Artículo de método

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

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DOI:

10.3791/54218

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15 de julio de 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

En este artículo

Resumen

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

Resumen

La mitosis es fundamental para el crecimiento y la diferenciación del organismo. El proceso es altamente dinámico y requiere ordenó eventos para llevar a cabo la condensación de la cromatina adecuada, la unión a microtúbulos del cinetocoro, la segregación de cromosomas, y la citocinesis en un marco de tiempo pequeño. Los errores en el delicado proceso puede dar lugar a enfermedades humanas, incluyendo defectos congénitos y cáncer. Los enfoques tradicionales que investigan estados de enfermedad mitótico humanos a menudo se basan en los sistemas de cultivo de células, que carecen de la fisiología natural y contexto de desarrollo / específico de tejido ventajoso en el estudio de enfermedades humanas. Este protocolo supera muchos obstáculos proporcionando una manera de visualizar, con alta resolución, dinámica de los cromosomas en un sistema de vertebrados, el pez cebra. Este protocolo se detallará un enfoque que puede ser utilizado para obtener imágenes dinámicas de células en división, que incluyen: la transcripción in vitro, la cría de pez cebra / recepción, la incrustación de embriones, y la imagen de lapso de tiempo. Optimización y modificaciones de este protocolo también se exploran. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas de la cromatina) y mCherry-CAAX (etiquetas de membrana celular) embriones de ARNm de inyección, la mitosis en AB de tipo salvaje, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 se visualiza pez cebra mutante. Alta resolución de imágenes en vivo en el pez cebra permite observar mitosis múltiples para cuantificar estadísticamente defectos mitótico y el momento de la progresión mitótico. Además, se observó la observación de aspectos cualitativos que definen los procesos indebidos mitótico (es decir, defectos congression, missegregation de cromosomas, etc.) y los resultados cromosómicas inadecuada (es decir, la aneuploidía, poliploidía, micronúcleos, etc.). Este ensayo se puede aplicar a la observación de tejido diferenciación / desarrollo y es susceptible al uso del pez cebra mutante y agentes farmacológicos. La visualización de cómo los defectos en la mitosis conducen al cáncer y los trastornos del desarrollo será de granmejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad.

Introducción

La mitosis es un proceso celular esencial crítica para el crecimiento, la diferenciación y la regeneración en un organismo vivo. Tras la preparación exacta y la replicación del ADN en la interfase, la célula se prepara para dividirse. La primera fase de la mitosis, la profase, se inicia por la activación de la ciclina B / Cdk1. Profase se caracteriza por la condensación de material de cromatina en los cromosomas. rotura de la envuelta nuclear se produce en la transición entre la profase y prometaphase. En prometaphase, los centrosomas, el centro de nucleación para la formación del huso, comienzan a migrar hacia los polos opuestos mientras extiende los microtúbulos en busca de la unión cinetocoro. Tras la unión, las conversiones hasta final de microtúbulos en el apego y las fuerzas de tensión se orientan los cromosomas que forman una placa de la metafase 1. Si todos los cromosomas están conectados correctamente, el puesto de control conjunto del husillo se satisface, anillos cohesinas que llevan a cabo las cromátidas hermanas juntas se escinden, y los microtúbulos acortar para tirar de la hermanacromátidas hacia los polos opuestos durante la anafase 2,3. La fase final, la telofase, implica el alargamiento de la célula y la reforma de la envoltura nuclear alrededor de los dos nuevos núcleos. La citocinesis completa el proceso de división separando el citoplasma de las dos nuevas células hijas 4-6. La alteración de las principales vías de la mitosis (es decir, punto de control de ensamblaje del huso, la duplicación del centrosoma, cromátida hermana de cohesión, etc.) Puede resultar en la detención de la metafase, missegregation de cromosomas, y la inestabilidad genómica 7-10. En última instancia, los defectos en las vías de mitosis control pueden causar trastornos del desarrollo y el cáncer, que requiere la visualización de la mitosis y de sus defectos en una, vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16.

