Artículo de método

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

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DOI:

10.3791/54276

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25 de julio de 2016

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1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos robusto, rápido y escalable para células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Los cardiomiocitos obtenidos mediante este método a gran escala pueden proporcionar un número de células suficiente para su uso eficaz en el modelado de enfermedades cardiovasculares humanas, el cribado de fármacos de alto rendimiento y las posibles aplicaciones clínicas.

Resumen

Maximizar el beneficio de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para la investigación, la modelización de enfermedades, farmacéuticos y aplicaciones clínicas requiere métodos robustos para la producción a gran escala de tipos de células funcionales, incluyendo los cardiomiocitos. Aquí demostramos que la manipulación temporal de WNT, TGF-β, y SHH vías de señalización conduce a líneas HPSC diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente de una sola célula a pases en tanto la suspensión estática y sistemas de suspensión de biorreactores agitados. El empleo de esta estrategia resultó en ~ 100% superando esferoides, que contiene consistentemente> 80% de células T positivos de troponina cardiaca después de 15 días de cultivo, validados en múltiples líneas HPSC. También informamos sobre una variación de este protocolo para su uso con líneas celulares no está adaptado a los pases de una sola célula, cuyo éxito ha sido verificado en 42 líneas HPSC. Cardiomiocitos generados usando estos protocolos expresan marcadores específicos de linaje y espera mostrar electrophysIOLÓGICA funcionalidades. Nuestro protocolo presenta una plataforma simple, eficiente y robusto para la producción a gran escala de los cardiomiocitos humanos.

Introducción

Las células humanas pluripotentes madre (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), tienen la capacidad de auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias 1,2. Debido a estas características, hPSCs proporcionan una fuente valiosa e ilimitado para la generación y escalable de producción de tipos de células relevantes de la enfermedad para el modelado de la enfermedad humana 3-5, para la detección de drogas y de toxicidad ensayos de alto rendimiento 6,7 y potencialmente para aplicaciones clínicas 8 . Generación de los cardiomiocitos de hPSCs ofrece la oportunidad de investigar específicamente los mecanismos de las enfermedades cardiovasculares humanos complejos y sus posibles tratamientos, anteriormente más allá del alcance de nuestra capacidad debido a la falta de modelos animales relevantes y / o la disponibilidad de tejidos primarios afectados.

Todas las aplicaciones mencionadas anteriormente de hPSCs necessitate la producción de un número masivo de los cardiomiocitos altamente enriquecidos y funcionales. Por lo tanto, la disponibilidad de un servicio eficaz, reproducible y escalable in vitro protocolo de diferenciación cardiaca adecuado para múltiples líneas HPSC es crucial. Protocolos de diferenciación de los cardiomiocitos convencionales han empleado diferentes estrategias como la formación de cuerpos embrioides 9, 10 técnicas de co-cultivo, la inducción con un cóctel de citoquinas 11 y métodos de transducción de la proteína 12. A pesar de los avances en estas técnicas, la mayoría todavía sufren de una pobre eficiencia, requieren factores de crecimiento caros, u ofrecer universalidad limitada cuando se trata de utilizar varias líneas HPSC. Hasta la fecha, estos problemas han establecido límites a la producción de los cardiomiocitos derivados de HPSC para los estudios de terapia celular en modelos animales, así como en la industria farmacéutica para el descubrimiento de fármacos 13. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas robustas y asequibles para grandes-scale la producción de cardiomiocitos funcionales derivados de HPSC en sistemas de cultivo escalables facilitaría en gran medida sus aplicaciones comerciales y clínicos.

En este manuscrito, se presenta el desarrollo de un sistema de diferenciación cardiaca rentable e integrada con una alta eficacia, reproducibilidad y aplicabilidad a hESCs y hiPSCs generados a partir de una variedad de fuentes y métodos de cultivo, incluyendo un método para la producción a gran escala de muy poblaciones enriquecidas de cardiomiocitos derivados de HPSC utilizando un biorreactor. Además, hemos optimizado este protocolo para las líneas HPSC no adaptados al alimentador de cultivo celular libre y / o individual, como hiPSCs de nueva creación o grandes cohortes de líneas HPSC pertinentes para el análisis del mecanismo de la enfermedad.

