Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Resumen

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Resumen

Creciente evidencia indica que la hematopoyesis normal está regulada por distintas señales microambiental en el BM, que incluyen nichos celulares especializadas modulación crítica de células madre hematopoyéticas (HSC) funciones^1,2. De hecho, un cuadro más detallado del microambiente hematopoyético ahora surge, en el cual los endoóseos y los nichos endoteliales forman unidades funcionales para la regulación de HSC normal y su progenie^3,4,5 . Nuevos estudios han revelado la importancia de las células perivasculares, adipocitos y células neuronales en el mantenimiento y regulación de la función HSC^6,7,8. Además, hay evidencias de que células de diferentes linajes, es decir, las células mieloides y linfoides, hogar y residen en nichos específicos dentro del microambiente de BM. Sin embargo, una asignación completa del microambiente del BM y de sus ocupantes aún está en progreso.

Cepas de ratón transgénico que expresan marcadores fluorescentes específicos de linaje o ratones genéticamente modificados para carecer de las moléculas en células específicas del nicho BM están ahora disponibles. Knock-out y linaje seguimiento de modelos, en combinación con métodos de trasplante, proporcionan la oportunidad de perfeccionar el conocimiento sobre el papel de específicas "niche" células para poblaciones hematopoyéticas definidas como HSC, de células B, células T, células mieloides y células eritroides. Esta estrategia puede ser potenciada aún más combinando el uso de la microscopía de dos fotones de la bóveda craneal. Proporcionando en vivo imágenes de alta resolución y 3D Render de la bóveda de BM, ahora podemos determinar precisamente el lugar donde subconjuntos hematopoyéticos específicos Inicio en el BM y evaluar la cinética de su expansión en el tiempo. Aquí, Lys-GFP ratones transgénicos (marcando las células mieloides)⁹ y RBPJ ratones knock-out (falta de señalización de Notch canónica)¹⁰ se utilizan en combinación con IVFM determinar el engraftment de células mieloides en un microambiente de BM defectuoso de muesca.

Introducción

La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm¹¹. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.

Trabajos recientes de nuestro grupo demo....

Protocolo

Se realizaron todos los procedimientos que implican el uso de animales con autorización de cuidado Animal y Use Comité de Indiana University School of Medicine. Asegurar que se adhieran a la legislación sobre experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.

1. preparación de Mx1CreRBPJ^{- / -} ratones receptores

1. Cruzar ratones RBPJ^lox/lox ratones¹⁰ para obtener Cre Mx1 Mx1-Cre⁺ positivo ^RBPJlox/lox ratones¹² y Mx1-Cre negativo hermanos de camada de^lox/lox RBPJ utilizar como controles. Verifique que ....

Resultados

Cohortes de 2 RBPJKO y 2 RBPJWT beneficiarios se reflejada en una sesión de imágenes individual en diferentes puntos temporales: 24 h y 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de las células del BM Lys-GFP (flujo de trabajo se ilustra en la figura 1A).

En cada ratón, se adquirieron imágenes de 6 regiones estándar de la bóveda de la BM, identificados por su posición en relación con la bifurcación de la vena centr.......

Discusión

Este protocolo describe un diseño optimizado para estudiar la cinética del engraftment de células hematopoyéticas por microscopia Intravital de fluorescentes. En este estudio, la expansión de las células progenitoras mieloides en un BM de WT o en una muesca señalización defectuosa BM fue localizada en la bóveda ósea por células mieloides positivas siguientes de Lys-GFP después de BMT en recipientes RBPJWT o RBPJKO. Este enfoque se propone como un modelo que puede aplicarse para responder preguntas similares, por ejemplo:.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cóctel de ketamina	IU Facultad de Medicina		Ketamina 90-100 mg/kg, Xilacina 2,5-5,0 mg/kg, Acepromazina 1,0-2,5 mg/kg
TRITC dextrano	Tdb Consultancy	TD150-100mg	puede utilizar otro color.
Recortadora de pelo Andis	Braintree Scientific	CLP-323 75
Esponja de gasa	Med Vet International	PK224	4 capas, 2 x 2
Crema depilatoria Nair Tienda
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Cloruro de sodio frasco de polietileno
Jeringa de insulina	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Pinzas finas	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	pinza recta, pinza angular
Tijera	Fine Science Tools	15018-10
Portaagujas	Fine Science Tools	12002-14
5-0 sutura de seda	Fisher Scientific	MV-682	Se pueden utilizar otras suturas no absorbibles
WillCo- plato con fondo de vidrio	WillCo	GWSt-5040
Aceite de microscopio óptico	Leica
Inserto de platina estereotáxica	Escuela de Medicina de IU	Diseño personalizado
Sistema de microscopio confocal Olympus FV1000	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objetivo	Almohadilla
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Imaris 8.1 software de imagen	Bitplane		3/4 D Software de visualización y análisis de imágenes

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