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Células Progenitoras de aislamiento Mesangiogenic (PSM) de Humana de Médula Ósea

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DOI:

10.3791/54225

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15 de julio de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un protocolo optimizado y altamente reproducible para aislar células progenitoras mesodérmicas (MPCs) de médula ósea humana (hBM). Las MPC se caracterizaron por citometría de flujo y expresión de nestina. Demostraron la capacidad de dar lugar a cultivos celulares similares a MSC en crecimiento exponencial mientras conservan su potencial angiogénico.

Resumen

En un estudio de investigación destinado a aislar células del estroma mesenquimal (MSC) derivadas de la médula ósea humana (hBM) para aplicaciones clínicas, identificamos una nueva población celular seleccionada específicamente para el crecimiento en medio suplementado con suero humano. Estas células se caracterizan por características morfológicas, fenotípicas y moleculares distintas de las MSC y las denominamos Células Progenitoras Mesodérmicas (MPC). Las MPC son redondas, con una región central gruesa altamente refringente; Muestran una fuerte adherencia al plástico resistente a la tripsina. El fracaso en la expansión de los MPC reveló directamente que son lentos en el ciclo. Esto es como también lo sugiere la negatividad del Ki-67. Por otro lado, el cultivo de MPCs en un medio estándar diseñado para la expansión de MSC, dio lugar a una población de células similares a MSC que crecieron exponencialmente. Además de mostrar capacidad de diferenciación mesenquimatosa, las MPC conservaron potencial angiogénico, lo que confirma su naturaleza progenitora de múltiples linajes. En este trabajo describimos un protocolo optimizado y altamente reproducible para aislar y caracterizar hBM-MPCs mediante citometría de flujo (CD73, CD90, CD31 y CD45), expresión de nestina y organización de F-actina. También se proporcionan protocolos para la diferenciación mesengénica y angiogénica de las MPC. Aquí también sugerimos una nomenclatura más apropiada para estas células, que ha sido renombrada como "Células Progenitoras Mesangiogénicas".

Introducción

Las células estromales mesenquimales (MSC) son de valor clínico relevante por su capacidad de diferenciación multi-linaje y su capacidad para soportar la hemopoyesis, para secretar factores de crecimiento / citoquinas, así como de desempeñar un papel en la inmunorregulación 1. En la definición de la producción de células terapias basadas en el MSC y la aplicación han sido objeto de una amplia investigación clínica y preclínica 2, con especial atención a la regulación internacional específico para la seguridad y eficacia de la célula de productos medicinales (CBMP) 3 tratamientos a base. MSCs humanas son ampliamente cultivadas en medios que contienen suplementos y reactivos de origen animal, tales como suero fetal bovino (FBS) y tripsina bovina. Por lo tanto, junto con los riesgos de infección asociados a la manipulación de células, los pacientes también se enfrentan a la exposición del prión, así como los riesgos inmunológicos vinculados a las proteínas, péptidos u otras biomoléculas de origen animal que podrían persistir después de la recolección de células y transplantación 4.

Para evitar el problema, cultivamos la médula ósea humana (HBM) -derivado MSC en medio libre de animales, en sustitución de FBS con agrupada humana de tipo AB suero (Phab). En estas condiciones, junto con MSCs crecientes hemos identificado un nuevo población celular. Estas células fueron morfológicamente y fenotípicamente diferentes de las MSC y mostró un perfil de expresión de genes distintivos, así como propiedades características de crecimiento / de adhesión. Se conservan las dos células mesodérmicas Progenitoras mesengenic y el potencial angiogénicos y por lo tanto fueron nombrados (PSM) 5. Posteriormente, hemos sido capaces de definir las condiciones de cultivo selectivas y reproducibles para generar PSM con alto grado de pureza 6.