embriones de pez cebra sirven como un gran organismo modelo para la formación de imágenes en vivo debido al tejido transparente, facilidad de microinyección, y el desarrollo rápido. El uso de pez cebra, el objetivo general de este manuscrito esdescriben un método de 5D en vivo (dimensiones X, Y, Z, el tiempo y longitud de onda) de formación de imágenes de mitosis 17 (Figura 1C). El uso de pez cebra mutante defectuoso en diferentes vías mitóticas demostrar la consecuencia de tales defectos. Para este protocolo, Aurora B y ESCO2 mutantes fueron elegidos para ilustrar estos defectos. Aurora B es una quinasa que es parte del complejo de cromosoma de pasajeros (CPC) que participan en la formación del huso y la unión de los microtúbulos. También se requiere para la formación de división surco en la citocinesis 18,19. En el pez cebra, la deficiencia de Aurora B conduce a defectos en la inducción surco, la citocinesis, y la segregación de los cromosomas 20. ESCO2, por otro lado, es una acetiltransferasa que es esencial para la cohesión de cromátidas hermanas 21,22. Se acetila cohesinas en la porción del anillo SMC3 estabilizando así cohesinas para asegurar correcta segregación cromosómica en la metafase-anafase transición 23. La pérdida de ESCO2 en el pez cebra lleva a chmissegregation romosome, hermana prematura separación de cromátidas, la inestabilidad genómica, y dependiente de p53 y la apoptosis independiente 24,25. Debido a la disponibilidad, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 pez cebra mutante (en lo sucesivo, aurB m / my ESCO2 m / m, respectivamente) se utilizará para ilustrar esta técnica 25-27.

Acoplamiento microscopía confocal con maquinaria de la célula fluorescente-tagged ha permitido a los investigadores visualizar dinámica de la cromatina y la membrana celular durante la mitosis 25,28,29. histonas-fluorescentes etiquetadas históricamente se han utilizado para visualizar la cromatina. Las histonas son proteínas nucleares compuestas de cuatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, y H4) que son responsables de la estructura del nucleosoma que compone los cromosomas 30. Mientras H2B es sin duda el más utilizado para la histona proteínas fluorescentes enel ratón y el cultivo celular, el uso de la histona 2A, Z Familia (H2A.F / Z) ha demostrado también para su uso en el pez cebra 31,32. Concanavalina A y la caseína quinasa 1-gamma por ejemplo, localizar a la membrana celular y se han demostrado eficaces en la visualización de la membrana celular en erizos de mar y Drosophila 33,34. Otros estudios han demostrado que la proteína fluorescente de etiquetado CAAX etiquetas de la membrana celular y tuvo éxito en el pez cebra 31. CAAX es un motivo que es reconocido por las enzimas de modificación post-traduccionales tales como farnesyltransferases y geranylgeranyltransferases. Las modificaciones de estas enzimas causan las proteínas a ser asociada a la membrana, por lo tanto etiquetar la membrana celular 35.

Debido a la utilización anterior en el pez cebra, este protocolo eligió utilizar H2A.F / Z y CAAX para etiquetar la cromatina y la membrana celular. La aplicación de este método permitirá que el investigador para supervisar la mitosis en el nivel de célula individual para observar cromosoma individuodinámicas, como se monitorean así como simultáneamente múltiples divisiones celulares que pueden impactar en la diferenciación de tejidos y el desarrollo. Este artículo se centrará en la formación de imágenes de la dinámica de la segregación de cromosomas durante la mitosis en el nivel de células individuales. Dentro de este manuscrito, la capacidad de observar varias divisiones mitóticas, calcular el tiempo de división, y descifrar los fenotipos mitóticas se ilustra y se describe. Mediante el uso de estos parámetros, fisiológicamente relevantes de datos pueden ser recogidos y aplicados a varios estados de enfermedad afectados por defectos mitótico.

