La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación Coxiella burnetii Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii es un patógeno intracelular único que causa la fiebre Q infección humana zoonótica. Esta enfermedad está asociada con un amplio espectro de manifestaciones clínicas que se extienden desde la seroconversión asintomática a la infección crónica que amenaza la vida que a menudo se manifiesta como endocarditis años después de la exposición ^1. La infección humana se produce principalmente a través de la inhalación de aerosoles contaminados con rumiantes el principal reservorio de la infección, en particular, las vacas lecheras, ovejas y cabras. Aunque la infección por Coxiella en estos animales suele ser subclínica, la infección puede desencadenar aborto y la carga bacteriana considerable dentro del fluido de parto y la placenta puede contaminar el medio ambiente local ^1. Un ejemplo de la enorme carga de dicha contaminación puede tener sobre la salud pública y la industria de la agricultura se observó recientemente en el brote de fiebre Q que se produjo en los Países Bajos ^2. Entre 2007 y2010, más de 4.000 casos humanos de fiebre Q fueron diagnosticados y este brote se vinculó a la contaminación significativa de granjas de cabras ^3. Además, Coxiella es un arma biológica potencial, según la clasificación de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, debido a la estabilidad ambiental de las bacterias y de baja dosis infecciosa necesaria para causar morbilidad y mortalidad ⁴ grave.

Coxiella existe en dos fases: Fase I organismos, aislados de fuentes naturales, son extremadamente virulenta y Fase II son organismos altamente atenuados in vivo. Por ejemplo, después de varios pasajes en vitro de Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismos, se producen las bacterias de fase II que contiene una deleción cromosómica irreversible que resulta en lipopolisacárido truncada (LPS) ^5. Esta cepa, C. burnetii NMII, es fenotípicamente similar a la Fase I en modelos de cultivo de tejidos y proporciona un modo más segurol para los investigadores estudiar la patogénesis Coxiella en laboratorios ^5. En los últimos años varios avances han avanzado rápidamente en el campo de la genética Coxiella. En particular, el desarrollo de los medios axénicos (acidifica medio cisteína citrato - ACCM-2) ha permitido el crecimiento de células libres de Coxiella en tanto líquidos como sólidos en medios de ^6,7. Esto dio lugar a mejoras directas de herramientas genéticas disponibles para Coxiella incluyendo un sistema de expresión génica inducible, vectores lanzadera y sistemas de transposón azar ^8-11. Más recientemente, dos métodos para la inactivación génica dirigida también se han desarrollado, allanando el camino para el examen de los candidatos de genes de virulencia específicos ^12.

Después de la internalización por los macrófagos alveolares, Coxiella replica en un número elevado dentro de un compartimiento unido a la membrana denominado el Coxiella- contiene vacuolas (CCV). El CCV requiere el tráfico endocítica anfitrión THendosomas tempranos y tardíos en bruto hasta que madura en un orgánulo lisosoma derivados ^13. A lo largo de este proceso, el CCV adquiere factores del huésped que, o bien aparecen de forma transitoria o permanecen asociados con la vacuola, incluyendo, pero no limitado a, Rab5, Rab7, CD63 y el indicador LAMP-1 ^13-15. La replicación de Coxiella dentro de las células huésped es totalmente dependiente de un tipo de sistema completamente funcional Dot / ICM IVB secreción (T4SS) ^8,16,17. Este sistema de secreción es una estructura multi-proteína ancestralmente relacionada con los sistemas de conjugación y se extiende por ambas membranas bacterianas y vacuolar para entregar proteínas bacterianas, denominado efectores, en el citoplasma de acogida ^18. El Coxiella T4SS es funcionalmente muy similar a la del sistema de secreción bien caracterizado Tipo IVB Dot / Icm de Legionella pneumophila ^19,20. Curiosamente, la activación de la translocación efector T4SS y posterior no se produce hasta Coxiella alcanza el lisosoma derivado de ácidoorgánulo, aproximadamente 8 horas después de la infección ^17,21. Hasta la fecha, más de 130 efectores Dot / ICM se han identificado ^9,17,22-24. Muchos de estos efectores probablemente juegan un papel importante durante la replicación de Coxiella dentro de las células huésped; Sin embargo, sólo unos pocos efectores se han caracterizado funcionalmente ^25-29.

