Los mecanismos de escalamiento celular e intracelular siguen siendo esquivos. El uso de extractos de embriones de Xenopus se ha vuelto cada vez más común para dilucidar los mecanismos de regulación del tamaño de los orgánulos. Este método describe la preparación de extractos embrionarios y un nuevo ensayo de escalamiento nuclear a través del cual se pueden identificar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un ensayo libre de células Utilizando
En este artículo
Resumen
Resumen
Una pregunta fundamental en biología celular es cómo se regulan los tamaños de células y orgánulos. Durante mucho tiempo se ha reconocido que el tamaño del núcleo escalas generalmente con el tamaño de la celda, en particular durante la embriogénesis cuando se producen reducciones dramáticas en tanto celular y tamaños nucleares. Mecanismos de regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocida y puede ser relevante para el cáncer, donde el tamaño nuclear alterada es un parámetro clave de diagnóstico y pronóstico. En vivo para la identificación de los reguladores nucleares de tamaño se complica por la naturaleza esencial y compleja de la función nuclear. El enfoque in vitro descrito aquí para estudiar el control del tamaño nuclear se aprovecha de las reducciones normales en tamaño nuclear que se producen durante el desarrollo de Xenopus laevis. En primer lugar, los núcleos se ensamblan en X. laevis extracto de huevo. A continuación, estos núcleos se aíslan y se resuspendieron en el citoplasma de embriones de etapa tardía. Después de un 30 - 90 min período de incubación, la superficie nucleardisminuye en 20 a 60%, proporcionando un ensayo útil para identificar los componentes citoplasmáticos presentes en embriones de etapa tardía que contribuyen al desarrollo de escala tamaño nuclear. Una ventaja importante de este enfoque es la facilidad relativa con la que los extractos de huevo y embrión puede ser bioquímicamente manipulados, lo que permite la identificación de nuevas proteínas y actividades que regulan el tamaño nuclear. Como con cualquier enfoque en vitro, la validación de los resultados en un sistema in vivo es importante, y la microinyección de X. laevis embriones es particularmente apropiado para estos estudios.
Introducción
Los tamaños de los orgánulos celulares típicamente escala con el tamaño de la célula, y esto ha sido quizás mejor documentado para el escalado de tamaño nuclear con tamaño de celda 1-10. Esto es particularmente cierto durante la embriogénesis y la diferenciación celular, cuando reducciones dramáticas en tanto celular y tamaño nuclear se observan a menudo 11,12. Además, alterado tamaño nuclear es un parámetro clave en el diagnóstico de cáncer y el pronóstico 13-17. Mecanismos que contribuyen a la regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocidos, en parte debido a la complejidad y la naturaleza esencial de la estructura y la....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos y estudios de Xenopus se llevaron a cabo en cumplimiento de la Guía de la NRC para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 8 ª edición. Protocolos fueron aprobados por la Universidad de Wyoming Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Aseguramiento # A-3216-01).
1. Preparación de X. Extracto de huevo laevis (adaptado de 27,28)
- X. primordial de mujeres laevis ranas un mínimo de tres días y un máximo de dos semanas antes de la recolección de huevos con una sola inyección de 100 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG).
- Un día antes del experimen....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Asamblea de los núcleos en extracto de huevo
Los primeros pasos de este protocolo son para preparar X. extracto de huevo laevis (Protocolo 1) y núcleos de los espermatozoides demembranated (Protocolo 2). Estos reactivos se utilizan para ensamblar núcleos de novo (Protocolo 3). La figura 1 muestra algunos datos representativos. La adición de calcio conduce el extracto.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí se presenta un método novedoso para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear durante el desarrollo de X. laevis . La progresión del desarrollo se asocia con cambios dramáticos en la fisiología celular, el metabolismo, las tasas de división y la migración, así como alteraciones en el tamaño de las células y las estructuras intracelulares. Estos procesos variados son complejos y esenciales, por lo que es difícil estudiar solo uno de estos aspectos del desarrollo en un entorno in vivo .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los miembros de los laboratorios Levy y Gatlin, así como colegas del Departamento de Biología Molecular, ofrecieron consejos útiles y debates. Rebecca Heald brindó apoyo en las primeras etapas del desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por los NIH/NIGMS (R15GM106318) y la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-15-035-01-DDC).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 568 Burro anti-ratón Sondas moleculares IgG | A10037 | ||
| Sal disódica ATP | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaína | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrífuga | Beckman | J2-21M | |
| Rotor centrífugo | Beckman | JS 13.1 | |
| quimostatina | Sigma Aldrich | C7268 | |
| fosfato de creatina disódico | Calbiochem | 2380 | |
| cicloheximida | Sigma Aldrich | C6255 | |
| citocalasina D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| desechable toallitas (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cisteína | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehído | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Plato de cristal de vidrio (150 x 75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glicerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst - bisBenzimide H 33342 triclorhidrato Sigma | Aldrich | B2261 | |
| HCG - Gonadotropina coriónica humana | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptina | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltosa | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| de la Microscopía Electrónica | de Paraformaldehído | 15710 | |
| Penicilina + Estreptomicina | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatina | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPAS | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Película de parafina plástica (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG - Suero de yegua embarazada Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Mortle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Tubos de vidrio de fondo redondo, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Anticuerpo secundario (Alexa Fluor 568 burro anti-ratón IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sacarosa | Calbiochem | 8550 | |
| termociclador | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrífuga | Beckman | L8-80M | |
| Rotor ultracentrífuga | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (medio de montaje anti-decoloración) | Vector | H-1000 |
Referencias
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