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Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, revestimiento de placas de cultivo celular y Mantenimiento de indiferenciado hPSCs

  1. Preparación de medios
    Nota: Esterilizar los medios de comunicación que utilizan un dispositivo de 0,22 micras filtración y se almacena a 4 ° C protegido de la luz para un máximo de 4 semanas. Nombres de reactivos, los proveedores y los números de catálogo se enumeran en la Tabla de Materiales.
    1. Para fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mediano, mezcle 445 ml de DMEM, 50 ml de suero bovino fetal (FBS) y 5 ml de medio de cultivo celular (por ejemplo, Glutamax).
    2. Para células madre mediano, combine 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml golpe de gracia suero sustitución (KO-SR), 5 ml de medio de cultivo de células, 5 ml de solución de aminoácidos esenciales mínimos MEM y 0,5 ml de 55 mM β-mercaptoetanol.
      PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es tóxico. Evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel.
    3. Para RPMI-B27 (RB) mediano, mezcle 475 ml de RPMI 1640, 10 ml, menos B27insulina, medios de cultivo celular 5 ml, 5 ml de solución de aminoácidos esencial mínimo MEM, 5 ml de penicilina / estreptomicina y 0,5 ml 55 mM β-mercaptoetanol.
    4. Para la solución de disociación (DS), se combinan 10 ml 0,05% de tripsina, 4 ml KO-SR, 1 ml de colagenasa tipo IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM y 20 l CaCl 2 (1 M).
    5. Para células Feeder Medio Acondicionado, añadir 15 ml de medio de células madre (sin bFGF) a un matraz T75 con confluentes células alimentadoras (MEF o fibroblastos de prepucio humano) que han sido inactivados previamente por tratamiento con mitomicina C o por irradiación. Cosecha medio acondicionado después de 24 horas y reemplazar células madre con medio fresco. Las células pueden ser utilizadas por hasta 2 semanas.
  2. El recubrimiento de las placas de cultivo celular
    1. ECM gel de revestimiento:
      1. Tras la compra, descongelar el extracto de gel de ECM a 4 ° C hasta que está en un estado líquido uniformemente consistentes, según las instrucciones del fabricante. Diluir en una proporciónde 1: 2 en frío KO-medio DMEM, alícuota y se almacena a -20 ° C.
        Nota: Durante la preparación del gel de ECM, mantenga todos los materiales requeridos para su uso en el procedimiento de recubrimiento en alícuotas y frío. La concentración del gel de ECM varía con el número de lote. Asegúrese de que la concentración se observó en alícuotas. Las alícuotas se pueden mantener a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
      2. Descongelar una alícuota de gel de ECM a 4 ° C. Cuando se descongela, se añade medio de KO-DMEM frío para una concentración final de 0,34 mg / ml. Pipeta bien y añadir 0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos. Se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
    2. Mitóticamente inactivadas de fibroblastos de embriones de ratón alimentador celular (MEF) Revestimiento
      Nota:. Preparación de células de alimentación MEF se ha descrito previamente 14
      1. Escudo una placa de cultivo celular de 6 pocillos con factor de adhesión (AF) o 0,1% de gelatina (véase la etapa 1.2.3) a TA durante 5 min (0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos).Retirar y dejar la placa en la cabina de bioseguridad (BSC) para secar.
      2. Descongelar MEF mediante la transferencia de un vial congelado en un baño de agua a 37 ° C durante aproximadamente 2 - 3 min.
      3. Añadir 7 ml de medio de MEF a un tubo de 15 ml. Cuando se descongela el vial de células, transferir lentamente el contenido al tubo de 15 ml. Centrifugar a 300 g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de MEF.
      4. Contar las células y la placa 1 × 10 6 células por placa de 6 pocillos (~ 1,7 x 10 5 células / pocillo). Transferir a una incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 y permiten que las células se unan O / N antes de su uso.
    3. Gelatina de revestimiento:
      1. Disolver 1 g de polvo de gelatina en agua ultrapura para hacer una solución 0,1% (v / w). Incubar durante 15 min a 37 ° C y luego el autoclave la solución a 121 ° C durante 15 min. Cuando se enfría, añadir al número necesario de pocillos (0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos) y se incuba durante 15 min a 37 ° C.
        Nota: Si queda solución de gelatina al 0,1% puede mantenerse a 4 ° C por hasta 1 mes.
    4. Laminina Revestimiento:
      1. Descongelar laminina (1 mg / ml) a 4 ° C hasta que se descongeló. Para 5 l de solución de laminina, añadir 1 ml de PBS frío. Pipeta y luego añadir al número necesario de pocillos (0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos) y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
    5. El recubrimiento de superficie de silicio Spinner Flask interna:
      1. Es necesario lavar un matraz de agitación de 100 ml (con 1 péndulo de vidrio) con agua destilada, usando un cepillo de limpieza para eliminar el polvo y / o residuos de la cultura. Rellenar con etanol al 70% y después de 30 minutos de enjuague con agua destilada. Se añade NaOH 5 M y dejar O / N.
      2. Eliminar la solución de NaOH y enjuagar el matraz con agua corriente durante 5 minutos. Llenar el matraz con HCl 1 M y se deja durante 15 min. Lavar el matraz con agua corriente durante 5 min, a continuación, dos veces con agua doblemente destilada para completamenteeliminar cualquier rastro de HCl. Mantener el matraz se seque por completo en el BSC.
      3. Añadir 1,5 ml de solución siliconado al matraz y girar horizontalmente para cubrir todas las superficies. Repetir el mismo procedimiento con el péndulo de cristal.
      4. Calentar el matraz recubierto en un horno seco a 100 ° C durante 1 hora o dejar secar O / N a temperatura ambiente. Si se calienta en un horno, dejar enfriar a temperatura ambiente durante 30 - 60 min.
      5. Lavar el matraz 3 veces con agua desionizada durante 15 min cada uno, luego esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 min.
  3. Mantenimiento de indiferenciadas hPSCs
    Nota:     Para cada uno de los protocolos descritos, a menos que se indique específicamente, las células se cultivan y se cultivaron en pocillos de placas de cultivo de 6 pocillos y los volúmenes se dará apropiado para este formato.
    1. hPSCs cultivadas como esferoides no diferenciados en un sistema de suspensión estática
      Nota: Las células utilizadas en estos pasos ya deberían adaptarse a lasuna sola célula de la cultura. 15
      1. Iniciar experimento con hPSCs cultivaron en gel de ECM en una placa de cultivo de 6 pocillos a aproximadamente el 70 - 80% de confluencia. Retire cualquier colonias diferenciadas utilizando el microscopio estereoscópico en el BSC. Añadir 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
        Nota: Para la eliminación de las colonias diferenciadas, utilizar una punta de pipeta de quitar y retire con cuidado todas las partes diferenciadas de forma manual mediante el microscopio estereoscópico. Tenga cuidado de no eliminar las colonias no diferenciadas.
      2. Eliminar las células de la incubadora y medio aspirado. Se lavan las células con 1 ml de PBS, quitar y poner la enzima de disociación de 0,5 ml de células. Se incuban las células durante 4 - 5 min a 37 ° C.
      3. Añadir 1 ml de medio de células madre y la cosecha de las células utilizando un rascador de células. Disociar las células en células individuales utilizando una pipeta P1,000. Contar las células viables utilizando azul tripán y un hemocitómetro.
      4. Resuspender las células a 2 × 10 5 c viablesELL / ml en medio de células alimentador acondicionado suplementado con 100 ng / ml de bFGF y 10 mM inhibidor ROCA Y-27632. Transferir las células a placas de fijación ultra-bajo utilizando una pipeta de 5 ml (3 ml por pocillo de placa de 6 pocillos).
      5. Después de 2 días, retirar con cuidado las células de la incubadora y aspirado de la mitad del medio (aproximadamente 1,5 ml). Reemplazar con medio condicionado fresco suplementado con 100 ng de bFGF / ml.
      6. Cambiar la mitad del medio cada día con medio acondicionado suplementado con 100 ng de bFGF / ml hasta el día 5. Ahora, o células de cultivo nuevas, el paso de continuar la cultura no diferenciado (etapa 1.3.1.2 - 5), o el uso para la diferenciación cardiaca (Sección 2 ). Si la cultura continua, células de paso de cada 4 - 8 días.
    2. hPSCs cultivadas en células de alimentación y se pasaron Uso de colagenasa tipo IV
      1. Antes de pases hPSCs, quitar cualquier colonias diferenciadas utilizando el microscopio estereoscópico en el BSC. Aspirar el medio y lavar las células con 1 mlPBS por pocillo. Quitar a continuación, añadir 0,75 ml de colagenasa tipo IV (1 mg / ml) y se incuba a 37 ° C durante 5 - 15 min, como se requiera para tener los bordes de las colonias a partir de pelar.
      2. Aspirar colagenasa y se añade 1 ml de medio de células madre por pocillo. Separar las colonias a pequeños grupos utilizando un rascador de células, a continuación, transferir las células por medio de una pipeta P1,000 en un tubo de 15 ml. Tenga cuidado de no romper los cúmulos en trozos pequeños.
      3. Lavar el medio hCME bien con 1 ml para recoger cualquier resto de las células y añadir al tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min. Aspirar las células sobrenadante y resuspender en medio hESC suplementado con 100 ng de bFGF / ml.
      4. Retire una placa recubierta MEF de la incubadora y aspirar el medio MEF. Transferir las células a una relación de entre 1: 3 y 01:10, según sea apropiado. Cambio de medio cada día con medio de células madre fresco suplementado con 100 ng de bFGF / ml. células de paso cada 4 - 8 días.

