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Artículo de método

Síntesis Facile de micelas similares a gusanos de luz visible mediada por dispersión Polimerización con catalizador Photoredox

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DOI:

10.3791/54269

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8 de junio de 2016

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1Centre for Advanced Macromolecular Design (CAMD), The University of New South Wales, 2Australian Centre for NanoMedicine (ACN), The University of New South Wales, 3School of Chemical Engineering, The University of New South Wales

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un proceso para producir nanopartículas poliméricas autoensambladas utilizando polimerización por dispersión mediada por luz visible. El uso de luz visible de baja energía para controlar la polimerización permite la formación reproducible de micelas autoensambladas en forma de gusano con un alto contenido de sólidos.

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la síntesis fácil de micelas similares a gusanos mediante polimerización por dispersión mediada por luz visible. Este enfoque comienza con la síntesis de un homopolímero hidrofílico poli(oligo(etilenglicol) metacrilato de metil éter (POEGMA) mediante polimerización reversible por adición-fragmentación-transferencia en cadena (RAFT). Bajo una irradiación de luz visible leve (λ = 460 nm, 0,7 mW/cm2), este agente de transferencia de macrocadena (macro-CTA) en presencia de un catalizador fotorredox a base de rutenio, Ru(bpy)3Cl2 puede extenderse en cadena con un segundo monómero para formar un copolímero de bloque bien definido en un proceso conocido como RAFT de transferencia de electrones fotoinducida (PET-RAFT). Cuando se utiliza PET-RAFT para extender la cadena de POEGMA con metacrilato de bencilo (BzMA) en etanol (EtOH), se forman in situ nanopartículas poliméricas con diferentes morfologías según un mecanismo de autoensamblaje inducido por polimerización (PISA). El autoensamblaje en nanopartículas que presentan cadenas de POEGMA en la corona y cadenas de poli(metacrilato de bencilo) (PBzMA) en el núcleo ocurre in situ debido a la creciente insolubilidad del bloque PBzMA en el etanol. Curiosamente, la formación de micelas similares a gusanos de alta pureza se puede monitorear fácilmente observando el inicio de un gel altamente viscoso in situ debido a los enredos de nanopartículas que ocurren durante la polimerización. Por lo tanto, este proceso permite una síntesis más reproducible de micelas en forma de gusano simplemente monitoreando la viscosidad de la solución durante el curso de la polimerización. Además, el estímulo luminoso se puede aplicar de forma intermitente en forma de ON/OFF, lo que demuestra un control temporal sobre la morfología de la nanopartícula.

Introducción

La síntesis de no esféricas (y otras) morfologías de nanopartículas tradicionalmente se ha logrado usando un procedimiento de auto-ensamblaje de varios pasos a partir de la síntesis y purificación de dibloque anfifílico bien definido (o multibloque) copolímeros. Una de las técnicas de autoensamblaje más comunes fue popularizado por Eisenberg en la década de 1990 e implica la disolución del copolímero de bloque anfífilo en un disolvente común para ambos bloques de polímero seguido de la lenta adición de un solvente selectivo para uno de los bloques 1-3 . A medida que se añade el disolvente selectivo (normalmente agua), el copolímero de bloque se somete a auto-ensamblaje para formar nanopartículas poliméricas. La morfología final (o mezclas de morfologías) de las nanopartículas son determinados por un gran número de factores tales como las longitudes relativas de cada bloque de polímero, velocidad de adición de agua y la naturaleza del disolvente común. Sin embargo, este enfoque general, sólo permite la producción de nanopartículos relativamente bajo contenido de sólidos (menos de 1% en peso) y por lo tanto limita su escalabilidad práctico 4. Además, la formación reproducible de las fases "intermedias", tales como micelas similares a gusanos puede ser difícil debido a la estrecha gama de parámetros necesarios para estabilizar esta morfología no esférica 5.