Además, investigó las propiedades morfológicas y biológicas de los PSM. Los PSM mostraron ser nestina positivas, lento en el ciclismo, Ki-67-negativo, y con los cromosomas que se caracterizan por largos telómeros 5. Expresaron plurLos factores de transcripción asociados ipotency-MSC maestros reguladores Runx2 y Sox9 7 Oct-4 y Nanog en lugar de. Fenotípicamente, PSM expresó endoglina (CD105) en el nivel más bajo que las MSC mientras que carecen de marcadores mesenquimales CD73, CD90, CD166. PSM también mostró un patrón distintivo de moléculas de adhesión que se caracterizan por la expresión coherente de PECAM (CD31), integrinas αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c), así como la integrina β2 (CD18) que sustenta específicamente estructuras podosome-como 8 . En los medios de expansión MSC estándar, PSM diferenciarse rápidamente en las MSC a través de una etapa intermedia que ofrece la activación de Wnt5 / calmodulina de señalización 9 de la célula. PSM también retuvo propiedades angiogénicas, como se ha demostrado por su capacidad de brotar de esferoides en la matriz extracelular (ECM) cultivos 3D de proteínas murinas. El potencial angiogénico se pierde rápidamente después de la diferenciación MPC lo largo del linaje mesengenic.

Aquí presentamos Proprotocolos optimizados para aislar y caracterizar los PSM altamente purificadas de las muestras de sangre HBM. También se describen los protocolos reproducibles para MPC mesengenic y diferenciación angiogénico.

Protocolo

NOTA: Después de consentimiento por escrito, se obtuvieron muestras de HBM durante la cirugía ortopédica de reemplazo de cadera. Inmediatamente después de la osteotomía del cuello femoral y antes femoral escariado una jeringa de 20 ml que contiene 500 UI de heparina, se utilizó para aspirar BM fresco. El protocolo debe ser considerado ampliamente aplicable a cualquier fuente BM.

1. Aislamiento del hueso humano células de la médula mononucleares (MNC HBM-)

  1. Diluir 5 - 10 ml de BM fresco a 50 ml, la aplicación de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) y se mezcla por inversión. Igualmente distribuir 25 ml en dos nuevos tubos de 50 ml cónicos, añadir 25 ml de D-PBS a cada tubo y mezclar por inversión.
  2. Permitir que los tubos en reposo durante 10 min a temperatura ambiente, para la separación de fragmentos de hueso minerales y grasa de la solución.
  3. Retirar con cuidado la grasa flotante con una suspensión de células pipeta Pasteur y el filtro estéril a través de filtros de 70 micras sin perturbar el sedimento fragmento de hueso mineral.
  4. Establecer cuatro tubos de 50 ml con 15 ml de medio de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo (1,077 g / ml). Asegúrese de que este medio es a temperatura ambiente.
  5. Coloque con cuidado 20 - 25 ml de BM diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Realice esta operación con cuidado, dejando goteo suspensión de células en las paredes del tubo para evitar que las capas de mezcla.
  6. Llevar a cabo la centrifugación en gradiente de densidad a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente con frenado está desactivado.
  7. Recoger el anillo blanquecino de células situadas entre las dos fases utilizando una pipeta Pasteur estéril y la transfiere a un nuevo tubo de 50 ml.
  8. Lavar las células con medio de cultivo fresco: libre de rojo fenol, nivel bajo de glucosa (1000 mg / l) de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) agrupado tipo AB de suero humano (Phab), 2 mM L-glutamina y antibióticos (DMEM / 10% Phab). Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  9. Aspirar el sobrenadante y resuspender en pellets de 5 - 10 ml de DMEM fresco / 10% Phab.
  10. Continúe con el recuento de células.Determinar el número de células blancas de la sangre por 1: 1 de dilución en tripano. Aplicar esto a la hemocitómetro, y observar con un microscopio de contraste de fase. Excluir eritrocitos pequeños y perfectamente redondeados y las células muertas teñidas de azul desde el recuento de células.
    NOTA: Se recomienda Phab pantalla lotes por su rendimiento en la recuperación de MPC. Phab de fuentes USA han dado mejores resultados mientras que la mayoría de los sueros de origen diferente resultó en culturas MPC con porcentajes más altos de células MSC-como.