2. Differentiación de hPSCs como esferoides en un sistema de suspensión estática

  1. Comience experimento utilizando los días 5 esferoides no diferenciadas según se preparó en la Sección 1.3.1.
    Nota: En esta etapa, el tamaño medio de esferoides debe ser 175 ± 25 micras. Un mínimo de 50 esferoides se debe utilizar cuando se inicia un experimento de diferenciación.
  2. Transferencia de esferoides en un tubo de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Lavar el medio RB bien con 1 ml para recoger cualquier esferoides restantes y añadir al mismo tubo 15 ml. Deje las células durante 5 min hasta esferoides han sedimentado para formar un sedimento suelto (NO centrifugar). Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar ninguna esferoides.
  3. Añadir 3 ml de medio RB suplementado con 12 mM CHIR99021. La transferencia de las células de nuevo en un pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. Después de 24 horas, repita el paso 2.2.
    Nota: RB medio es sensible a la luz. Cuando se trabaja con medio RB, mantener la luz apagada BSC.
  4. UNdd 3 ml de medio RB al sedimento celular. La transferencia de las células de nuevo en un pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. Después de 24 horas, repita el paso 2.2.
  5. Añadir 3 ml de medio suplementado con RB IWP2, purmorphamine y SB431542 (5 mM cada uno). La transferencia de las células de nuevo en un pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. Después de 2 días, repita el paso 2.2.
  6. Resuspender las células en 3 ml de medio de transferencia y RB a una placa recubierta con gelatina para permitir que las células se unan.
    Nota: En esta etapa, las células también se pueden mantener en suspensión. Con el fin de continuar con el cultivo en suspensión estática, transferir las células de nuevo a una placa de fijación ultra-bajo.
  7. Cambiar el medio con 3 ml de medio RB después de 2 días. Las culturas empezarán a batir día siguiente. Cambiar el medio cada 3 - 4 días con medio de RB.