El enfoque de auto-ensamblaje de polimerización inducida (PISA) aborda parcialmente los inconvenientes del enfoque Eisenberg utilizando el proceso de polimerización en sí para conducir auto-ensamblaje in situ lo que permite la síntesis de nanopartículas en mucho más alto contenido de sólidos (típicamente 10 a 30% en peso) 6 -8. En un enfoque típico PISA, un proceso de polimerización viva se utiliza para extender la cadena un macroiniciador disolvente soluble (o macro-CTA) con un monómero que es inicialmente soluble en el medio de reacción, sino que forma un polímero insoluble. El enfoque de PISA se ha utilizado para sintetizar micelas similares a gusanos probando sistemáticamente una serie de ex parámetros experimentales y el uso de diagramas de fases detalladas como una "hoja de ruta" sintético 5,9.

A pesar de su síntesis reto, existe un gran interés en las nanopartículas similares a gusanos debido a sus propiedades interesantes en relación con sus homólogos esféricas. Por ejemplo, hemos demostrado que cargadas con fármaco micelas similares a gusanos cortos y largos sintetizados utilizando un enfoque de PISA tienen significativamente mayor en la citotoxicidad in vitro en comparación con micelas esféricas o vesículas 10. Otros han demostrado una correlación entre la relación de aspecto de nanopartículas y el tiempo de circulación de la sangre en modelos in vivo 11. Otros han demostrado que la síntesis de nanopartículas de gusano utilizando una metodología PISA apropiado produce un gel macroscópico debido a la nanoescala enredo de los filamentos de nanopartículas. Estos geles han demostrado potencial como geles esterilizables, debido a su comportamiento sol-gel termorreversible 12.

ONTENIDO "> Este protocolo describe un método que permite la supervisión in situ de la formación de micelas similares a gusanos por la simple observación de la viscosidad de la solución durante la polimerización. Los estudios previos de geles micelares similares a gusanos similares han demostrado que por encima de una temperatura crítica, estos nanopartículas experimentan una transición de gusano esfera reversible y así forman dispersiones de flujo libre a temperaturas elevadas. hasta la fecha, estos sistemas han utilizado un compuesto azo térmicamente sensible para iniciar la polimerización controlada 13,14 y así gelificación no se puede observar fácilmente en estos sistemas durante la polimerización térmica. a partir de estos estudios, se planteó la hipótesis de que la síntesis de nanopartículas PISA derivados a temperaturas más bajas puede permitir la observación de este comportamiento de gelificación in situ.

Recientemente hemos informado de la utilización de una técnica de fotopolimerización temperatura ambiente fácil para mediar el proceso de PISA para producir nanopartículas de15 diferentes morfologías. Aquí, un protocolo visualizado se presenta para la síntesis reproducible de micelas similares a gusanos observando el comportamiento viscosidad de la solución durante la polimerización. El producto de polimerización de dispersión fácilmente usando diodos emisores de luz disponibles en el mercado (LEDs) (λ = 460 nm, 0,7 mW / cm 2).

