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Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

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DOI:

10.3791/54255

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12 de agosto de 2016

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1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

En este artículo

Resumen

Los monocitos son componentes integrales del sistema inmune innato humano que dependen del metabolismo glucolítico cuando se activan. Describimos un protocolo de citometría de flujo para medir la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa por monocitos totales y subpoblaciones de monocitos en sangre total fresca.

Resumen

Los monocitos son células inmunes innatas que se pueden activar por patógenos y la inflamación asociados con ciertas enfermedades inflamatorias crónicas. La activación de monocitos induce funciones efectoras y un cambio concomitante de oxidativo con el metabolismo glicolítico que se acompaña de aumento de la expresión del transportador de glucosa. Este aumento del metabolismo glicolítico se observa también para la inmunidad entrenado de los monocitos, una forma de memoria inmunológica innata. Aunque se han descrito los protocolos in vitro que examinan la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos, ninguno ha sido examinado por el flujo multi-paramétrico citometría en la sangre entera. Se describe un protocolo de citometría de flujo multiparamétrica para la medición de la absorción de glucosa análogo 2-NBDG fluorescente en sangre entera por los monocitos totales y la clásica (CD14 ++ CD16 -), intermedio (CD14 ++ CD16 +) y no clásica ( CD14 + CD16 ++) monocitossubpoblaciones. Este método se puede utilizar para examinar la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa para los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria, y se puede modificar fácilmente para examinar la captación de glucosa para otros leucocitos y subpoblaciones de leucocitos en la sangre.

Introducción

Los monocitos son un componente importante del sistema inmunitario innato humano que se movilizó rápidamente a los sitios de infección e inflamación 1. La activación de los monocitos es crítico para limitar los daños por patógenos aguda y también es central en la patogénesis de varias enfermedades crónicas, incluyendo la aterosclerosis 2, cáncer de 3, y el VIH 4,5.

El metabolismo de reposo y monocitos activados difiere drásticamente, con monocitos en reposo que utilizan el metabolismo oxidativo y monocitos activados que utilizan el metabolismo glucolítico (es decir, la fermentación de la glucosa a lactato) 6. La activación de los monocitos induce la expresión de los transportadores de glucosa que permite un aumento de la captación de glucosa para el metabolismo glucolítico 7. glucosa monocitos transportador 1 (Glut1) es uno de esos transportador upregulated durante la activación y su expresión se ha demostrado que conducen a la producción de citoquinas pro-inflamatorias en vitro y en el tejido adiposo de ratones obesos 8. La infección de una línea celular de monocitos por el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi conduce a la regulación positiva celular de Glut1 9, y recientemente hemos demostrado que durante la infección crónica por el VIH un aumento del porcentaje de monocitos que expresan GLUT1 están presentes durante la infección terapia antirretroviral tratados y sin tratar 10 de combinación. Tomados en conjunto, estos estudios demuestran que la captación de glucosa y el metabolismo glicolítico por los monocitos son aspectos importantes de muchas enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, un método simple para medir la expresión Glut1 de monocitos y la captación de glucosa durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria es probable que sea de utilidad para una amplia gama de investigadores.

Los monocitos humanos son heterogéneos, que se compone de tres subconjuntos distintos que se pueden examinar por la expresión diferencial de la CD14 y marcadores de superficie celular CD16 11,12. monocitos clásicas expresan un alto nivel de CD14 pero no expresan CD16 (CD14 CD16 ++ -), monocitos intermedios expresan un alto nivel de CD14 y un nivel intermedio de CD16 (CD14 ++ CD16 +), y no clásica monocitos expresan un bajo nivel de CD14 y un alto nivel de CD16 (CD14 + CD16 ++). Los monocitos que expresan CD16 se denominan monocitos CD16 +, que compararon a CD16 - monocitos tienen una alta expresión de citoquinas inflamatorias y la capacidad de forma más efectiva presentan antígenos 13,14. Aproximadamente el 10% de los monocitos expresan CD16 durante homeostasis con porcentajes más altos observados durante la inflamación 15. Subpoblaciones de monocitos están asociados con ciertos estados de enfermedad y podrían ser marcadores biológicos útiles de progresión de la enfermedad y la enfermedad 16.

Nuestro objetivo era identificar un método que puede medir la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos humanos y subpoblaciones de monocitos en condiciones lo más cercanas a phycondiciones siological como sea posible. Estudios anteriores miden la expresión del transportador de glucosa de monocitos y la captación de glucosa 17,18, aunque estos métodos examinados monocitos aislados que pueden haber alterado la expresión de proteínas en comparación con las condiciones fisiológicas 19, y ningún estudio previo ha examinado las subpoblaciones de monocitos humanos. El uso de flujo multi-paramétrico citometría, se describe un método para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción del análogo de la glucosa fluorescente 2-NBDG por los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos (basado en CD14 y la expresión de CD16) dentro de la sangre no manipulada conjunto.

