La investigación de las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus anfitriones es un área importante de la investigación biológica. A continuación, describimos las técnicas necesarias para medir la translocación efector por Coxiella burnetii durante siRNA silenciamiento de genes utilizando sustrato Blam.
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Artículo de método
La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación
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Resumen
Resumen
Coxiella burnetii, el agente causante de la fiebre Q, es un patógeno intracelular que se basa en un punto IV / ICM sistema de secreción tipo para establecer un nicho replicativo. Una cohorte de efectores se translocan a través de este sistema en la célula huésped a manipular los procesos de acogida y permitir el establecimiento de una vacuola lisosoma derivado único para la replicación. El método que aquí se presenta implica la combinación de dos técnicas bien establecidas: el silenciamiento de genes específico utilizando siRNA y la medición de la translocación efector utilizando un sustrato a base de FRET que se basa en la actividad β-lactamasa. La aplicación de estos dos enfoques, podemos empezar a entender el papel de los factores del huésped en la función del sistema de secreción bacteriana y translocación efector. En este estudio se examinó el papel de Rab5a y Rab7A, ambos importantes reguladores del tráfico de la vía endocítica. Demostramos que el silenciamiento de la expresión de cualquiera de los resultados de proteínas en una disminución de la translocatio efectorn eficiencia. Estos métodos pueden ser fácilmente modificados para examinar otros patógenos intracelulares y extracelulares que también utilizan sistemas de secreción. De esta manera, una visión global de los factores del huésped implicados en la translocación bacteriana efector puede ser revelada.
Introducción
Coxiella burnetii es un patógeno intracelular único que causa la fiebre Q infección humana zoonótica. Esta enfermedad está asociada con un amplio espectro de manifestaciones clínicas que se extienden desde la seroconversión asintomática a la infección crónica que amenaza la vida que a menudo se manifiesta como endocarditis años después de la exposición 1. La infección humana se produce principalmente a través de la inhalación de aerosoles contaminados con rumiantes el principal reservorio de la infección, en particular, las vacas lecheras, ovejas y cabras. Aunque la infección por Coxiella en estos animales suele ser subclínica, la infecci....
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Protocolo
Nota: Todos los procedimientos que implican el crecimiento o la manipulación de Coxiella burnetii en RSA439 NMII deben llevarse a cabo en un Contención Nivel Físico 2 Laboratorio y dentro de una cabina de seguridad biológica en el cumplimiento de las directrices locales. Un diagrama esquemático del flujo de trabajo de la transfección y el ensayo de translocación inversa se describe a continuación se muestra en la Figura 2.
1. Preparación de C. burnetii Cultura Expresando CBU0077 fundida a ß-lactamasa (pBlaM-CBU0077) (día 1)
- Preparar 1X ACCM-2 6:
- Combinar los componentes e....
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Resultados
Para este estudio, la C. Se seleccionó la cepa burnetii pBlaM-CBU0077 como CBU0077 se ha demostrado previamente para ser un efector translocado del sistema de secreción de Coxiella Dot / ICM 17. Antes de la infección, el número total de genomas / ml en los siete día C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 se enumeró utilizando qPCR. La figura 4 muestra un ejemplo del ciclo umbral valores (Ct) que se espera de ambos patron.......