En este estudio utilizamos un ensayo de translocación basado en la fluorescencia que se basa en la escisión del sustrato CCF2-AM FRET (en lo sucesivo, el sustrato BlaM) a través de la actividad de β-lactamasa en el citoplasma de la célula huésped (Figura 1). El gen de interés se fusiona con TEM-1 β-lactamasa (BlaM) en un plásmido reportero que proporciona la expresión constitutiva. El sustrato BlaM se compone de dos fluoróforos (cumarina y fluoresceína) que forman un par de FRET. La excitación de los resultados de la cumarina en FRET de la fluoresceína y la emisión de fluorescencia verde en la ausencia de la translocación efector; sin embargo, si el Blaproteína de fusión M-efector se transloca al citoplasma de acogida, la resultante β-lactamasa escinde actividad del anillo β-lactámico del sustrato Blam, la separación de la producción de la emisión de fluorescencia azul después de la excitación par de FRET. Este ensayo de translocación se ha probado como un enfoque para identificar las proteínas efectoras de una gama de diferentes bacterias intracelulares y extracelulares, incluyendo C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, E. enteropatógena coli, Salmonella y Brucella ^17,30-35.

Para determinar el papel de los factores del huésped específicas sobre Coxiella translocación efector utilizamos un método bien establecido para el silenciamiento de genes conocido como interferencia de ARN, en particular los pequeños ARN de interferencia (siRNA). Originalmente identificado en Caenorhabditis elegans, la interferencia de ARN es un proceso celular endógeno conservada utilizado para DEFE innataNSE contra los virus, así como la regulación de genes ^36,37. Después de la unión de la secuencia específica de siRNA, la degradación de mRNA se produce a través de RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) que resulta en el silenciamiento de genes específico o desmontables ^38. En este estudio, siRNA se utiliza para apuntar dos proteínas del huésped, y Rab5a Rab7A, que son importantes reguladores de la vía endocítica. El impacto de silenciar Rab5a y Rab7A sobre la traslocación efector se determinó usando C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 fue seleccionado como se ha demostrado previamente para ser trasladadas por el sistema de secreción Dot / ICM de Coxiella ^17.

Utilizando tanto siRNA silenciamiento de los genes y el ensayo de translocación fluorescencebased descrito aquí, estamos empezando a establecer una función de los factores del huésped en la translocación de las proteínas efectoras por Coxiella. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de bacterias intracelulares y extracelulares que poseen secretio similaresn sistemas responsables de la translocación de las proteínas efectoras.

Nota: Todos los procedimientos que implican el crecimiento o la manipulación de Coxiella burnetii en RSA439 NMII deben llevarse a cabo en un Contención Nivel Físico 2 Laboratorio y dentro de una cabina de seguridad biológica en el cumplimiento de las directrices locales. Un diagrama esquemático del flujo de trabajo de la transfección y el ensayo de translocación inversa se ​​describe a continuación se muestra en la Figura 2.

1. Preparación de C. burnetii Cultura Expresando CBU0077 fundida a ß-lactamasa (pBlaM-CBU0077) (día 1)

1. Preparar 1X ACCM-2 ^6:
   1. Combinar los componentes enumerados en la Tabla 1. Ajustar el pH a 4,75 con NaOH 6 M y esterilizar filtro (No esterilizar en autoclave). ACCM-2 es estable durante aproximadamente tres semanas si se almacena a 4 ° C.
2. Generar C. poblaciones burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Infect HeLa 229 células con el C. cepa burnetii llevar pBlaM-CBU0077 y el paso hasta el gran vacuolES se observan en la mayoría de las células.
      1. Hacer crecer la C. cepa burnetii llevar pBlaM-CBU0077 en 20 ml ACCM-2 que contiene 3 mg de cloranfenicol / ml en un frasco de cultivo de 75 cm ² de tejido con tapa ventilada durante 7 días a 37 ° C en CO2 al _5%, 2,5% de _O2.
      2. Centrifugar la C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15.000 × g durante 15 min a TA.
      3. Vuelva a suspender el sedimento en 20 ml de DMEM + 10% de suero de ternera fetal (FCS) + 3 g / ml de cloranfenicol (medio de mantenimiento). Retire el medio de un 50% de confluencia matraz de 75 ^cm2 de células HeLa 229. Añadir re-suspendido C. burnetii a células HeLa 229. Incubar durante 2 días a 37 ° C en 5% de CO ₂ para permitir la infección de células HeLa 229 de establecer.
      4. Dividir en células matraz de 175 ^cm2 de cultivo de tejidos.
         1. Retire el medio de la 75 cm ² matraz y se lava la monocapa dos veces con 10 ml de PBS precalentado.
         2. Añadir 1 ml de of 0,05% de células de solución y lugar de tripsina-EDTA a 37 ° C + 5% de CO ₂ durante 3 - 5 min a separar las células.
         3. células Vuelva a suspender en 10 ml de medio de mantenimiento. Añadir 2 ml de las células resuspendidas en un 175 cm ² matraz que contenía 38 ml de medio de mantenimiento.
         4. Incubar a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 3 - 5 días hasta que se alcanzó el 100% de confluencia y se observan grandes vacuolas.
   2. Recoger el sobrenadante de 175 cm ² frasco, añadir 10 ml dH ₂ O para cubrir las células HeLa infectadas 229 y se incuba durante 15 min para lisar las células infectadas.
   3. Combinar sobrenadante y las células lisadas y pellet a 15.000 × g durante 15 min a TA.
   4. Vuelva a suspender sedimento en 10 ml _{de dH2O} lisar células adicionales por los que pasa repetidamente la re-suspensión a través de una aguja 23G unida a una jeringa 10 ml, al menos 20 veces. Pellet a 500 xg durante 5 min para eliminar restos celulares.
   <li> Eliminar el sobrenadante y el sedimento a 15.000 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente para recoger C. burnetii.
3. Volver a suspender C. burnetii en DMEM + 10% de FCS y cuantificar el número de bacterias como por 4. Diluir a 1 × 10 ⁹ genomas / ml usando + 10% + 10% FCS DMEM sulfóxido de dimetilo (DMSO), alícuota de 50 acciones l en tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C.