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Protocolo

NOTA: infectados por el VIH y los sujetos no infectados por VIH fueron reclutados de la Unidad de Enfermedades Infecciosas en el Hospital Alfred en Melbourne, VIC, Australia, y de la comunidad local, respectivamente. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes, y la investigación fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Hospital Alfred.

1. Glut1 Detección de la superficie celular en monocitos y monocitos subpoblaciones

  1. Recoger la sangre en tubos anticoagulantes de citrato ACD-B y comenzar los experimentos en una cabina de seguridad biológica dentro de 1 hora de recogida.
  2. Añadir 100 ml de sangre a tubos de polipropileno. Añadir 2 ml de solución de lisis 1x (véase la Tabla de Materiales) a los tubos, mientras que en el hielo, pipeteado suavemente para mezclar. Incubar durante 15 minutos en hielo. Centrifugar a 220 xg durante 5 min.
  3. Decantar y lavar dos veces mediante la adición de aproximadamente 2-4 ml de solución de lavado (0,5% de BSA en PBS 1x) y centrifugación a 220 xg durante 5 min.
  4. Use un tuboTTE para eliminar cuidadosamente como gran parte de la solución de lavado como sea posible. Se colocan los tubos en hielo y volver a suspender en 100 l de solución de lavado.
  5. Para identificar las subpoblaciones de monocitos específicos tiñen las células con el siguiente volumen de anticuerpos por cada 100 l de suspensión celular preparada en el paso 1.4: 5 l anti-CD3-PE, 5 l anti-CD14-APC, 5 l anti-CD16-PECy7, 5 l Glut1 FITC o IgG2b-FITC (tubo de control de isotipo).
  6. Colocar en hielo durante 30 min en la oscuridad. Lavar 2 veces con solución de lavado. Fijar con 200-300 l de formaldehído al 0,5% en PBS 1x hecho.
  7. El análisis en un citómetro de flujo capaz de detectar 4 colores dentro de las 24 horas dentro de la siguiente onda de excitación y emisión: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. la captación de glucosa por los monocitos

  1. Pipeta 90 l de sangre recogida en el paso 1.1 en tubos de polipropileno. Añadir 10 l de una solución de trabajo de 14.60 M-2 a NBDGlos 90 l de sangre (1,46 mM concentración final) y golpee suavemente para mezclar. Es crítico para limitar 2-NBDG exposición a la luz cubriendo tubos con papel de aluminio.
  2. Se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 15-30 minutos y luego se coloca inmediatamente en hielo. Añadir 4 ml de 1x FACS solución a tubos de lisis, mientras que en hielo. Centrifugar a 220 xga 4 ° C durante 5 min.
  3. Lavar una vez mediante la adición de 4 ml de solución de lavado (0,5% de BSA en PBS 1x). Centrifugar a 220 xga 4 ° C durante 5 min. Se decanta y el lugar en el hielo.
  4. Las células se tiñen con anticuerpos: 5 l anti-CD3-PE, 5 l anti-CD14-APC y 5 l anti-CD16-PECy7. Mezclar y colocar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
    NOTA: Durante este período asegúrese de que el citómetro de flujo está listo para su análisis inmediato. Adquirir las células dentro de la siguiente onda de excitación y emisión: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Se añaden 4 ml de tampón de lavado helado (0,5% de BSA en PBS 1x) a los tubos.Lavar una vez por centrifugación a 220 xg en 4 ° C durante 5 min. Se decanta y se añade 200-300 l de hielo de edad PBS y mantener en hielo en la oscuridad (cubierto con papel de aluminio). El análisis en un citómetro de flujo dentro de los 10 minutos utilizando la excitación y la configuración de onda de emisión como en el paso 2.4.

3. Adquisición y Análisis de Datos

NOTA: Se asume que un conocimiento de la citometría de flujo y análisis de datos.