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Protocolo

1. Transcripción in vitro

  1. Linealizar pCS2-H2A.F / vectores pCS2-mCherry-CAAX Z-EGFP y / o por la restricción NotI digestión con enzimas de 31. El uso de un ARN en el kit de transcripción in vitro, generar 5 'de ARNm de productos tapados de cada plantilla, según el protocolo del fabricante.
  2. Se purificó el ARNm cubrieron usando un kit de purificación. Siga las instrucciones del fabricante. Eluir con RNasa libre de H 2 O.
  3. Determinar la concentración de ARN por absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro. (OD 260 x dilución x 40 g / ml).
  4. Se diluye la ARN a 100 ng / l para cada H H2A.F / Z-EGFP y mCherry-CAAX con RNasa libre de 2 O. Si la concentración de ARN es demasiado baja, la fluorescencia se verá disminuida o ausente. muestras más brillantes van a disminuir las preocupaciones sobre la fototoxicidad y photobleaching. Por otro lado, el exceso de RNA puede ser tóxico y / o causar efectos fuera de destino.
    Nota: Guarde el restantemRNA purificado en -80 ° C congelador.

2. cría de pez cebra, recogida de embriones, y el ARNm de inyección 36-38

  1. Montar tanques de cría con una barrera para separar el depósito en dos regiones y llenar cada tanque de cría con agua sistema de acuicultura utilizados en las instalaciones de pez cebra.
  2. Con el fin de prevenir la reproducción prematura, colocar dos peces machos en un lado de la barrera y dos peces hembra en el otro lado de la noche antes de criar.
  3. Al día siguiente, la mezcla se descongele ARNm preparado previamente en hielo. Reemplazar el agua en los tanques de cría con agua sistema de acuicultura fresco y eliminar las barreras. Inmediatamente después de que las barreras se tira, calentar un molde de inyección de 28,5 ° C y configurar el equipo para la microinyección.
    Nota: Para obtener información sobre los moldes de inyección, por favor refiérase a Gerlach 36.
  4. Recoger los huevos cada 10 - 15 min usando un colador de té y enjuagar los huevos en un lugar limpio 100 x 15 mm placa de Petri con E3 azul (5 mM NaCl, KCl 0,17 mM, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% azul de metileno). E3 azul se utiliza para prevenir el crecimiento de hongos y asegurar el desarrollo adecuado de las larvas de peces. Para obtener más información sobre el apareamiento y la recogida de embriones, consulte Gerlach 36 y 37 Porazinkski.
  5. Insertar una célula puesta en escena embriones en un molde de inyección calentado e inyectar el ARN en la yema de huevo en la cantidad deseada de embriones (Figura 1A). Cuenta de muerte embrionaria natural y embriones fertilizados mediante la realización de inyecciones embrionarias, el 15% más embriones de los necesarios para el experimento. Para detalles adicionales sobre la microinyección de embriones de pez cebra, por favor refiérase a Gerlach 36 y 37 Porazinkski.
    NOTA: Para el primer uso del ARNm, realizar un análisis de dosis-curva para determinar la dosis óptima para la fluorescencia y la viabilidad (definida como ausencia de defectos en el desarrollo brutos de hasta 5 dpf) antes de la realización de imágenes 5D. 150-200 ng / linyecta en embriones es a menudo la concentración óptima, por lo tanto es un buen punto de partida para la concentración final.
  6. extraer cuidadosamente los embriones inyectados desde el molde utilizando un 9 "pipeta Pasteur de vidrio modificado. Para modificar la pipeta, fundir el extremo usando un mechero Bunsen hasta que se forme una bola.
  7. Colocar los embriones inyectados en una placa de Petri de 100 x 15 mm en el E3 azul y la casa en una incubadora a 28,5 °.
  8. Seis horas después de la inyección, eliminar cualquier embriones muertos o no fecundados de las placas y añadir limpia E3 azul. La casa de los embriones a 28,5 ° C.