2. invertir transfección de siRNA y siembra de células HeLa 229 (día 4)

1. Cuando se utiliza el siRNA experimental por primera vez prepararel siRNA como sigue:
   1. Centrifugar brevemente el siRNA se liofilizó para asegurarse de que el sedimento siRNA se recoge en la parte inferior del tubo.
   2. Vuelva a suspender el siRNA se sedimentaron a una concentración madre final de 20 mM pipeteando el volumen apropiado de tampón 1x siRNA (Tabla 2).
   3. Pipetear la solución hacia arriba y abajo 3 - 5 veces para mezclar y colocar en un mezclador orbital durante 30 min a TA, invirtiendo el tubo cada 5 - 10 min.
   4. Centrifugar brevemente el tubo para asegurar el siRNA se recoge en la parte inferior del tubo.
   5. Alícuota del ARNsi en 50 ml de alícuotas en tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C hasta su utilización.
   6. Para generar 1 mM concentración de ARNip de trabajo, pipeta de 950 l de tampón 1X siRNA en un 50 l alícuota de valores (20 M) cuando sea necesario. Nota: Esta concentración de trabajo 1 M se puede congelar-descongelado varias veces para transfecciones repetidas.
2. Coloque DMEM + 10% de FCS,; 0,05% de tripsina-EDTA y PBS en un baño de 37 ° C el agua (o equivalente) durante 30 min se caliente antes de su uso.
3. Preparación de componentes de transfección:
   Nota: El siguiente protocolo se ha optimizado para HeLa 229 células en una microplaca de 96 pocillos con paredes negras y plana, fondo transparente. Optimización de la cantidad de reactivo de transfección, la concentración de siRNA y siembra densidad de las células puede ser necesario para diferentes líneas celulares.
   1. Para cada pocillo, utilice 0,1 reactivo de transfección l, 15,9 l medio de suero reducido (medio esencial mínimo utilizados para transfecciones, consulte la Tabla de Materiales) y 4 l de 1 M siRNA (resultando en una concentración final del siRNA 40 nM). Utilice tubos de microcentrífuga separados para OTP, Plk1, Rab5a y Rab7A. Medir cada condición de ensayo por triplicado. Un ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos se muestra en la Figura 3.
      Nota: Este protocolo incorpora el uso de dos controles: OTP y la PLK1. OTP escompuesto de cuatro siRNA agrupado que han sido optimizados para reducir los efectos fuera de objetivo y por lo tanto OTP se utiliza como control negativo, no la focalización. Revueltos siRNA también podría ser utilizado como un control negativo. La pérdida de expresión de PLK1 resulta en muerte celular extensa en un número de líneas de células mediante la inducción de las vías de pro-apoptóticas y por lo tanto la PLK1 siRNA se utiliza como control positivo para la transfección en la muerte celular se correlaciona con la eficacia de transfección.
      1. Para cada transfección siRNA experimental, se combinan 0,4 l de reactivo de transfección y 63,6 l medio de suero reducido en un tubo de microcentrífuga individuales. Vortex todos los tubos de microcentrífuga y permiten que los componentes de complejo de 5 min a TA.
      2. Añadir 16μl de cada siRNA experimental para los tubos de microcentrífuga correspondientes que contienen el complejo de transfección. Vortex y se incuba durante 20 min a TA. Nota: Es importante que no exceda los 30 minutos, ya que la eficacia de transfección disminuirá.
4. Durante la 20 min incubation (2.3.1.2) añadir 20 l de reactivo de transfección + medio de suero reducido + siRNA mezcla en los pocillos apropiados de una bandeja estéril negro, plano fondo claro de 96 pocillos.
5. Tan pronto como el período de incubación de 20 min se ha completado, las semillas HeLa 229 células a una densidad de 3,92 × 10 ³ células / pocillo.
   1. Cosecha HeLa 229 células de un confluente o sub-confluente 75 cm matraz de cultivo de tejido ² en DMEM precalentado + 10% de FCS y volver a suspender las células a una densidad final de 4,9 × 10 ⁴ células / ml como por métodos estándar. Para asegurar la eficiencia de la transfección no se vea comprometida, preparar células durante el período de incubación de 20 min (2.3.1.2).
      1. Lavar la monocapa de células HeLa 229 células dos veces con 10 ml de PBS precalentado.
      2. Añadir 1 ml de 229 células solución y el lugar de tripsina-EDTA 0,05% HeLa a 37 ° C + 5% de CO ₂ durante 3 - 5 min para separar las células.
      3. Recoger las células en 9 ml de pre-calentado DMEM + 10% de FCS. Número de células utilizando un hemocitómetro y preparar las células a una densidad final de 4,9 × 10 ⁴ células / ml usando DMEM + 10% de FCS.
   2. Pipeta 80 l de células HeLa 229 con una densidad de 4,9 × 10 ⁴ células / ml en cada pocillo que contiene el reactivo de transfección + suero reducido medio + siRNA mezcla. Esto corresponde a una densidad celular de 3,92 × 10 ³ células / pocillo.
      Nota: Se requiere la sustracción de fondo para el sustrato Blam.
      1. No añadir células o siRNA a los pozos "en blanco" (Figura 3). En su lugar, añadir 80 l de DMEM + 10% de FCS a estos pozos creados por triplicado.
   3. Incubar durante 24 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.