2. Aislamiento del PSM de HBM-MNC

  1. Conjunto hidrófobos matraces T-75 con 15 ml de DMEM / 10% Phab y dejar que el pH y la temperatura se equilibran por pre-incubación a 37 ° C en 5% de CO2 durante 30 min.
  2. Semilla 4 - 6 x 10 7 HBM-MNC por matraz y se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 durante 48 horas.
  3. Aspirar y desechar las células medianas y no adherentes de los matraces. Añadir 15 ml de DMEM / 10% Phab y se incuba a 37 ° Cen 5% de CO 2. Mantener los cultivos durante 6 - 8 días, cambiando el medio cada 48 horas.
    OPCIONAL: Para aumentar el rendimiento MPC, las células no adherentes de 2.3 podrían ser re-chapada en un nuevo frasco de cultivo y se mantienen como se describe para los cultivos primarios.
  4. Aspirar y descartar medio de los matraces, lavar con DMEM fresco y añadir 2 ml de solución de animales proteasa libre de desprendimiento. Se incuba a 37 ° C durante 5 - 15 min (evitar la incubación prolongada).
  5. Añadir 10 ml de DMEM fresco / 10% Phab, aspirar la suspensión de células y se centrifuga a 400 xg durante 5 min
  6. Aspirar y desechar el sobrenadante y volver a suspender sedimento en 1 - 2 ml de DMEM fresco / 10% Phab. Continúe con el recuento de células como se describe en el paso 1.10.
    NOTA: No utilice tripsina / EDTA como reactivo de desprendimiento. PSM son la tripsina resistentes. detección morfológica de las culturas, antes de la recolección de células, es muy recomendable con el fin de evaluar la presencia de células MSC-como en forma de huso. En caso considerable cantidad de células MSC-como son detected, aumentar la pureza del producto de células por la eliminación selectiva de las células contaminadas. Para ello, la digestión con tripsina se puede llevar a cabo antes de la recolección MPC, mediante la adición de 2 ml de tripsina / EDTA 0,05% durante 2 min. culturas de lavado dos veces con 5 ml de DMEM / 10% Phab, a continuación, proceder al tratamiento con proteasas que el anterior.

3. Caracterización de la célula

  1. Citometría de flujo
    1. Configurar las muestras duplicadas de 10 5 células recién desprendidas en la solución de lavado: D-PBS suplementado con 0,5% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,02% (w / v) de azida de sodio. Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
      PRECAUCIÓN: La azida sódica es tóxica.
    2. Vuelva a suspender gránulos en 200 l de solución de lavado y añadir anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 y anti-CD31 anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes ( "test"); en paralelo configurar los controles de isotipo ( "CTRL").
      NOTA: Las cantidades de tinción de anticuerpos deben determinarse mediante titulación o According con las instrucciones del fabricante.
    3. Incubar las muestras a 4 ° C durante 30 min.
    4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 500 l de solución de lavado y adquirir al menos 5 x 10 4 eventos en el flujo multicolor citómetro 7 9 10.
    5. Analizar los resultados de dot-parcelas y utilizar "CTRL" eventos registrados para establecer cuadrantes.
      NOTA: Con el fin de definir la cultura como la cultura MPC el porcentaje de CD73 CD90 neg neg células CD31 + CD45 + debe ser superior al 95%. Para algunas aplicaciones específicas, es decir, el análisis de la expresión génica, la recuperación de corte tiene que ser aumentado a 97-98%.
  2. la detección y el análisis de la organización nestin F-actina
    1. Placa recién aisladas PSM en portaobjetos de cámara de cultivo (20.000 / cm2). Permitir que las células se adhieren por incubación durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2.
    2. Lavar las células en la solución de lavado y fix en 4% (w / v) para-formaldehído a temperatura ambiente durante 15 min. Para retirar el fijador, añadir la solución de lavado, se incuba durante 2 minutos y se vierte.
    3. Repetir el lavado dos veces.
    4. Permeabilizar células en D-PBS suplementado con 0,05% (v / v) de Triton X-100 durante 15 min a RT.
    5. Se interrumpe la reacción por la proteína potenciador libre de señal (30 min a RT) o solución de bloqueo estándar (D-PBS suplementado con 3% (w / v) BSA).
    6. Retire mejorador de señal / solución de bloqueo.
    7. Añadir 7 g / ml (w / v) de anticuerpo primario anti-nestina humano y se incuba a 4 ° C durante la noche en una cámara humidificada. Al mismo tiempo, utilizar anticuerpos de control isotıpicos para evaluar las señales de fluorescencia no específicos.
    8. Lavado de los portaobjetos mediante la adición de D-PBS, dejar durante 2 minutos y se vierte. Repetir dos veces.
    9. Añadir 2 g / ml (w / v) de colorante fluorescente anticuerpo secundario conjugado y se incuba a 4 ° C durante 1 hora en la oscuridad.
    10. Lavar los portaobjetos que el anterior.
    11. Añadir faloidina fluorescente (5 UI / ml), dejar a temperatura ambiente durante 30 men en la oscuridad y lavar 3 veces en D-PBS.
    12. Retire las paredes de la cámara y montar diapositivas en medio de montaje acuoso suplementado con antifade reactivo y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la detección de núcleos. Proceder a la formación de imágenes 7 9 10.