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Protocolo

1. Síntesis y Caracterización de POEGMA Macro-CTA

  1. Añadir oligo (etilenglicol) metacrilato de metil éter (OEGMA) (12 g, 4 × 10 -2 mol), 4-ciano-4- (phenylcarbonothioylthio) pentanoico (CPADB) (0,224 g, 8 × 10 -4 mol), 2,2'-azobis (2-metilpropionitrilo) (AIBN) (16,4 mg, 0,1 mmol) y 50 ml de acetonitrilo (MeCN) a un matraz de 100 ml de fondo redondo.
  2. Cerrar el matraz con un septum de goma de alambre de acero y de tamaño adecuado y enfriar el matraz de temperatura ambiente a <4 ° C en un baño de hielo-agua.
  3. Desoxigenar el matraz durante 30 min burbujeando nitrógeno directamente en la mezcla de reacción a través de un 21 G aguja (0,8 mm x 120 mm) con una segunda aguja 21 G (0,8 mm x 38 mm) que actúa como un orificio de ventilación.
  4. Colocar el matraz en un baño de aceite a 70 ° C durante 5,5 h antes de inactivar la polimerización por inmersión en un baño de hielo-agua y la exposición de los contenidos al aire.
  5. Retire el MeCN, agitando bajo accorriente ontinuous de aire comprimido y re-disolver la mezcla en bruto en ~ 40 ml de tetrahidrofurano (THF).
  6. Añadir el contenido del matraz gota a gota a 400 ml de una mezcla rápidamente agitada de éter de petróleo (pe 40-60 ° C) y éter dietílico (70:30, v / v) y se continúa agitando hasta que el sobrenadante ya no es turbia.
    Nota: El enfriamiento en un baño de hielo se puede usar para acelerar el proceso de precipitación.
  7. Decantar el sobrenadante y volver a disolver el residuo de polímero en ~ 40 ml de THF.
  8. Repetir el proceso de precipitación (pasos 1.5 a 1.7) al menos dos veces más para asegurar la eliminación completa del monómero OEGMA residual. Eliminar el exceso de disolvente de la POEGMA purificada macro-CTA en primer lugar por agitación bajo una corriente continua de aire comprimido y secado en una estufa de vacío (20 ° C, 10 mbar) durante 4 h.
  9. Determinar el peso molecular promedio en número del POEGMA macro-CTA por resonancia magnética nuclear (RMN) (M n, RMN) utilizando un método ya se ha informado 15. El uso de cromatografía de permeación de gel 15 (GPC) (dimetilacetamida como fase móvil y normas apropiadas para la calibración) calcular la dispersidad de polímero (D).
    Nota: El uso de la síntesis anterior (pasos 1,1-1,8) debe producir un POEGMA macro-CTA con Mn, RMN = 9,000, y D <1,15. Si el peso molecular (y dispersidad) de la sintetizado POEGMA macro-CTA difiere de la síntesis presentada aquí (entre 7.000 - 1.000 g / mol), la formación de micelas similares a gusanos (como se indica por la gelificación situ) todavía se puede producir usando la posterior metodología presentada en PISA (sección 2) aunque a un tiempo de reacción ligeramente alterada.

2. Preparación de POEGMA- b -PBzMA nanopartículas El uso de PISA

  1. Preparar una solución madre de 1 mg / ml de Ru (bpy) 3 Cl 2. 6H 2 O en etanol (EtOH). La solución madre, en el refrigerador para minimizar la evaporación del disolvente.
  2. Enchufe una pipeta Pasteur con una pequeña bola de lana de algodón usando una segunda pipeta para ayudar a empacar con fuerza. Verter óxido de aluminio básico en la pipeta con el tapón de algodón para dar una columna de aproximadamente 5 cm. Retire el inhibidor de hidroquinona monometil éter en BzMA comercial haciendo pasar ~ 3 ml de BzMA través de la columna y recogiendo el eluyente BzMA deinhibited.
  3. Añadir POEGMA macroCTA (~ 9000 g / mol, 76,9 mg, 8,5 x 10 -6 mol)., Deinhibited BzMA (0,301 g, 1,71 × 10 -3 mol), Ru (bpy) 3 Cl 2 6H 2 O (128 mg, 1,71 × 10 -7 mol, 128 l de una solución de 1 mg / ml en etanol de valores), 0,383 ml de MeCN y 1.402 ml de EtOH (disolvente 1.913 ml en total, 80% en peso, 20 v / v MeCN%) a un vial de vidrio 4 ml .
  4. Realice el procedimiento de desoxigenación como se indica en los pasos 1.2-1.3.
  5. Colocar el vial en un vaso de vidrio de 2.000 ml (Figura 2) revestida con tiras de LED azul (λ max = 460nm, 0,7 mW / cm 2) e irradiar a temperatura ambiente con agitación magnética. Supervisar el vial de reacción habitualmente después de 20 horas y retirarlo del reactor cuando la solución de alta viscosidad forma un gel de pie libre cuando se invierte el frasco (Figura 3).
    Nota: El tiempo total para producir un gel independiente debe ser de aproximadamente 24 horas de irradiación con luz azul usando las condiciones que aquí se presentan. Las pequeñas diferencias en los reactores de irradiación de luz (dimensiones físicas, intensidad, etc.) pueden requerir condiciones ligeramente alteradas (en concreto de tiempo de reacción) para lograr la formación in situ de micelas similares a gusanos.
  6. Después de retirar del reactor, apagar la polimerización mediante la exposición del gel de nanopartículas al aire durante unos pocos minutos y almacenar el vial cerrado en posición vertical en la oscuridad.

3. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de imágenes de nanopartículas de Morfología

  1. Colocar aproximadamente 40 mg del crudo nanopagel Artículo (de la sección 2) en un vial de vidrio de 4 ml.
  2. Continuamente agitar el gel de nanopartículas usando un mezclador de vórtice y añadir 4 ml de EtOH gota a gota durante un período de al menos 5 min. El gel debe convertirse en una solución de flujo libre durante la adición de disolvente.
    Nota: Si el gel se diluye con EtOH demasiado rápidamente o no agitado adecuadamente, se puede producir algo de precipitación de las nanopartículas. Ver el paso 3.3.
  3. Retire cualquier agregados macroscópicos de las nanopartículas diluidas por filtración a través de lana de vidrio.
  4. Realizar las imágenes TEM (con tinción de acetato de uranilo) de la muestra diluida de acuerdo con un procedimiento previamente informado. 15

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Resultados

En este estudio, el protocolo de polimerización de dos etapas se utiliza para la síntesis de micelas similares a gusanos utilizando un enfoque de PISA (Figura 1). En el primer paso, la polimerización de OEGMA se realiza produciendo una POEGMA macro-CTA que puede ser usado como un estabilizador en la etapa de polimerización posterior. El producto de polimerización de PET-RAFT bajo condiciones de dispersión, debido a la insolubilidad de PBzMA en etanol que en última instan...

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Discusión

Este protocolo visualizado demuestra la capacidad de controlar la formación de micelas similares a gusanos simplemente mediante la observación de la aparición de un comportamiento similar a un gel. La utilidad de este enfoque radica en la capacidad de controlar la formación de gusano durante la polimerización en comparación con otros métodos. Este procedimiento se puede realizar usando una polimerización en dos etapas de dos monómeros disponibles comercialmente (OEGMA y BzMA) para producir b -PBzMA copolímeros ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

CB está agradecido por su Beca del Futuro del Consejo Australiano de Investigación (ARC-FT12010096) y UNSW Australia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4-Ciano-4-
(fenilcarbonotioltio)ácido pentanoico (CPADB)		Sigma-Aldrich722995-5G
Oligo(etilenglicol) metacrilato de éter metílico (OEGMA)Sigma-Aldrich447935-500MLPromedio Mn 300, contiene 100  ppm MEHQ como inhibidor, 300  ppm BHT como inhibidor
2,2′-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN)Sigma-Aldrich
Ru(bpy)3Cl2.6H2OSigma-Aldrich544981-1G
Metacrilato de bencilo (BzMA)Sigma-Aldrich409448-1LContiene hidroquinona de éter monometílico como inhibidor
Óxido de aluminio ( básico)Chem-Supply Pty Ltd AustraliaAL08371000
95% Etanol (EtOH)Sucrogen Bio Ethanol80889
Acetonitrilo (MeCN)Chem-Supply Pty Ltd AustraliaRP1005-G2.5L
Tetrahidrofurano (THF)Chem-Supply Pty Ltd AustraliaTA011-2.5L
Bebidas espirituosas de petróleo (40-60  ° C)Chem-Supply Pty Ltd AustraliaPA044-2.5L
Diethyl EtherChem-Supply Pty Ltd AustraliaEA0362.5L
Dimetilacetamida (DMAc)VWR International AustraliaALFA22916. M1Para análisis GPC
Pipetas Pasteur (230  mm)Labtek355.050.503
Vasos de vidrioLabtek025.01.902 (2L)/ 2110654 (1L)2  El vaso de precipitados L es para unir tiras de LED para formar el reactor circular
Tira de LED comercialEcoLabn/aλ = 460 nm, 4,8 W/m
4 ml Viales de vidrioLabtekAPC502214B
0,9 ml Cubeta de cuarzoStarna Scientific Ltd21/Q/2
Aguja (0,8 mm x 38  mm)Beckton Dickson302017Para reacciones desoxigenantes
Aguja (0,8 mm x 120  mm)B Braun Australia 4665643Para reacciones de desoxigenación
Tabiques de tapón de manguito (tabique de goma)Sigma-Aldrichz564680/z564702
Placas calefactoras de agitaciónVWR International Australia/In Vitro Technologies97018-488/RADRR91200
Mezclador de vórticeVWR International Australia412-0098
Horno de vacíoIn Vitro TecnologíasMEMVO200

Referencias

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