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Discusión
sistemas de secreción, y las proteínas efectoras bacterianas estos sistemas de transporte en el citoplasma de células huésped, son un importante componente de la virulencia que muchas bacterias patógenas utilizan para establecer una infección dentro de nichos replicativos únicas. El foco de muchos grupos de investigación ha sido investigar la interacción entre los efectores bacterianos y las proteínas del huésped y la influencia que estos tienen efectores en las vías celulares del huésped. investigación muy limitado, en.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (NHMRC) (ID de subvención 1062383 y 1063646) otorgadas a HJN. EAL cuenta con el apoyo de un Premio Australiano de Posgrado.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Ácido cítrico | Sigma | C0759 | ACCM-2 componente medio |
| Citrato de sodio | Sigma | S4641 | ACCM-2 componente medio |
| Fosfato de potasio | Sigma | 60218 | ACCM-2 componente medio |
| Cloruro de magnesio | Calbiochem | 442611 | medio ACCM-2 componente |
| Cloruro de calcio | Sigma | C5080 | ACCM-2 componente medio |
| Sulfato de hierro | Fisher | S93248 | ACCM-2 componente medio |
| Cloruro de sodio | Sigma | S9625 | ACCM-2 componente |
| medio L-cisteína | Sigma | C6852 | ACCM-2 componente medio |
| Bacto-neopeptona | BD | 211681 | medio ACCM-2 componente |
| Ácidos Casamino | Fisher | BP1424 | ACCM-2 componente medio |
| Metil beta ciclodextrina | Sigma | C4555 | ACCM-2 componente medio |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 componente medio |
| Cloranfenicol | Sigma | C0378 | Para cultivo bacteriano |
| ON-TARGETplus Control no focalizado Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Control no dirigido |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon | M-003290-01-005 | Causa la muerte celular; medida de la eficiencia de la transfección | |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5x tampón de siRNA | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Utilice agua estéril sin RNasa para diluir 5x tampón de siRNA a 1x tampón de siRNA |
| DharmaFECT-1 Reactivo de transfección Dharmacon | T-2001-01 | Para transfección | |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Medio de suero reducido utilizado para la transfección |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | Para cultivo celular e infección |
| Suero fetal de ternera inactivado por calor (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Puede utilizar un producto equivalente alternativo |
| DMSO | Sigma | D8418 | Para el almacenamiento de la cepa de Coxiella |
| PBS | Para cultivo celular | ||
| 0,05% Tripsina + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | Para cultivo celular |
| dH2O | Para la dilución de muestras y estándares para qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Puede usar un producto equivalente alternativo para extraer gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Puede usar un producto de mezcla maestra de qPCR equivalente alternativo para la reacción de qPCR |
| LiveBLAzer FRET-B/G Kit de carga con CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | Para la medición de la translocación mediante fluorescencia y generación de la solución de carga 6X (contiene solución A, B, C y DMSO) |
| Hidróxido de sodio | Merck | 106469 | Componente de la solución Probenicida |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma | 71505 | Componente de la solución probenicida |
| Ortofosfato de hidrógeno di-Sódico | Merck | 106586 | Solución Probenicida componente |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Componente de solución probenicida |
| DRAQ5 Solución de sonda fluorescente (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Tinción de núcleos para determinar la viabilidad celular. Use 1:4000 diluido en PBS. |
| Solución de PFA (paraformaldehído) al 4% en PBS | Sigma | P6148 | Solución de fijación para células HeLa 229 |
| Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2 con tapón ventilado | Corning | 430639 | Para el crecimiento de la cepa bacteriana |
| 96 Well Flat Clear bottom Poliestireno negro Tratado con TC, envueltos individualmente, con tapa, estériles | Corning | 3603 | |
| Matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2 con tapón ventilado | Corning | 430641 Para el crecimiento de células HeLa 229 | |
| Matraz de cultivo de tejidos de 175 cm2 con tapón ventilado | Corning | 431080 | Para el crecimiento de células HeLa 229 |
| Hemocitómetro | Para la cuantificación de células HeLa 229 Placas de | ||
| PCR Tear-A-Way 96 Well | 4titude 4titude 4ti-0750 | /TA | Para qPCR reacción |
| Cadena de 8 tapas, | plana Sarstedt | 65.989.002 | Para qPCR reacción |
| Nombre | Empresa | >Número de catálogo | >Comentarios |
| >Equipo | |||
| sobremesa | |||
| Vórtice | |||
| Mezclador | |||
| Centrífuga | Eppendorf | 5810 R | Para la peletización de cultivos bacterianos |
| Nanodrop | Para la cuantificación de ADNg | ||
| Mx3005P Máquina QPCR | Aligent Technologies | 401456 | Para la cuantificación de genomas de Coxiella en cultivo de 7 días |
| Microplaca ClarioSTAR lector | BMG LabTech | Para la medición de fluorescencia |
Referencias
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al.
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Reimpresiones y permisos