4. Diferenciación de Mesengenic PSM

  1. Placa de 2 x 10 4 / cm2 PSM recién aisladas en frascos de cultivo T75 tratadas con TC y dejar que las células se adhieran durante la noche en DMEM / 10% Phab a 37 ° C en 5% de CO 2.
  2. Reemplazar DMEM / 10% Phab con medio de suero reducido estándar, alrededor de 200 l / cm 2, diseñado para la expansión de células mesenquimales del estroma (medio MSC-RS). Se cultivan las células hasta confluencia (P1-MSC), normalmente de 7 a 10 días después de la inducción. Refrescar el medio cada 2 días.
  3. Aspirar y descartar medio de los matraces, lavar con medio MSC-RS fresco y añadir 2 ml de solución de animales proteasa libre de desprendimiento. Incubar a 3776; C durante 5 - 15 min (evitar la incubación prolongada).
  4. Añadir 10 ml de medio de MSC-RS fresco, aspirar la suspensión de células y se centrifuga a 400 xg durante 5 min
  5. Aspirar el sobrenadante y resuspender pellet en 1 - 2 ml de medio MSC-RS fresco. Continúe con el recuento de células como se describe en el paso 1.10
  6. Proceder a la sub-cultura de ellos mediante la siembra de 3 - 5 de 10 x 3 células / cm2. Se cultivan las células a confluencia (P2-MSC).
  7. Las células de la cosecha por la digestión de la proteasa como se describe en el paso 4.3 al paso 4.5 y proceder a la caracterización como se describe en la sección 3.
    NOTA: Un porcentaje de células CD31 neg neg CD73 + CD90 + CD45 menor que 95% indicaría solamente la diferenciación parcial y requieren de un paso de cultivo más.
  8. Placa P2-MSC a 2 x 10 4 / cm2 en placas de seis pocillos tratados con TC y crecer hasta la confluencia en medio MSC-RS.
  9. Marque dos pozos como "No Dif" y refrescar medio MSC-RS.
  10. Marca de los dos, asís como "Osteo" y reemplazar medio con 200 l / cm 2 de medio osteogénico estándar, diseñado específicamente para la diferenciación de MSC.
  11. Marque dos pozos como "Adipo" y reemplazar medio con 200 l / cm2 de medio adipogénico estándar, diseñado específicamente para la diferenciación de MSC.
  12. Mantener los cultivos a 37 ° C en 5% de CO 2 al cambiar el conjunto de los medios de comunicación cada 48 horas.
    NOTA: Se recomienda utilizar los medios diferenciadores estándar disponibles comercialmente para la reproducibilidad de los ensayos. Después de 2/3 semanas bajo condiciones de diferenciación, los depósitos de calcio aparecen en las culturas osteogénicas inducida, mientras que la acumulación de lípidos intracelulares gotitas es evidente en las células adipogénicas inducida.
  13. Aspirar y descartar los medios de cultivo y luego se lavan con D-PBS.
  14. Fijar los cultivos mediante la adición de 1 ml de 4% (w / v) para-formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente.
  15. Para retirar el fijador añadir D-PBS, se incuban durante 2 minutos y se vierte. Repetir el lavadodos veces.
  16. Manchar uno "Sin Dif", junto con los dos "Osteo" marcó pozos en solución fluorescente específica hidroxiapatita y uno "Sin Dif", junto con los dos "Adipo" marcó pozos en 200 nM solución de Rojo Nilo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente 11,12.
  17. Retire las soluciones de tinción y lavar en D-PBS dos veces.
  18. Eliminar D-PBS, añadir D-PBS suplementado con 50% (v / v) de glicerina y proceder a la imagen 7 9 10.