3. Cambiar medios (día 5)

1. Después de 24 horas, retirar el medio utilizando un adaptador multicanal conectado a una fuente de vacío o manualmente con una pipeta multicanal, y reemplazar con 100 l de precalentamiento frescaed DMEM + 10% de FCS.
2. Incubar durante 48 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.
3. En este punto, comprobar la viabilidad de las células visualmente usando un microscopio óptico estándar. Si la transfección inversa ha sido exitosa, se observó muerte celular significativa en los pocillos que contienen la PLK1 siRNA en comparación con OTP siRNA.

4. La cuantificación de Coxiella burnetii en pBlaM-CBU0077 de las cepas con qPCR (día 7)

1. Después de 7 días de crecimiento en ACCM-2 a 37 ° C en 5% de CO _2, 2,5% de O ₂ (1,3), se centrifuga la 10 ml C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15.000 × g durante 15 min a TA.
2. Vuelva a suspender el sedimento bacteriano en 10 ml de pre-calentado DMEM + 10% de FCS. Preparar 1:10 y 1: 100 diluciones de la cultura (muestra) usando dH ₂ O.
3. Configurar los componentes necesarios para la qPCR.
   Nota: extracción gDNA se puede realizar de antemano y se almacena a -20 ° C until requiere.
   1. Preparación de las normas:
      1. Extraer gDNA de Coxiella burnetii RSA439 NMII cepa de tipo salvaje cultivadas en ACCM-2 a 37 ° C en 5% de CO _2, 2,5% de O ₂ durante 7 días utilizando un kit de extracción de ADNg, según las instrucciones del fabricante.
      2. Medir la concentración gDNA (g / l) utilizando un Nanodrop (o equivalente) a una absorbancia de 260 nm.
      3. Calcular el número de copias del genoma por l utilizando la siguiente fórmula siguiente, y convertir a número de genomas / ml.
         
