Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.
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Artículo de método
La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada
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Resumen
Resumen
Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Para el inicio de los experimentos, los monocitos frescos o congelados se cultivan en matraces durante 1 semana con M-CSF para inducir su diferenciación en macrófagos. Luego, los macrófagos se pueden cosechar y sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos. El uso de un número definido de macrófagos en lugar de un número definido de monocitos para iniciar cultivos de macrófagos para experimentos produce cultivos de macrófagos en los que la densidad celular deseada se puede lograr de manera más consistente. El uso de monocitos criopreservados reduce la dependencia de la disponibilidad del donante y produce cultivos de macrófagos más homogéneos.
Introducción
El estudio de macrófagos cultivados es un modelo útil para comprender la función de estas células en la inflamación, tal como ocurre en las placas ateroscleróticas. Cuando la investigación se centra en enfermedades humanas que afectan a los macrófagos, es útil estudiar los macrófagos humanos primarios en lugar de los macrófagos no humanos para evitar diferencias entre especies. Además, los efectos de la transformación celular se pueden evitar mediante el uso de macrófagos primarios en lugar de líneas celulares de macrófagos. Para ello, los macrófagos diferenciados de los monocitos aislados de la sangre humana sirven como medio para obtener macrófagos humanos primarios.
Los macrófagos tisulares pueden residir dentro de los tejidos o pueden derivarse de monocitos que migran al tejido y se diferencian en macrófagos 1. Se han definido dos tipos de macrófagos derivados de monocitos humanos que difieren no solo en la morfología, sino también en la expresión génica y la función celular 2. Estos dos tipos se obtienen a partir de monocitos que se diferencian en macrófagos en presencia de M-CSF + suero fetal bovino (FBS) y monocitos que se diferencian en macrófagos en presencia de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) + FBS 2-6. En nuestra experiencia (observación no publicada), el uso de suero humano en lugar de FBS genera el tipo GM-CSF, independientemente de si M-CSF o GM-CSF se incluyen en el medio de diferenciación. Los macrófagos de tipo M-CSF tienden a ser más alargados que los macrófagos de tipo GM-CSF, que se asemejan a los huevos fritos en su morfología. Los investigadores deben reconocer que los macrófagos derivados de monocitos M-CSF y GM-CSF humanos no son lo mismo que los llamados macrófagos derivados de la médula ósea de ratón M1 y M2 6.
Durante la investigación utilizando macrófagos diferenciados M-CSF derivados de monocitos humanos, experimentamos dificultades relacionadas con la disponibilidad de monocitos para iniciar experimentos y la variación en las densidades celulares obtenidas de macrófagos durante la diferenciación de monocitos en macrófagos. Para superar estos problemas, hemos desarrollado el siguiente protocolo en el que los monocitos se congelan hasta que se requiere su uso, y los monocitos se diferencian a granel en macrófagos que luego se pueden eliminar de los matraces de cultivo y sembrar a las densidades celulares deseadas para obtener cultivos más uniformes de un experimento a otro.
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Protocolo
Leucoféresis se llevó a cabo bajo el protocolo de investigación de un sujeto humano aprobado por los Institutos Nacionales de Salud junta de revisión institucional.
1. Aislamiento y la criopreservación de los monocitos
- Obtener células mononucleares por leucoféresis de donantes humanos, y enriquecer los monocitos por centrifugación de contracorriente continua de elutriación de las células mononucleares tal como se describe en las referencias 7,8. Obtener aproximadamente 100 x 10 6 células elutriated (aproximadamente 80 - 90% monocitos) en tampón de elutriación especificado por el fabricante. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
- monocitos de centrífuga en un tubo de polipropileno de 15 ml a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en FBS seguido de sulfóxido de dimetilo para lograr una concentración final de 90% de FBS / 10% de dimetilsulfóxido y 50 x 10 6 células / ml.
- Añadir cada ml de suspensión de células to un criovial individual.
- Coloque los crioviales en un recipiente de congelación de células y la transferencia a un congelador a -80ºC durante 24 horas antes de transferir a un tanque de almacenamiento criovial nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
2. La diferenciación de monocitos en macrófagos
- Descongelar un criovial de las células mediante la transferencia rápidamente a un baño de agua C 37 ° y luego retirar inmediatamente cuando la suspensión de células se ha descongelado sobre 70%.