5. MPC esferoide del brote Ensayo

  1. Para producir esferoides 3D, coloque 20 gotas l de suspensión recién aisladas MPC (1,5 x 10 4 células / gota) en la superficie interna de una tapa de placa de Petri.
    NOTA: Como gotas de manipulación podría conducir a su ruptura, es altamente recomendable para ponerlas en exceso.
  2. Con cuidado, usar la tapa para recapitular una placa de Petri que contiene D-PBS para evitar la evaporación cae colgante. Incubar a 37 ° C en 5% de CO 2durante la noche para permitir que las células se agregan en esferoides 3D.
  3. Establecer un gel espeso de las proteínas murinas matriz extracelular (ECM) mediante la adición de 300 ml de alícuotas de proteínas ECM estándar en una placa de cultivo de pre-refrigerada de 24 pocillos, y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos.
  4. incline con cuidado sobre la tapa placa de Petri y suavemente recoger los esferoides utilizando una pipeta Pasteur estéril.
  5. Coloque esferoides en el gel de proteínas ECM, añadir 700 ml de alícuotas de medio de crecimiento de células endoteliales VEGF-rica estándar e incubar a 37 ° C en 5% de CO 2.
  6. Después de 24 horas ya los 7 días de cultivo, tomar fotografías de las culturas 3D en una potencia de magnificación 4X. Evaluar la brotación de esferoides que aplican el software de análisis de imágenes mediante la medición de la distancia radial entre la última célula invasora y el borde esferoide. Repetir las medidas a lo largo de al menos 20 direcciones diferentes. La media distancia se considera como positiva cuando 50 micras o más.

Resultados

Las condiciones de cultivo selectivos descritos aquí han permitido el aislamiento de una población de células adherentes y casi monomórfica novela como 1,0% de la HBM-MNCs (0,5 a 2,0 x 10 6 HBM-MNCs a partir de 5 - 10 ml de las muestras de BM frescas) 5,6 . Se identificaron estos grandes (40 - 60 micras de diámetro), redondeado, células en reposo, Ki-67-negativos como PSM 5. Morfológicamente, se caracterizan por una forma de huevo frito distintivo con una región de núcleo de espesor, rodeado de una periferia plana delgada que muestra porciones de filopodios en mayor energía de la ampliación (flechas blancas en la Figura 1 A.1). Polar elongación del límite exterior de la célula se observa con frecuencia (flechas negras en la Figura 1 A.1). Tal morfología es claramente diferente de la apariencia típica en forma de huso-mesenquimal de células estromales reportado en cultivos de MSC estándar. La citometría de flujo mostró que más del 95% de los PSM recién aisladas para expresar CD31 y CD45, mientras que mesenchymal marcadores asociados CD90 y CD73 13 fueron indetectables (Figura 1 A.2). Consideramos que este conjunto restringido de cuatro antígenos como indicativo para los PSM. Otras características distintivas de PSM son la distribución de puntos F-actina revelando un número de estructuras podosome-como (rojo en la Figura 1 A.3) e intensa expresión de nestina (verde en la Figura 1 A.3), que no se detecta en las células tiñeron con anticuerpo de control isotípico (datos no mostrados).

PSM cultivo en medio estándar RS diseñados para MSC resultados de expansión en rápida diferenciación en células en crecimiento exponencial MSC-como (Figura 1) B.1. Después de dos pasajes células finalmente cambian su fenotipo de CD73 CD90 neg neg CD45 + CD31 + CD73 + CD90 al CD45 + CD31 neg neg (Figura 1 B.2). En el proceso, PSM re-organize F-actina en las fibras de estrés mientras que la expresión de nestina queda confinada a unas pocas células raras (Figura 1) B.3. MPC diferenciación en un fenotipo mesengenic MSC-como definitivo se produce a través de dos pasos distintos revelados por diferentes morfologías celulares. Después de una semana en un medio MSC RS una población residual de células MPC-como todavía se puede detectar una capa confluente de células multi-ramificados poligonales plano (P1-MSC en la Figura 2 A). Se requiere un paso más para obtener un cultivo casi monomórfica de células en forma de huso-MSC-como (P2-MSC en la Figura 2 A). Estas células de crecimiento exponencial se pueden diferenciar fácilmente en osteoblastos o adipocitos cuando se transfiere en medio selectivo durante al menos 2 semanas, lo que confirma su naturaleza MSC. En las culturas osteogénicas inducida, depósitos de calcio se pueden detectar por cualquiera de las colorimétrico mancha alizarina-S o colorantes fluorescentes específicos (verde en la Figura 2 B). Después las células de inducción adipogénicosmostrar la acumulación de gotas de lípidos según lo revelado por cualquiera colorimétrico Rojo Aceite o fluorescente tinción con Rojo Nilo (rojo en la Figura 2 B).

