El propósito de este manuscrito es presentar un método para medir la fagocitosis de monocitos y granulocitos y la actividad de estallido oxidativo en muestras de sangre humana.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana
En este artículo
Resumen
Resumen
El ensayo de fagocitosis de granulocitos y monocitos y actividad de estallido oxidativo (OB) se puede utilizar para estudiar el sistema inmune innato. Este manuscrito proporciona la metodología necesaria para añadir este ensayo a un arsenal de inmunología del ejercicio. El primer paso en este ensayo es preparar dos alícuotas ("H" y "F") de sangre total (heparina). Luego, se agrega dihidroetidio a la alícuota de H, y ambas alícuotas se incuban en un baño de agua tibia seguido de un baño de agua fría. A continuación, se añade Staphylococcus aureus (S. aureus) a la alícuota H y S. aureus marcado con isotiocianato de fluoresceína a la alícuota F (bacteria:fagocito = 8:1), y ambas alícuotas se incuban en un baño de agua tibia seguido de un baño de agua fría. Luego, se agrega azul de tripano a cada alícuota para apagar la fluorescencia extracelular y las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se lisan los glóbulos rojos y se fijan los glóbulos blancos. Por último, se utiliza un citómetro de flujo y un software de análisis adecuado para medir la fagocitosis de granulocitos y monocitos y la actividad de OB. Este ensayo se ha utilizado durante más de 20 años. Después de un esfuerzo intenso y prolongado, los atletas experimentan un aumento significativo pero transitorio de la fagocitosis y una disminución prolongada de la actividad obstétrica. El aumento de la fagocitosis después del ejercicio se correlaciona con la inflamación. A diferencia de los individuos de peso normal, la fagocitosis de granulocitos y monocitos está crónicamente elevada en los participantes con sobrepeso y obesidad, y se correlaciona modestamente con la proteína C reactiva. En resumen, este ensayo basado en citometría de flujo mide la fagocitosis y la actividad OB de los fagocitos y se puede utilizar como una medida adicional de la inflamación inducida por el ejercicio y la obesidad.
Introducción
El granulocitos y monocitos fagocitosis / explosión oxidativa (OB) ensayo de actividad es una técnica simple y directa que se utiliza con frecuencia para reunir información acerca de la función inmune innata después de un ejercicio prolongado e intensivo. 1-4 Al estudiar la respuesta del sistema inmune a un estímulo, los granulocitos y los monocitos son de particular interés, ya que juegan un papel central en la defensa del huésped y son las primeras células inmunes a acumularse en el sitio de infección. 5 neutrófilos, un tipo de granulocitos, son las primeras células de translocación de en el músculo dañado de tejidos después de un eje....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos de recolección de sangre se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por la Universidad Estatal de los Apalaches (ASU) Junta de Revisión Institucional (IRB).
1. Preparación Ensayo
- Reunir, preparar y organizar los materiales especificados para el procedimiento (por favor refiérase a la Tabla de materiales específicos / Equipo).
- Etiquetar los tubos de 12 x 75 mm.
- Etiqueta de dos tubos para cada participante: un tubo para el ensayo de fagocitosis (etiquetar este tubo con tinta negro y una "F" para isotiocianato de fluoresceína [FITC]) y un tubo para el ensayo de a....
- Etiquetar los tubos de 12 x 75 mm.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
ejercicio prolongado e intensivo tiene profundos efectos en la función inmune innata, incluyendo función natural killer celular, la respuesta de macrófagos mediada por citoquinas a la infección viral, y de granulocitos y la fagocitosis de monocitos y la actividad OB. Múltiples estudios indican que los granulocitos y monocitos fagocitosis aumenta significativamente después del ejercicio, lo que refleja la inflamación inducida por el daño muscular y las demandas metabólicas. En contraste, .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para la determinación de dos indicadores de granulocitos y la función de monocitos. Hemos identificado algunos pasos que son críticos para el éxito de este ensayo. Una de estas medidas es la incubación baño de hielo que se produce inmediatamente antes de la adición de bacterias. enfriamiento a fondo de todas las muestras minimizará el efecto de la temperatura sobre la actividad de fagocitosis y OB. Otro paso crítico es la adición de las bacterias a cada muestra. Un 8:.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer Zack Shue, Casey John y Lynn Cialdella-Kam por su ayuda durante la optimización de este procedimiento.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 12 tubos de 75 mm, con tapón | VWR | 20170-579 | Necesitará 2 tubos por muestra ("H" y "F") más 3 tubos por lote (para controles de ensayo; "F", "H" y "Solo sangre"). |
| PBS (10x), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Tapa de botella 0.2 y micro; m filtro de acetato de celulosa (capacidad de 500 ml) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucosa, polvo | Life Technologies | 15023-021 | |
| Ácido cítrico (anhidro, cultivo celular probado, cultivo celular vegetal probado) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Citrato de sodio tribásico dihidratado | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihidroetidio (Hidroetidina) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimetilo sulfóxido (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus ( Cepa de madera sin proteína A) Biopartículas, conjugado con fluoresceína (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus ( Cepa de madera sin proteína A) Biopartículas, sin etiquetar | Life | Technologies S-2859 | |
| Solución Azul de Tripano, 0,4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Vacutainer de 4,0 ml que contiene 7,2 mg de K2EDTA, VWR secado por pulverización | BD367861 | Necesitará 1 tubo de extracción de sangre K2EDTA por muestra. | |
| Vacutainer de 4,0 ml que contiene 68 unidades USP de heparina de litio, VWR recubierta con spray | BD367884 | Necesitará 1 tubo de extracción de sangre de heparina de litio por muestra. | |
| COULTER Ac· T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., analizador de hematología |
| COULTER Ac· T 5diff Enjuague | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac· T 5diff fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER ac· T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac· T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac· T 5diff Cal Calibrador | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac· T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluyente | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µ l puntas de pipeta de longitud extendida | VWR | 37001-526 | |
| Bandeja de hielo aislada | VWR | 89198-980 | Para baño de agua helada. |
| Gradilla metálica abierta | para tubos VWR | 60916-702 | |
| Suero fetal bovino | Life Technologies | 26140-111 | |
| Estación de trabajo TQ-Prep | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., estación de trabajo automatizada de preparación de lisis celular |
| ImmunoPrep Sistema de reactivos | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., sistema de reactivos fijos RBC lyse/WBC |
| Sistema de citometría de flujo Cytomics FC500 MCL con software CXP | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Fluorosferas de control de flujo | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alineación y verificación de fluidos fluorosferas |
| FlowJo | Software FlowJo FlowJo FlowJo | i.e., software de análisis de citometría de flujo Excel | |
| Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., programa de hojas de cálculo electrónicas |
Referencias
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
- Knab, A. M., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
