa Fluor 568 burro anti-ratón IgG)ThermoFisherA10037
sacarosaCalbiochem8550
termocicladorBio-RadT100
UltracentrífugaBeckmanL8-80M
Rotor ultracentrífugaBeckmanSW 50.1
Vectashield (medio de montaje anti-decoloración)VectorH-1000
Ciencias

Referencias

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