      4. Ajustar el número de genomas / ml a 10 ⁹ / ml (en un volumen final de 100 l) en un tubo de microcentrífuga usando _dH2O Esto puede ser hervida durante 10 min y se almacenó a -20 ° C hasta su utilización.
      5. En el día de la infección, generar 10 veces diluciones en serie de 10 ⁸ genomas / ml a 10 ⁵ genomas / ml de la 10 ⁹ genomas / ml de stock.
         1. Pipeta de 10 l de 10 ⁹ genomas / ml en 90 l de _dH2O para generar 10 ⁸ genomas / ml. Vórtice para mezclar. Pipeta de 10 l de 10 ⁸ genomas / ml en 90 l de _dH2O para generar 10 ⁷ genomas / ml. Vortex y repetir hasta 10 ⁵ genomas / ml.
   2. Configurar reacción qPCR. Crear una mezcla maestra de 25 pozos para dar cuenta de los errores de pipeteo. Para cada pocillo, utilizar 10 l qPCR Master Mix; 2 l de mezcla de cebadores ompA (4.3.2.2) y 3 l de _dH2O
      Nota: OmpA es una proteína de membrana externa de C. burnetii ^'39 y una sección de 82 pares de bases dentro de una región altamente conservada se seleccionó para su uso como una sonda como se ha descrito previamente ^40.
      1. Configurar cada estándar (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ genomas / ml) y de la muestra (1:10 y dilución 1: 100) en una PCR de 96 pocillos lágrima placa (no faldón) por duplicado o triplicado, respectivamente. Añadir 5 l de muestra o estándar en los pocillos apropiados.
      2. Uso de dH ₂ O, diluir tanto el cebador directo ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') y ompA cebador inverso (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') a una concentración final de 4 M y se combinan en el mismo tubo de microcentrífuga.
         Nota: La mezcla de cebadores ompA se puede preparar de antemano y se almacena a -20 ° C hasta su utilización.
      3. Combinar 250 l qPCR Master Mix, 50 l ompA mezcla de cebadores, 75 l _{de dH2O} y agitar para mezclar. Añadir 15 l de esta mezcla maestra a los pozos que contienen cualquiera de los estándares o muestras.
      4. Coloque 8 de tapa tapas de tiras de PCR en los pocillos apropiados y centrifugar los tubos de PCR de pulso para asegurar que todo se recoge en la parte inferior de los tubos.
      5. Configurar el programa siguiente en una PCR cuantitativa malomo: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 1 seg y 60 ° C durante 20 s (Figura 4A).
   3. Analizar los valores Ct (ciclo umbral) de la qPCR:
      1. La transferencia de los valores de Ct a una hoja de cálculo utilizando la función de exportación del programa.
      2. Crear un diagrama de dispersión de las normas ⁵ 10 genomas / ml hasta 10 ⁹ genomas / ml (expresadas como valores de registro). Descarte cualquier valor atípico obvias entre las muestras por triplicado. Generar una línea de tendencia logarítmica y determinar la ecuación de la gráfica.
      3. Calcular el número total de genomas / ml en la muestra mediante el uso de la ecuación generada en 4.3.3.2. No se olvide de tener en cuenta la dilución inicial (1:10 y 1: 100) de las muestras.

5. La infección de las células transfectadas inversa (día 7)

1. Después de calcular el total de genomas / ml en el C. rebabacultura netii pBlaM-CBU0077 a ser utilizado para la infección, ajuste re-suspendido cultivo bacteriano para infectar células a una MOI de 300 en un volumen final de 50 l / pocillo usando precalentado DMEM + 10% de FCS.
   Nota: La densidad esperada de las células sembradas HeLa 229 con un tiempo de duplicación normal después de 72 hr es 3.136 × 10 ⁴ células / pocillo. La cantidad de bacterias necesarias para infectar a una MOI de 300 es 9,408 × 10 ⁶ en 50 l, lo que equivale a 1,88 × 10 ⁸ bacterias / ml.
   1. Usando el valor calculado a partir de los qPCR (genomas / ml) (4.3.3.3), diluir las bacterias resuspendidas utilizando pre-calentado DMEM + 10% de FCS en un volumen final de 2 ml para infectar a las células transfectadas inversa.
2. Retire los medios de comunicación existentes partir de la pieza y revertir las células transfectadas.
3. Añadir 50 l de las bacterias diluidas (1,88 × 10 ⁸ bacterias / ml) a los pocillos apropiados. Añadir 50 l de DMEM + FCS al 10% tanto para el blanco y uninfected pozos.
4. Incubar durante 24 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.