MPC tipificación fue confirmada por brotación ensayo de angiogénesis. PSM mostraron su capacidad de invadir (más de 50 micras) en gel de proteínas ECM murino de esferoides 3D después de 24 horas de VEGF-estímulo (Figura 2 C). Después se detectaron células invasoras de una semana a 300 - 600 Distancia al micras. Por el contrario, la capacidad de invasión se perdió en P2-MSC después de la diferenciación mesengenic (Figura 2 D).

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Figura 1. PSM recién aisladas tienen características distintivas. El cultivo HBM-MNC en DMEM / 10% Phab durante siete días da lugar a una población de PSM en reposo (A) fácilmente distinguibles de las MSC (B) en términos de morfología (A.1, B.1, barras de escala = 100 micras), el fenotipo (A.2, B.2), F-actina de distribución (rojo en A.3, B.3), y nestin expresión (verde en A.3, B.3, barras de escala = 20 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. PSM diferenciarse en MSC estándar y Mostrar Brote angiogénesis in vitro. La sustitución de DMEM / Phab con RS disponibles en el mercado medio diseñado para la expansión de MSC desencadena la inducción mesengenic del PSM. Después de una semana en cultivo unos PSM residuales son todavía detectable (P1-MSC), mientras que un paso más en medio MSC-RS conduce a una población de células confluentes MSC-como (P2-MSC, a barras de escala = 100 m). PAG2-MSC diferenciar terminal en osteocitos o adipocitos bajo estímulos apropiados según lo revelado por la deposición de calcio (verde en B) y la acumulación de gotas de lípidos (rojo en B, barras de escala = 200 m), respectivamente. PSM muestran surgimiento constante de esferoides en gel de proteínas ECM murino (C) a una diferencia con P2-MSC (D, barras de escala = 1,0 mm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En las últimas décadas, las MSC han sido ampliamente investigadas y evaluadas preclínicamente para su posible aplicación en el tratamiento de diversos trastornos óseos/articulares, inmunológicos, neurológicos, cardiovasculares, gastrointestinales y hematológicos14,15. El aislamiento fácil y económico de las MSC multipotentes, de muchos tejidos diferentes, junto con su falta de inmunogenicidad significativa16, contribuyen a hacer de estas células una de las poblaciones celulares más interesantes para ser aplicadas en terapias basadas en células. Sin embargo, la muy baja frecuencia en el tejido de origen representa una gran limitación para la aplicación de MSC en clínicas, forzando la expansión de estas células, in vitro, antes de la infusión o trasplante.

Los cultivos expandidos de MSC han revelado altos grados de heterogeneidad y variabilidad17-19 , lo que dificulta llegar a un consenso sobre los protocolos de producción y caracterización de MSC. Además, investigaciones recientes sugirieron la presencia de múltiples ancestros de MSC in vivo en una amplia gama de tejidos, lo que contribuye a la heterogeneidad del cultivo10,20. De hecho, se ha propuesto que condiciones particulares de cultivo posiblemente seleccionen o simplemente promuevan subpoblaciones específicas de progenitores de MSC presentes, en varios porcentajes, en muestras "crudas" y no procesadas como médula ósea (hBM-MNC) o tejidos adiposos (fracción vascular estromal)2. Por lo tanto, la variabilidad en las poblaciones celulares iniciadoras de MSC junto con la gran cantidad de diferentes protocolos de enriquecimiento/aislamiento y cultivo aplicados, representan un gran obstáculo para la definición de terapias factibles basadas en MSC.

Un factor crucial que afecta la heterogeneidad de los cultivos de MSC es la suplementación sérica21. En nuestras manos, el reemplazo de FBS con PhABS en cultivos primarios de hBM-MNC, combinado con la siembra de alta densidad en plásticos hidrofóbicos, condujo al aislamiento de una nueva población celular altamente adherente con características biológicas distintivas llamadas MPC5,6. Observamos que la adición de pequeños porcentajes de PhABS a los cultivos primarios de FBS también permitió el aislamiento de MPC, lo que sugiere la presencia de agentes inductores de MPC en el suero humano6. Por el momento, el protocolo de aislamiento/caracterización de MPC es un método único disponible para obtener MPC casi puros. El protocolo se ha ajustado cuidadosamente y es altamente reproducible para la detección de calidad de las preparaciones de MPC antes de futuras aplicaciones.