- Inmediatamente después de la descongelación completa a temperatura ambiente, transferir 1 ml contenidos criovial en 50 ml de 37 ° C se calentó Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleucina-10 (IL-10), y 10% de FBS (medio completo).
- 25 ml de la suspensión de monocitos en cada uno de dos 75 cm 2 frascos de cultivo celular de plástico.
- Incubar culturas en un 37 ° C incubadora de cultivo de células con 5% de CO2 / 95% de aire durante 48 hr.
- Enjuague el cultures 3 veces con 10 ml de medio RPMI 1640 (pre-calentado a 37 ° C), eliminando suavemente el medio de cultivo para evitar que se desprenda cualquier célula poco adheridas.
- Tras el aclarado, se añade medio completo fresco, el cambio de medio cada 2 días hasta que los monocitos se diferencian y proliferan suficientemente para convertirse en confluentes. Esto requiere aproximadamente una semana de cultivo.
3. Los macrófagos de cosecha para iniciar experimentos
- Enjuague los macrófagos diferenciados en un matraz de 3 veces con 10 ml de pre-calentado solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 37 ° C sin Ca 2+ y Mg 2+ antes de añadir 10 ml de solución de pre-calentado (EDTA) 37 ° C 0,25% de ácido etilendiaminotetraacético tripsina.
- Place matraz en una incubadora de cultivo celular durante 10 - 15 min, en cuyo momento aproximadamente 90% de los macrófagos debería haber redondeado y distante. Verificar esta por examen microscópico del matraz.
- Añadir 10 ml de RPMI 1640 que contiene 10% de FBS a sla parte superior de la tripsinización.
- Transferir la suspensión celular de macrófagos del matraz en un tubo de 50 ml de polipropileno, de centrifugación 300 xg durante 5 min, y descartar el sobrenadante.
- resuspender suavemente los macrófagos en 1 ml de medio completo.
- Mezclar 10 l de suspensión celular de macrófagos con 10 l solución de azul de tripano y determinar el número de células de macrófagos y la viabilidad (típicamente> 95%) utilizando un hemocitómetro.
- Basado en el número de células (por lo general alrededor de 15 - 18 x 10 5 macrófagos), añadir medio completo adicional para alcanzar la densidad celular de siembra deseada. Nota: 1 x 10 5 macrófagos en 1,5 ml de medio por pocillo de una placa de 12 pocillos producirá una cultura casi confluentes.
- Después de la siembra, incubar los macrófagos durante la noche en un 37 ° C incubadora de cultivo celular con 5% de aire de CO2 / 95% para permitir la unión celular. A continuación, iniciar los experimentos deseados.
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Resultados
La viabilidad de los monocitos frescos o crioconservados era mayor que 95% según se determinó con azul de tripano tinción 9. Figura 1 y la Figura 2 compara a aumentos inferiores y superiores, respectivamente, el progreso de frescos y criopreservados (es decir, congelada) diferenciación de los monocitos en macrófagos. Tenga en cuenta que la fresca en comparación con los monocitos criopreservados muestran una subpoblaci...
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Discusión
La generación de los tipos definidos de macrófagos puede aclarar algunos de los resultados contradictorios obtenidos por los investigadores en el estudio de la biología de los macrófagos. El uso de varias condiciones de cultivo y los factores de diferenciación para generar los macrófagos humanos primarios pueden conducir a muy diferentes tipos de macrófagos, un hecho que no se puede apreciar por el investigador. Por ejemplo, los macrófagos a veces se generan a partir de monocitos humanos usando no suero, suero humano so...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El Departamento de Medicina Transfusional, Centro Clínico, Institutos Nacionales de Salud, proporcionó monocitos elutriados. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros, Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo Cellbind de 12 pocillos | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, matraz T-75, tratamiento para cultivo de tejidos | Greiner Bio-One North America 658157 | ||
| RPMI 1640 medio de cultivo | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | calentado a 37 ° C |
| L-Glutamina | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Criovial | Thermo Scientific | ||
| DPBS sin Ca2+ y Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Tubo cónico de polipropileno de 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Hemocitómetro de luz brillante mejorado Neubauer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html | |
| Congelación celular CoolCell LX contenedor | BioCision | BCS-405 | otros contenedores de congelación también deberían ser adecuados para este paso |
| Sistema de almacenamiento de nitrógeno líquido, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | Cualquier tanque de nitrógeno líquido debe ser adecuado |
Referencias
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
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