6. La adición de Blam Sustrato para determinar el nivel de translocación (día 8)

1. Preparar las soluciones para la solución de carga 6x sustrato Blam.
   Nota: La solución A, B y C se proporcionan en el kit de sustrato Blam (Consulte la Tabla de Materiales). Solución B se puede formar un precipitado a TA. Calentar esta solución a 37 ° C antes de su uso y el precipitado debería disolverse.
   1. Cuando se utiliza el kit por primera vez, añadir 185 l de DMSO (suministrado con el kit de sustrato Blam) a la solución desecada A. Posteriormente, almacenar la re-suspendido Solución A a -20 ° C.
   2. Preparar una solución 0,1 M de probenecid con antelación y almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 ° C hasta su utilización.
      1. Preparar M NaOH 0,4 (1,6 g en 100 ml dH ₂ O).
      2. Preparar Na 100 mM de tampón de fosfato de pH 8 (1,56 g NaH ₂ PO ₄ • 2H ₂ HPO ₄ en 100 ml de _H2O destilada).
      3. Disolver 1,25 g de probenecid en 22 ml de NaOH 0,4 M por agitación vigorosa.
      4. Añadir 22 ml de Na mM de tampón fosfato pH 8 100 (solución a su vez, nublado) y se agita para disolver el precipitado que se forma.
      5. Ajustar el pH a 8 (si es necesario) utilizando 1 M NaOH / HCl.
      6. Se agita vigorosamente y se calienta ligeramente (<50 ° C) hasta que la solución es mayormente despejado.
      7. Filtro (0,2 micras de tamaño de poro) y la alícuota en volúmenes de 1 ml. almacenar alícuotas a -20 ° C.
2. Para cada pocillo, utilice 0,06 l Solución A, 0,54 l Solución B, 7,9 l Solución C y 1,5 l 0,1 M probenecid. Crear una mezcla maestra para los 30 pocillos mediante la combinación de primero 1,8 l de solución A y 16,2 l de solución B juntos en un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien usando un vórtice. Añadir 237 l de solución C y 45 l de 0,1 M de probenecid. Vortex para combinar todos Components.
   Nota: La solución de 6x de carga es estable durante hasta 4 horas (en la oscuridad), pero debe prepararse lo más cerca posible antes de su uso.
3. Añadir 10 l de la solución de carga 6x directamente en todos los pocillos en blanco y reverso transfectadas sin la eliminación de los medios de comunicación existente.
4. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad.
5. Para determinar el nivel de translocación, cuantificar la cantidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas.
   Nota: El procedimiento siguiente es específico para el lector de microplacas ClarioSTAR. lectores de microplacas equivalentes también pueden ser utilizados.
   1. Crear un nuevo protocolo de la intensidad de fluorescencia utilizando como punto final el modo de lectura.
   2. Ajustar los parámetros básicos de la siguiente manera:
      1. Seleccionar microplaca de 96 pocillos.
      2. En configuración óptica, seleccionar 2 multichromatics con los siguientes ajustes definidos por el usuario: (1) Entrada de 410 a 10 nm de excitación y 520 a 10 nm de emisión. (2) de excitación de entrada 410 a 10 nm y de emisión de 450 a 10 nm. Garantizar así multichromatics se selecciona.
      3. Seleccionar promedio orbital con un diámetro de 3 mm.
      4. Bajo óptica, seleccione óptica inferior.
      5. En virtud de la velocidad y precisión, seleccione precisa. Esto corresponde a ocho regiones por pocillo.
   3. Ajustar la disposición de la placa mediante la selección de los pozos apropiados como muestras.
   4. Seleccione la medida de arranque.
   5. Retire la tapa y coloque la bandeja en el lector de placas. Para evitar llegar a valores máximos de fluorescencia, asegúrese de que se ajusta el valor de ganancia. Para ello, realice un ajuste de ganancia en uno de los pozos infectados que ha sido inverso transfectadas con siRNA OTP. Esto corresponde a la más alta translocación esperado.
   6. Seleccionar medición inicial para medir todos los pocillos apropiados usando fluorescencia de fondo a una excitación de 410 nm y emisión de 450 nm tanto y 520 nm para la fluorescencia azul y verde, respectivamente.

7. Análisis de los resultados:

1. Se calcula la relaciónde 450 nm a 520 nm (azul a verde) para todas las muestras después de la reducción en blanco y expresar con relación a la muestra de OTP no infectada.
   Nota: se proporcionan los siguientes pasos de análisis para un simple programa de hoja de cálculo.
   1. El uso de la función de exportación en el lector de microplacas, transferir los valores de fluorescencia primas obtenidas tanto para 520 nm y 450 nm de emisión longitudes de onda (6.5) en una hoja de cálculo.
   2. Calcular el promedio de las lecturas "en blanco" (los medios de comunicación, no sólo las células) para la longitud de onda de 520 nm mediante la adición de los 520 valores de fluorescencia nm primas y dividiendo por el número de pozos (3). Repita el uso de los valores de longitud de onda en blanco 450 nm. Estos valores representan la fluorescencia de fondo debido a la placa de 96 pocillos y medios de comunicación.
   3. Restar la fluorescencia de fondo. Utilizando los valores obtenidos en 7.1.2 restar la media de la longitud de onda en blanco 520 nm a partir de todos los valores de fluorescencia de la muestra nm 520. Repita para los valores de longitud de onda de 450 nm.
   4. Para obtener el 450: relación de 520 nm utilizar los valores corregidos en blanco (7.1.3). Dividir cada muestra de valor de fluorescencia de 450 nm por su valor de 520 nm correspondiente.
   5. Calcular el promedio de los valores de la relación no infectadas OTP mediante la adición de los 450: valores de la relación nm 520 (de 7.1.4) y dividiendo por el número de pocillos (3).
   6. Se calcula la relación de las muestras relativas a no infectada OTP dividiendo el 450: relación nm 520 calculado en 7.1.4 por el promedio del valor no infectada relación OTP calculada en 7.1.5.

