Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

Resumen

Presentamos un protocolo rápido y flexible para un sistema de expresión in vivo basado en un solo receptor de células T (TCR) retroviral. Los vectores retrovirales se utilizan para transducir células progenitoras de la médula ósea con el fin de estudiar el desarrollo y la función de las células T in vivo como alternativa a los ratones transgénicos TCR.

Resumen

señalización del receptor de células T (TCR) es esencial en el desarrollo y diferenciación de las células T en el timo y la periferia, respectivamente. La amplia gama de TCRs dificulta el estudio de una respuesta antigénica específica. Por lo tanto, se hicieron ratones transgénicos TCR para estudiar la selección positiva y negativa en el timo, así como la activación, proliferación y tolerancia de las células T periféricas. Sin embargo, se han generado relativamente pocos ratones transgénicos TCR específicos para un antígeno determinado. Por lo tanto, han faltado estudios que involucren TCRs de diferentes afinidades por el mismo péptido antigénico. La generación de una nueva línea transgénica TCR puede tardar seis o más meses. Además, cualquier retrocruzamiento específico puede tardar seis meses adicionales. Con el fin de permitir una generación y cribado más rápido de múltiples TCRs, se estableció un protocolo para la transducción retroviral de médula ósea con expresión estequiométrica de las cadenas TCRα y TCRβ y la generación de ratones retrogénicos. Cada ratón retrogénico es esencialmente un fundador, lo que prácticamente niega un efecto fundador, mientras que el tiempo para generar un TCR retrogénico se reduce de seis meses a aproximadamente seis semanas. Aquí presentamos una alternativa rápida y flexible a los ratones transgénicos TCR que se puede expresar en cualquier fondo elegido con cualquier TCR en particular.

Introducción

Receptor de células T (TCR) repertorio de los seres humanos y los ratones se ha estimado en 1 x 10 ⁸ y 2 x 10 ⁶ TCR únicos respectivamente ^1,2. Esta gran diversidad permite a las células T para reconocer una amplia gama de epítopos de antígenos derivados de péptidos propios, así como de los agentes patógenos presentados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células presentadoras de antígeno (APCs). Las diferencias sutiles en las interacciones de los TCR con los complejos de péptido-MHC únicas dictan si una célula T se someterá a la apoptosis, anergia, activación, diferenciación, la producción de citoquinas o....

Protocolo

Declaración de Ética: Se hace todo lo posible para mantener el malestar animal o el estrés al mínimo durante la irradiación y la vena de la cola inyecciones. Los ratones se utilizan como fuente de células en estos experimentos; como tal, no existen procedimientos ni manipulaciones, aparte de la eutanasia. Los ratones se sacrificaron mediante inhalación de _CO2, seguido por dislocación cervical para confirmar la muerte. Este procedimiento es consistente con las recomendaciones del Grupo sobre la eutanasia de la American Veterinary Medical Association.

1. Prepare retroviral Construct

1. Sub-clon cadenas del receptor de células....

Resultados

Bone eficacia de transducción ósea se comprueba en el paso 13.3 del protocolo antes de inyectar la médula ósea al iv vena de la cola en el representante de la médula ósea transducción figura (Figura 1A), se añadió aproximadamente 10 l de la médula ósea cosechada de 100 l de PBS y se analizaron para la expresión ametrina. En general, el porcentaje de células positivas fluorescentes es entre 25% y 70%, dependiendo de la construcción y el título retroviral. Después de la in.......

Discusión

En el protocolo, detallamos varios pasos críticos para garantizar la salud de la médula ósea óptima, la eficacia de transducción y reconstitución. Primer paso fundamental es la generación y el mantenimiento adecuado de las células productoras viral GP + E86. Utilice líneas celulares productoras de paso de los primeros y mantener a 80% de confluencia o inferior antes de su uso. Al hacer células productoras viral GP + E86 frescos, asegurarse de que las células 293T son principios de paso y creciendo en cultivo durante 24 .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM, glucosa alta + glutamina	Corning Cellgro	10-013-CV	Modificación de Dulbecco del medio de Eagle con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µ m filtro de jeringa	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Estéril filtrado en dH2O
Ciprofloxacina	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracilo (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Piruvato de sodio	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM Aminoácidos no esenciales	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solución	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoetanol	Gibco de Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamina	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm placas de cultivo de tejidos	Greiner Bio-one	639160
Tisue placa plana de 6 pocillos tratada con cultivo	Greiner Bio-one	657160
70 µ m coladores de células de nylon	Falcon	352350
Ratón IL-3	Invitrogen	PMC0033
Humano IL-6	Invitrogen
Factor de Células Madre de Ratón	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
Tampón HANKS	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Jeringa	BD	300912
BD 1 ml Jeringa	BD	309659
27 G x 1/2 BD Aguja de deslizamiento de precisión	BD
Aguja deslizante de precisión de 30 G x 1/2 BD	BD 305106

PHC0063305109