3. Preparación e incrustación de embriones de pez cebra en vivo de la Imagen (Figura 1B)

  1. Dos horas antes de exponer, defender los embriones inyectados para GFP usando un microscopio de disección fluorescente. Lugar luminoso embriones que expresan GFP verdes en un nuevo 100 x 15 mm placa de Petri con E3 azul.
  2. Hervir una solución madre de 1% de agarosa de baja fusión mediante la adición de 1 g de baja fusión de agarosa a 100 ml de azul E3. Después de usar la agarosa, cubrir el matraz con papel de aluminio. La solución madre sigue siendo útil para un máximo de un mes.
  3. Alícuota 3 ml del agar derretido en un tubo de cultivo de 17 x 100 mm. Mantener caliente el agarosa al colocar el tubo de cultivo en un baño de agua a 42 ° hasta que esté listo para su uso. Preparar una solución de 15 mM tricaína en agua desionizada para anestesiar a los embriones de pez cebra 36.
    NOTA: Si se desea formación de imágenes en los puntos de tiempo anteriores, la concentración de agar se puede disminuir tan bajo como 0,3% 39.
  4. Llevar el Tricaína 15 mM, embriones seleccionados, agarosa de bajo punto de fusión en, E3 azul, y un cubreobjetos de vidrio cultivo de fondo placa de 35 mm a un microscopio de luz disección. Retirar con cuidado corion del embrión con # 5 pinzas. Haga esto por tres embriones.
  5. Colocan los embriones dechorionated en un recipiente separado para ser anestesiados. La tapa de la placa cubreobjetos parte inferior se utiliza a menudo para este propósito. Usando una pipeta de transferencia, añadir tres gotas (aproximadamente 150 l)Tricaína de 15 mM para el plato de 5 ml E3 azul (si se utiliza la tapa de la placa inferior cubreobjetos) o hasta que los embriones han sido suficientemente anestesiado. Además, añadir 3-4 gotas (aproximadamente 150 a 200 l) de solución 15 mM tricaína al tubo de agarosa fundida al 1%.
  6. Con una pipeta P200 con 1 cm de la punta de la pipeta de corte; transferir los embriones anestesiados al plato cubreobjetos de fondo. Eliminar cualquier exceso de E3 azul: solución Tricaína.
  7. Añadir lentamente 5 - 10 l de agarosa bajo punto de fusión: solución tricaína en los embriones, manteniendo cada gota separada para asegurar que los embriones no accidentalmente la deriva cerca uno del otro.
    Advertencia: Si la agarosa es demasiado caliente, se puede dañar el embrión. Una buena temperatura para mantener el agar a es 42 ° C.
  8. Utilizando una aguja de 1 ½ 21 G, orientar suavemente el embrión en la agarosa a la posición deseada. Cuando se utiliza un microscopio invertido para obtener imágenes de lapso de tiempo, orientar la región de interés (ROI) tan cerca del cubreobjetos como possibLe.
    Nota: Para propósitos generales, la región de la cola ofrece facilidad de orientación y claridad debido al tejido relativamente delgada (Figura 1A). Otros tejidos, tales como la capa epitelial que rodea a los pliegues de la yema y de la aleta, se pueden utilizar 28,29. Estos tejidos ofrecen una gran claridad, sin embargo, estas regiones son sólo unas pocas capas de células de espesor. Para los fines de este protocolo, es beneficioso para la imagen de la región de la cola de adquirir como de muchas divisiones celulares como sea posible.
  9. Deje pasar unos minutos para la solidificación parcial del agar. Utilice la aguja para romper un pequeño trozo de agar para probar su solidificación. Cuando una pieza de agar se separó de la caída, proceder al siguiente paso.
  10. Cubrir todo el cubreobjetos con la formación de agar de fusión bajo una cúpula sobre los embriones embebidos. Dejar que el agar se solidifique antes de mover el plato para formación de imágenes confocal (Figura 1A).
  11. Durante el proceso de solidificación agar (tarda aproximadamente 10 min), preparar 3 ml of solución E3 azul con cinco gotas de (250 l aproximadamente) Tricaína 15 mM a ser colocado sobre los embriones incorporados durante la exploración.

4. 5D Imagen confocal de embriones de pez cebra en vivo 40,41

NOTA: Ver Ariga 40 y O'Brien 41 para obtener detalles sobre cómo realizar imágenes 5D utilizando otros sistemas confocal. Para Z-intervalo, pila Z, Z-profundidad, intervalo de tiempo, y las definiciones 5D véase la Figura 1C.