8. La adición de los núcleos de la mancha para determinar el número de células después de translocación de ensayo (día 8)

1. Después de la cuantificación de la fluorescencia, eliminar los medios que contienen solución de carga 6x de todos los pocillos usando un adaptador de múltiples canales conectado a una fuente de vacío o manualmente con una pipeta multicanal.
2. Añadir 50 l de solución al 4% PFA (paraformaldehído)en PBS a todos los pocillos apropiados para fijar las células. Incubar a TA durante 20 min.
3. Retirar 4% de solución de PFA PBS (según 8.1) y lavar las células dos veces con 75 l de PBS.
4. Añadir 50 l de una mancha nuclear permeable celular, por ejemplo DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), a cada pocillo. Adquirir imágenes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar el número de núcleos presentes en cada pocillo después del tratamiento siRNA utilizando software de análisis de imágenes apropiado, tal como ImageJ ^41.

Para este estudio, la C. Se seleccionó la cepa burnetii pBlaM-CBU0077 como CBU0077 se ha demostrado previamente para ser un efector translocado del sistema de secreción de Coxiella Dot / ICM 17. Antes de la infección, el número total de genomas / ml en los siete día C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 se enumeró utilizando qPCR. La figura 4 muestra un ejemplo del ciclo umbral valores (Ct) que se espera de ambos patrones y las muestras siguientes qPCR. Los valores de Ct (representados gráficamente en la gráfica de amplificación (Figura 4B) y numéricamente (Figura 4C)) se exportaron y se analizaron como se describe en 4.3.3. En base a los datos representativos se muestran, había 2,31 × 10 8 genomas / ml en los 10 ml de cultivo bacteriano se resuspendió (Figura 4D). Para generar la dilución bacteriana apropiada (1,88 × 10 8 genomas / ml in se añadieron 2 ml), 1,63 ml de bacterias se resuspendieron a 370 l de fresco, pre-calentado DMEM + 10% de FCS. Las células transfectadas con siRNA inversa se ​​infectaron posteriormente con C. burnetii pBlaM-CBU0077 a una MOI de 300 durante 24 horas.

Después de la incubación de la inversa células infectadas transfectadas con BlaM sustrato cuantificación de la translocación efectora se pueden determinar usando un lector de placas de fluorescencia. Tras el análisis como se describe en 7, todos los valores de la relación que han sido normalizados a OTP no infectadas también pueden normalizarse a OTP infectada. El nivel de translocación efector después de silenciamiento de genes del huésped se puede agrupar en tres resultados después de la comparación con el control infectado OTP: (1) No hay cambio; (2) El aumento de la translocación efector; (3) Disminución de la translocación efector. Su posterior análisis estadístico, por ejemplo, una prueba t de Student, se puede utilizar para determinar la significación de cualquier diferencia observada to infectada control de OTP. El resultado de silenciar o bien Rab5a o Rab7A en la translocación efector de tres experimentos independientes se muestra en la Figura 5A. Una disminución significativa en el nivel de Blam-CBU0077 translocación se produjo durante el silenciamiento de ambos Rab5a y Rab7A comparación con el control OTP (valor p = 0,0088 (Rab5a) y el valor p = 0,0059 (Rab7A), a la par, prueba t de Student). También se estableció el impacto del tratamiento siRNA sobre la viabilidad celular. Tras el ensayo de translocación, se fijaron las células, se tiñeron con una tinción de núcleos y posteriormente cuantificados. Como se muestra en la Figura 5C, aunque el tratamiento con cualquiera de Rab5a o Rab7A resulta en una reducción de la viabilidad celular en comparación con el control de OTP (12% y 31%, respectivamente), esta reducción no es tan grave como la PLK1 (97%), un gen conocido para causar la muerte celular (p-valor = 0,0102 (Rab5a); p-valor = 0,0081 (Rab7A); valor de p <0,0001 (Plk1), a la par, prueba t de Student). Estos resultados demuestran cómo el silenciamiento de acogida genes utilizando siRNA pueden alterar negativamente los niveles de translocación bacteriana efector.