Los MPC podrían usarse como fuente para la producción de MSC, limitando así la variabilidad introducida por el uso de material de partida no fraccionado. La definición precisa de los múltiples pasos que caracterizan la diferenciación mesengénica de MPC reportada9 permitiría la expansión sincronizada de las células mesenquimales. Sin embargo, esta última condición podría realizarse exclusivamente aplicando poblaciones MPC altamente purificadas, como consecuencia de la caracterización de los productos celulares obtenidos por el protocolo aquí descrito, resultados de crucial importancia. Se ha informado que este método de aislamiento permite la recuperación de MPC con una pureza generalmente de alrededor del 95%. Sin embargo, la variabilidad donante/paciente junto con la variabilidad relacionada con los diferentes lotes de suero humano combinado aplicado, podría conducir a un porcentaje significativo de células similares a MSC coaisladas junto con MPC, en condiciones selectivas.

No está claro si estas células similares a MSC "contaminantes" podrían surgir de los otros progenitores in vivo diferentes descritos en la médula ósea22 o de la diferenciación MPC no controlada y espontánea. En cualquier caso, un porcentaje constante de células similares a MSC en los productos MPC anula la posibilidad de aplicar estas células como material de partida homogéneo para la expansión de MSC. Así, aquí se ha sugerido un método simple y económico, basado en la resistencia de MPC a la digestión de tripsina, aumentando la pureza de los productos MPC. Se podrían lograr resultados similares o incluso mejores en la purificación de cultivos MPC mediante la clasificación de células fluorescentes o magnéticas que realizan el agotamiento de CD73 y/o CD90, pero prolongando significativamente el tiempo del proceso y aumentando los costos.

Además, las MPC mostraron expresión de marcadores asociados a la pluripotencia y Nestin, todos perdidos rápidamente durante la diferenciación mesengénica7. El ensayo de germinación reveló la capacidad de MPC para invadir el gel de proteína ECM murino. En conjunto, estos resultados indican que las MPC deben considerarse un progenitor más inmaduro, que conserva el potencial angiogénico. No obstante, el entusiasmo inicial sobre el potencial de diferenciación mesodérmica de las MPC en realidad está disminuyendo. De hecho, después de más de 7 años de estudios sobre MPC, el potencial mesengénico y angiogénico se ha descrito ampliamente5-9, pero aún falta diferenciación hacia cualquier otra célula de origen mesodérmico. Así, aquí proponemos una nueva y más rigurosa definición de estas células como "Células Progenitoras Mesangiogénicas", manteniendo las siglas MPCs.

También creemos que la mayoría de las controversias sobre el potencial angiogénico de las MSC podrían estar relacionadas con la composición heterogénea de los cultivos expandidos que consisten en subpoblaciones de MPC y MSC en porcentajes variables23.

Finalmente, las MPC también podrían desempeñar un papel crucial para la implementación de CBMP aplicables para la reconstrucción de tejidos, ya que estas células también podrían apoyar la neovascularización. De hecho, los estudios futuros sobre regeneración deben tener en cuenta que el crecimiento tisular recién formado debe estar respaldado por la neoangiogénesis concomitante. La coexistencia de potencial mesengénico y angiogénico en las MPC podría mejorar significativamente el potencial de regeneración de nuevos enfoques terapéuticos que involucren estas células interesantes.

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer especialmente a Dr. Paolo Parchi, Departamento de Cirugía, Medicina y Patología Molecular y la Medicina de la Universidad de Pisa, para proporcionar muestras de médula ósea y su experiencia en la osteo-progenitores humanos