  1. El uso de un citómetro de flujo capaz de análisis de al menos 4-color, ajustar la compensación utilizando muestras no teñidas y se tiñeron de forma individual.
    NOTA: tinción única utilizando una CD4 marcado con FITC y CD14 puede ser utilizado para Glut1 y compensación 2-NBDG.
  2. Configurar y etiquetar las ventanas apropiadas antes de la adquisición de muestras. Dibuje una puerta alrededor de la población de monocitos, y adquirir 100.000 y 300.000 eventos por muestra a tipo de medio. 50.000 eventos por muestra de compensación es suficiente.
    NOTA: La compensación puede ser llevada a cabo antes de probaradquisición o en el software solo análisis celular, siguiendo los procedimientos estándar.
  3. Exportar y guardar los datos en un lugar adecuado. Abre el software de análisis único de células tales como FlowJo u otro software de análisis (Adicional Figura 1) y las muestras de arrastrar y soltar como se especifica (Adicional Figura 2).
  4. Haga doble clic para abrir el archivo (Adicional Figura 3). Dibujar un círculo con los monocitos basa en la cara y las propiedades de dispersión de lado como se muestra en la Figura 1A y Figura Adicional 4 puerta. Doble clic en la población de monocitos. Observar y dibujar un cuadro alrededor del CD3 - población (Adicional Figura 4).
  5. Doble clic en el CD3 - población. Para observar las subpoblaciones de monocitos CD14-APC seleccionar en el eje 'x', y CD16-PECy7 en el eje 'y'-, y la etiqueta en consecuencia (Adicional Figura 5).
  6. Donde no hay diferenciapoblaciones positivas y negativas, medir la expresión de Glut1 o captación 2-NBDG en las subpoblaciones de monocitos específicos. Determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI) de Glut1 y 2-NBDG restando el isotipo y sin fondo 2-NBDG (Adicional Figura 6).
  7. Cuando existan poblaciones definidas, utilice el IgG2b-FITC para establecer la puerta, y determinar las células positivas porcentuales (Figura 3).
    NOTA: Utilice este procedimiento para analizar los monocitos CD14 + totales. Ya que la captación de 2 NBDG suele estar marcada por un cambio en la intensidad de fluorescencia de los datos está mejor representado por las IFM y los histogramas.

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Resultados

La compensación debe ser realizada por fluorocromos individuales para prevenir las fluorescencias. Los monocitos son primero enriquecidas mediante la selección sobre la base de dispersión frontal y lateral. Las parcelas presentados son representantes de al menos seis experimentos independientes llevados a cabo en toda la sangre de seis o más participantes como se informó anteriormente 10 La figura 1A muestra la gating inicial de los monocitos por dispersión ce...

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Discusión

El protocolo descrito aquí detalla un método simple para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa análogo fluorescente por monocitos y monocitos subpoblaciones en la sangre entera. Mediante la evaluación de la captación de 2-NBDG en sangre entera, esta técnica permite condiciones similares a las in vivo. Un estudio anterior examinó 6-NBDG captación en monocitos resultantes de la separación por centrifugación de densidad 17. Sin embargo, este estudio no examinó las ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Centro Australiano para el VIH y la hepatitis Virología Investigación (ACH 2) y una subvención del desarrollo 2010 (CNIHR) de la Universidad de Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programa financiado por el NIH con el número premio AI027757 que se apoya por el siguiente NIH Institutos y Centros (NIAID, NCI, NIMH, el NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP es un receptor de la subvención 2 CNIHR y ACH. SMC es un receptor de un Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación de Australia (NHMRC) Principal beca de investigación. Los autores agradecen la contribución a este trabajo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa Victorian recibida por el Instituto Burnet. Reconocemos la ayuda de Geza Paukovic y Eva Orlowski-Oliver de la Facilidad AMREP Citometría de Flujo Core para citometría de flujo capacitación y asesoría técnica. Agradecemos a Angus Morgan para el entrenamiento y la organización de la sesión de vídeo medios de comunicación. nuestro agradecimientoa Jesse Masson y Jehad Abdulaziz K. Alzahrani para la asistencia de laboratorio durante la filmación del video. Damos las gracias a los esfuerzos del Dr. David Simar de la Facultad de Ciencias Médicas, UNSW, Australia que ofrecieron asesoramiento metodológico crítico. CSP quisiera agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.

CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES:

CSP concibió el proyecto, diseñó y llevó a cabo experimentos, analizado e interpretado los datos, y escribió el manuscrito. JJA interpreta los datos y escribió el manuscrito. TRB escribió el manuscrito. JMM interpretado los datos, hizo sugerencias intelectuales críticos, y revisó el manuscrito. SMC interpretado los datos, hizo sugerencias intelectuales críticos y revisó el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
VACUETT Tubo 9 ml Tubos anticoagulantes ACD-BGreiner Bio-One GmbH455094
polipropilenoBD Biosciences352063
Albúmina de suero bovino (BSA)Sigma-AldrichA7906
Solución de formaldehído al 16%Microscopía electrónica Science15710
BD FACS solución de lisado (10x)BD Biosciences349202Solución de lisis BD FACS diluida 1/10 con agua desionizada para la concentración de trabajo (almacenar hasta 1 semana a 4 & °; C)
anti-CD3-PEBD Biosciences555340
anti CD14-APCBD Biosciences555399
anti-CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR & D SystemsFAB1418F
IgG2b-FITCR & D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN13195Suspenda 5 mg de 2-NBDG en 1 ml de agua desionizada para hacer una solución madre de 14,60 mM (mantener hasta 6 meses a 4 & deg; C). Para hacer la concentración de trabajo 2-NBDG, diluya el material 1/100 con 1x DPBS. Cubra con papel de aluminio. (almacene hasta por 1 semana a 4 & grados; C)
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (1x)Life technologies14190-144Para hacer la solución de lavado, agregue 0,5 g de BSA por 100 ml de DPBS (almacene hasta por 2 semanas a 4 & deg; C)
5 ml tubos estériles de

Referencias

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