Figura 1. El mecanismo de acción de la BlaM sustrato durante la infección. C. burnetii es internalizado por las células huésped y forma una vacuola lisosoma derivados denomina la vacuola -Con Coxiella. Después de la infección 24 horas, las células se cargan con el sustrato BlaM permeable membrana que posee dos fluoróforos que forman un par de FRET (A). En ausencia de β-lactamasa es decir, no la translocación del efector BlaM-CBU0077, la excitación de la cumarina en 410 resultados nm de FRET a fluoresceína, observadas como una señal de fluorescencia verde (520 nm) (B). en el caso de un sistema de secreción Dot / Icm funcional, la proteína de fusión BlaM-CBU0077 se translocan en la célula huésped y se clalero del sustrato BlaM, a través de la actividad de β-lactamasa, causando la separación de los dos colorantes y que resulta en la interrupción de FRET y una señal azul de fluorescencia (450 nm) después de excitación a 410 nm (C). Tanto las señales de fluorescencia verde y azul pueden ser detectado usando un lector de placas de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

. Figura 2. Esquema general de la transfección inversa y translocación Ensayo de flujo de trabajo Día 1: Preparar la C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura Día 4:. transfectar inversa usando 40 229 células nM siRNA y de semillas de HeLa a una densidad final de 3,92 × 10 3 células / pocillo en una bandeja de 96 pocillos Día 5: Ch.medios ange Día 7:. Cuantificar el total de genomas / ml de la C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultivo utilizando qPCR y posteriormente infectar las células transfectadas inversa con una MOI de 300. Día 8:. Añadir colorante de carga 6x, medir la fluorescencia y cuantificar el número de células Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La disposición de las placas de 96 pocillos se usan para establecer la transfección inversa y la siembra de células HeLa 229. Los pozos "en blanco" (en rojo) contiene solamente los medios de comunicación y no necesitan la adición de siRNA o HeLa 229 células. El OTP siRNA (se muestra en azul claro para los pozos no infectadas y azul oscuro para pozos infectados) se utilizó como control no director, ya que se ha optimizado paratienen menos efectos fuera de la meta. El granate y pozos verdes representan la Rab5a y Rab7A siRNA, respectivamente. Plk1 siRNA (en amarillo) se utiliza como una medida de la eficacia de transfección como la pérdida de la expresión de Plk1 puede inducir vías pro-apoptóticos y extensa muerte celular en una gran mayoría de las líneas celulares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Valores Representante qPCR CT utilizada para cuantificar la cantidad total de genomas / ml en C. burnetii Cultura pBlaM-CBU0077. (A) Las condiciones del ciclo utilizados en la qPCR para enumerar el número de genomas / ml en cultivos de Coxiella. Los valores de Ct para los dos patrones y las muestras se representan en la gráfica de (B) y numérico (C)formatos. (D) Los valores estándar de Ct se promediaron, representan gráficamente y se calculó una línea de tendencia logarítmica. Usando la ecuación y las medias de la muestra Ct valores del número total de genomas / ml en el C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 se determinó que era 2,31 × 10 8. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. La translocación del Dot / ICM Efector Blam-CBU0077 durante siRNA silenciamiento de Rab5a y Rab7A. HeLa 229 células fueron transfectadas con siRNA inverso específico para Rab5a (barras de color granate), Rab7A (barras verdes), OTP (barras azules) o Plk1 (barras de color amarillo) y se incubaron durante 72 h antes de la infección con el C. cepa burnetii pBlaM-CBU0077 a una MOI de 300 durante 24 horas. después de tque la adición del sustrato BlaM, la fluorescencia se midió usando un lector de microplacas (A) La tabla demuestra los valores de fluorescencia primas obtenidas de un solo experimento junto con el 450:. 520 nm relación relativa al control de OTP no infectados después de la sustracción de los valores en blanco (medios solamente, no hay células). El nivel de translocación (B) y la viabilidad celular (C) se presentan como el porcentaje medio ± desviación estándar relativa a las células infectadas transfectadas OTP inversa a partir de tres experimentos independientes. * Valor de p <0,05; ** Valor de p <0,01; **** Valor de p <0,0001 (emparejado, la t de Student-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Los componentes requeridos para realizar 1x ACCM-2.

Tabla 2. Volumen de 1x siRNA de almacenamiento intermedio necesario para la hidratación de liofilizado siRNA a la concentración apropiada.

Los autores no tienen nada que revelar.