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matriz de membrana basal MatrigelBD Bioscience (San José, CA-EE. UU.)354230Proteínas ECM murinas
Concentración de stock: 100% (9 - 12 mg/ml)
Concentración final: 100%
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS)Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.)D8537
70 μ m FiltrosMiltenyi Biotec (BergischGladbach, Alemania)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare (Uppsala, Suecia)17-5442-03medio para centrifugación en gradiente de densidad discontinua
Suero humano combinado de tipo AB (PhABS)LONZA (Walkersville MD-USA)14-490EConcentración final: 10%
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA USA)35050-038L-glutamina estabilizada
Concentración de stock: 100x
Concentración final: 2 mM
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.)A8412Concentración de stock: 7.5%
Concentración final: 0.5%
Azida de sodioSigma (St. Louis, MO, USA)S8032Concentración final: 0.02%
Penicilina/estreptomicina (estreptococo de pluma)Gibco ( Grand Island, NY, EE. UU.)15070-063Antibióticos
Concentración de existencias: 5,000 UI/ml penicilina, 5,000 μ g/ml de estreptomicina
concentración final: 50 UI/ml de penicilina, 50 μ g/ml Matraz de cultivo de estreptomicina
T-75 para cultivos en suspensiónGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Alemania)658 190
Matraz de cultivo T-75 Tratado TCGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Alemania)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA USA)12563-011Solución de desprendimiento de proteasas sin animales
Concentración de stock: 1x
Concentración final: 1x
tripsina/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA USA)15400-054Libre de rojo fenol
Concentración de stock: 0.5%
Concentración final: 0.25%
anticuerpo anti-CD90 APC  (CD90)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-095-402Concentración final: 1:40
anticuerpo anti-CD45 APC-Vio770 (CD45)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-096-609Concentración final: 1:40
anticuerpo anti-CD73 PE (CD73)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-095-182Concentración final: 1:40
anti-CD31 PE Anticuerpo Vio-770 (CD31)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-105-260Concentración final: 1:40
Anticuerpo IgG1 APC de ratónMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-098-846Concentración final: 1:40
Ratón IgG2a APC Vio770 anticuerpoMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-096-637Concentración final: 1:40
Ratón IgG1 anticuerpo PEMiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Alemania)130-098-845Concentración final: 1:40
Ratón IgG1 PE Vio-770 anticuerpoMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-098-563Concentración final: 1:40
Glucosa baja Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)13-1331-82Libre de rojo de fenol medio esencial mínimo
Concentración de existencias: 1,000 mg / L de glucosa
Suero fetal bovino  (FBS)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)10500Concentración de stock: 0.2 mg / ml
Concentración final: 2 μ g/ml
Reactivo antidecoloración Prolong Gold con 4',6-diamidino-2-fenilindolInvitrogen (Waltham, MA,  EE. UU.)P-36931Medio de montaje acuoso + DAPI
Concentración final: 1x
ParaformaldehídoSigma (St. Louis, MO, EE. UU.)P6148Fijador
Concentración final: 4%
Portaobjetos de cámara de dos pocillos LAB-TEKSigma (St. Louis, MO, EE. UU.)C6682
Anticuerpo anti-nestina [clon 10C2]Abcam (Cambridge, Reino Unido)ab2035Concentración de existencias: 1 mg/ml
Concentración final: 7 μ g/ml
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermoFisher (Waltham,  MA USA)A34055Concentración de existencias: 200 UI/ml
Concentración final: 5 UI/ml
Triton X-100Euroclone (Milán, Italia)EMR237500Concentración final: 0,05%
MesenPRO RS Medium  (Medio MSC-RS)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)12746-012
Alexa Fluor 488 kit SFX anti-ratónThermoFisher (Waltham,  MA USA)A31619Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra + Potenciador de señales
Concentración de stock: 2 mg/ml
Concentración final: 2 μ g/ml
Pipeta Pasteur KartellLabware  (Noviglio (MI), ITALIA )329
StemMACS AdipoDiff  MediosMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  MediosMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemania)130-091-678
Osteoimage Ensayo de mineralización óseaLONZA (Walkersville MD-USA)PA-1503Solución de tinción fluorescente específica de hidroxiapatita
50 ml Tubo cónico de poliestirenoGreiner bio-one (Kremsmü nster
Austria)		227261
Nilo RedThermoFisher (Waltham,  MA USA)N1142Solución de tinción fluorescente para lípidos
Concentración de stock: 100 mM
Concentración final: 200 nm
GlicerinaSigma (St. Louis, MO, EE. UU.)G2289Concentración final: 50%
Placas de Petri de poliestirenoSigma (St. Louis, MO, EE. UU.)P5606
Placas de 24 pocillos tratadas con TCGreiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Alemania)662160
Medio de crecimiento endotelial, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)LONZA (Walkersville, MD-EE.UU.)CC-3162Medio de crecimiento de células endoteliales rico en VEGF
Software de análisis de imágenes Leica Qwin Leica(Wetzlar, Alemania)Software de análisis de imágenes

Referencias

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