  1. Abra el software de imagen y establecer el microscopio 60X ND 1.4 lente objetivo. Aplicar aceite de inmersión de la lente del objetivo y coloque la placa de cultivo en el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio. Utilizando el controlador de eje, centrar el embrión de interés por encima de la lente objetivo y llevar la lente del objetivo hacia arriba para cubrir la placa de cultivo.
  2. Haga clic en el icono del ocular y cambiar el filtro de GFP en el microscopio. Centrarse en el retorno de la inversión. Centrándose en el tejido más cercano a la cubreobjetos se offer los mejores resultados de imagen.
  3. Retire el enclavamiento. Seleccionar los canales de GFP y mCherry (longitudes de onda preestablecidas en el software) y establecer la línea de opciones a la normalidad promedio.
  4. Use "Controles Vista / Adquisición / A1 área de escaneado" comando para abrir la herramienta A1 área de escaneado.
  5. Empezar a escanear. Utilizando el eje controlador, coloque el embrión de manera que el área de escaneado se llena con la mayor cantidad de pez cebra como sea posible. La potencia del láser no tiene que ser óptima en este punto. Bajar la potencia del láser para evitar photobleaching innecesaria.
  6. Utilice la opción "Controles Vista / Adquisición / adquisición ND" comando para abrir el panel de control de adquisición de ND.
  7. Iniciar la exploración para establecer los parámetros Z-stack. Establecer el límite superior de Z-pila para que las células no están en foco y el límite inferior a la que las células ya no son visibles. Permitir un espacio 3 m por encima de la muestra para el crecimiento y el movimiento celular, que puede expandirse en el campo de la imagen. El Z-pila para las cifras que se muestran en este proProtocolo cubrió una Z-profundidad de 40 m en la cola del embrión.
  8. Ajuste el tamaño de paso-Z intervalo de 2 micras. En promedio, una célula es 10 m de diámetro; por lo tanto, 2 micras producirá cinco intervalos de datos de imagen para ser analizados para cada celda.
    NOTA: La profundidad de la imagen que puede ser adquirida depende del intervalo Z. Resolución Z se sacrificó para ganar profundidad total en la dimensión Z con el fin de imagen tantas células en mitosis como sea posible (Z gran profundidad). El inverso es cierto, en el que, al disminuir el tamaño de paso, la resolución Z se gana, mientras que la profundidad Z se sacrifica (pequeña Z-profundidad).
  9. Ajustar la potencia de imagen por láser, HV, y compensar los niveles. Para los experimentos demostraron en este protocolo, utilice la siguiente potencia del láser, HV, y compensar los niveles establecidos en los planos correspondientes, respectivamente, para el canal de GFP; 2-5, 120-140, y -9 a -11. Para el canal mCherry, utilice la siguiente potencia del láser, HV, y compensar los niveles, respectivamente; 3-6, 120-140, y -3 a-8. Una vez establecidos los parámetros, apague el escáner láser para evitar la exposición innecesaria que puede causar fototoxicidad y photobleaching de la muestra.
  10. Seleccione el icono de promedio línea de 2x. "No promediado" produce una imagen granulada, mientras que "la línea 4x promedio" aumenta drásticamente el tiempo de exploración. Utilización de promedios línea 2x proporciona la mejor calidad de imagen y menor tiempo de exploración.
  11. Seleccione la duración del intervalo de tiempo y el tiempo apropiado necesario para el experimento. Por divisiones de tipo salvaje, los intervalos de tiempo de dos minutos durante 2 horas es lo mejor para la determinación de la duración mitótico (utilizado en las figuras 1, 2, 3A y 3B). Divisiones que activan el punto de control de ensamblaje del huso durante más de 30 min son más adecuados para intervalos de cinco minutos durante cuatro horas con el fin de preservar la fluorescencia como se ha demostrado en la Figura 3C.
  12. Marque la casilla "guardar en el archivo" y el nombre del archivo para guardar automáticamente el archivo, ya que se está adquiriendo. Vuelva a comprobar todos los paparáme- se establecen correctamente y pulsa "Iniciar la ejecución".
  13. Después de la adquisición se haya completado, para ver el archivo en un formato tridimensional, haga clic en el icono del umbral de volumen.

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Resultados

La Figura 2 demuestra la capacidad de observar muchas divisiones celulares utilizando un campo de visión amplia de un tipo salvaje de cola de pez cebra AB. Más de siete células mitóticas se crean imágenes en un marco de tiempo de 14 min (Película 1). Dentro del transcurso de tiempo de dos horas, se capturaron más de 40 eventos de la mitosis. En promedio, se observaron 50 células en división en el AB y 30 células que se dividen en aur B ...

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Discusión

El uso de este método permite inferir ruptura nuclear sobre, formación de una placa de la metafase por adjuntos microtúbulos del cinetocoro, y segregación de las cromátidas hermanas para formar dos nuevas células en vivo y de una manera dependiente del tiempo. La capacidad de observar la mitosis en el pez cebra es ventajoso sobre muestras fijadas y sistemas de cultivo celular, porque las células están siendo fotografiado en la fisiología natural, el tejido es transparente, que permite para las proteínas fluores...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Kristen Kwan por los vectores pCS2-H2A.F/Z-EGFP y pCS2-mCherry-CAAX. Agradecemos a Chris Rodesch por enseñarnos imágenes en vivo en pez cebra. Agradecemos a Shawn Williams, Erik Malarkey y Brad Yoder por su ayuda en la obtención de imágenes confocales en la UAB y en el Centro de Imágenes de Alta Resolución de la UAB. El Centro de Imágenes de Alta Resolución cuenta con el apoyo de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico Integral de la UAB (P30CA013148) y el Centro Central de Enfermedades Reumáticas (P30 AR048311). J.M.P. cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (NIH R21 NS092105), y subvenciones piloto de la Sociedad Americana del Cáncer (ACS IRG-60-001-53-IRG) y el Centro Oncológico Integral de la UAB (P30CA013148). S.M.P. cuenta con el apoyo de la Beca de Formación T32 de Biología Celular y Molecular (5T32GM008111-28).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vectores pCS2Regalo de K. KwanPara el plásmido de interés
Enzima de restricción NotI-HFNueva Inglaterra BioLabsR3189SPara la digestión de restricción del plásmido
mMessage SP6 kitTechnologiesAM1340Para transcripción in vitro
RNeasy Mini kitQiagen74104Para purificar ARNm
100 x 15 mm Placas de PetriFisher ScientificFB0875712Para alojar embriones
Molde de microinyeccióncaseroPara sujetar embriones durante la microinyección
Agarosa IIAmresco0815-25GPara incrustar embriones
TricaineSigma-AldrichE10521-10GPara anestesiar embriones
Cloruro de sodioSigma-AldrichS9888Para agua de embriones (E3 Blue), disuelta en cloruro de potasio UltraPure H<>sub2O
Sigma-AldrichP3911Para agua de embriones (E3 Blue), disuelta en UltraPure H2O
Cloruro de calcio dihidratadoSigma-AldrichC8106Para agua de embriones (E3 Blue), disuelto en UltraPure H2O
Sulfato de magnesioFisher ScientificM7506Para agua de embriones (E3 Blue), disuelta en UltraPure H2O
Methylene Blue HydrateSigma-AldrichMB1Para agua de embriones (E3 Blue), disuelta en UltraPure H2O tubo de
cultivo de 100 mmFisher Scientific50-819-812Para agar fundido
de 35 mm placa de cultivo con fondo deslizante de vidrio MatTek CorpP35G-0-20-C Nº 0, vidrio de 20 mm, para la inclusión de embriones
#5 pinzasDumont72701-DPara descorionar embriones
21 G Aguja de calibre 1 1/2Becton Dickinson305167Para posicionar embriones en agar
Microscopio de disecciónNikon AZ100Para la detección e inclusión de embriones, cualquier endoscopio de disección servirá
Microscopio confocalNikon A1+Para imágenes de lapso de tiempo
Software confocalNIS Elements AR 4.13.00Para la adquisición y el procesamiento de imágenes
Life

Referencias

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