3. Diferenciación de hPSCs como esferoides en un biorreactor suspensión agitada

  1. Iniciar el experimento con la cultura esferoides indiferenciadad en suspensión estática durante al menos 3 pasajes (véase la sección 1.3.1). Añadir 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
  2. Eliminar las células de la incubadora y transferir todos los esferoides en un tubo de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Lavar el medio hESC bien con 1 ml para recoger cualquier esferoides restantes y añadir al mismo tubo 15 ml. Deje las células durante 5 min hasta esferoides han sedimentado para formar un sedimento suelto (NO centrifugar). Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar ninguna esferoides.
  3. Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS. Dejar durante 5 minutos hasta que esferoides han sedimentado para formar un sedimento suelto (NO centrifugar). Aspirar el sobrenadante y añadir 0,5 ml de tripsina al 0,05% más EDTA 0,53 mM. Se incuban las células durante 4 - 5 min a 37 ° C.
  4. Eliminar las células de la incubadora y añadir 1 ml de medio de células madre. Con una pipeta P1,000, disociar las células en células individuales, contar las células usando azul tripán y un hemocitómetro. Volver a suspender a 2 × 10 5 VIABLe células / ml en medio acondicionado suplementado con 100 ng / ml de bFGF y 10 mM inhibidor ROCA Y-27632.
  5. Transferir 100 ml de suspensión de células en el matraz biorreactor siliconado con 1 péndulo (véase la Sección 1.2.5). Comience con una agitación de 35 rpm y después de aumento de 24 horas a 40 rpm.
  6. Después de 48 horas, detener la agitación durante 5 a 10 min hasta que todos los esferoides han depositado en el fondo del matraz. Reemplazar la mitad del medio con medio acondicionado suplementado con 100 ng de bFGF / ml. Repita el mismo proceso cada 24 horas hasta el día 5.
    Nota: En esta etapa, esferoides no diferenciadas con un tamaño medio de 175 ± 25 micras deben formarse.
  7. Detener la agitación durante 5 a 10 min hasta que todos los esferoides han depositado en el fondo del matraz. Transferir todos los esferoides a un tubo de 50 ml en una cantidad mínima de medio (menos de 50 ml). Descarte cualquier medio que queda en el matraz biorreactor, garantizando cuidadosamente no esferoides se queda en el recipiente.
  8. leave 5 - 10 min hasta que todos los esferoides se han asentado en la parte inferior del tubo 50 ml a continuación, quitar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular suelto. Lavar con 25 ml de PBS con calcio y magnesio o medio RB, a continuación, dejar de nuevo por 5 a 10 min hasta que todos los esferoides se han asentado en la parte inferior del tubo 50 ml para formar de nuevo un sedimento suelto.
  9. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml de medio RB suplementado con 12 mM CHIR99021, 10 mM inhibidor de la roca y el 0,1% de alcohol de polivinilo (PVA). Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo al matraz biorreactor. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reiniciar la agitación a 40 rpm durante 24 horas.
    Nota: RB medio es sensible a la luz. Cuando se trabaja con medio RB mantener el BSC a la luz apagada modo.
  10. Repita los pasos 3.7 a 3.8.
  11. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml RB medio suplementado con 0,1% de PVA. Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo atbiorreactor que matraz. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reiniciar la agitación a 40 rpm durante 24 horas.
  12. Repita los pasos 3.7 a 3.8.
  13. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml de medio suplementado con RB IWP2, purmorphamine y SB431542 (5 mM cada uno). Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo al matraz biorreactor. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reinicie agitación a 40 rpm durante 2 días.
  14. Repita los pasos 3.7-3.8.
  15. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml de medio RB solamente. Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo al matraz biorreactor. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reiniciar la agitación a 40 rpm. esferoides que baten deben observarse 48 - 72 horas más tarde.
  16. Cambiar la mitad del medio cada 3 - 4 días con medio RB solamente al detener la agitación durante 5 - 10 min hasta que todos los esferoides han depositado en el fondo del recipiente. Retire cuidadosamente 50 ml de medio sin molestar a los esferoides y Carefully sustituir con 50 ml de medio RB fresco.

4. Diferenciación de hPSCs usando cultivos no adaptados a los pases de los organismos unicelulares

Nota: Este enfoque es específicamente útil para la diferenciación rápida de un gran número de líneas de HPSC sin tener que adaptarse a técnicas de cultivo de una sola célula, un proceso que consume enormemente mano de obra y tiempo. Esta técnica es aplicable a líneas celulares que son altamente sensibles a la disociación celular enzimática, tales como líneas HPSC recién establecidas.

  1. Iniciar el experimento con hPSCs cultivadas en MEF (como en la sección 1.3.2), que son aproximadamente el 70 - 80% de confluencia. Retire cualquier colonias diferenciadas utilizando el microscopio estereoscópico en el BSC.
  2. Retire medio y añadir 0,5 ml de solución de disociación (DS). Incubar durante 0,5 - 1 min hasta que las células MEF han redondeado hacia arriba y los bordes de las colonias hPSCs quedado claro. eliminar rápidamente DS y añadir 0,75 ml de colagenasa tipo IV (1 mg / ml).
  3. Incubarlas células durante 5 - 15 min a 37 ° C. Compruebe las células bajo el microscopio durante el período de incubación, y cuando las colonias enteras están empezando a levantar y separar, eliminar la colagenasa y añadir 1,5 ml de medio de células madre.
    Nota: Si después de 15 minutos la mayoría de las colonias están todavía unida, poner las células de nuevo a la incubadora. Compruebe las células bajo el microscopio cada 5 minutos. Tenga cuidado de no dejar las pilas en colagenasa durante más de 30 minutos. Si hay muchas colonias flotantes en la solución de colagenasa, no quite la colagenasa; sólo tiene que añadir 1 ml de medio de células madre.
  4. Con una pipeta P1,000, suavemente pipeta colonias para separar las colonias en su conjunto. No rompa las colonias en trozos pequeños. Transferencia de las células en un tubo de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Lavar el bien con 1 ml de medio de células madre para recoger las células restantes para añadir al mismo tubo. Dejar durante 5 minutos hasta que todas las colonias han sedimentado (NO centrifugar).
  5. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 2 ml medi células madreum suplementado con 100 ng / ml de bFGF. Transferencia de las células en una placa de fijación ultra baja usando 5 pipeta ml (1 ml en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y 3 ml en cada pocillo de una placa de 6 pocillos). Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante al menos 6 horas (máximo de 12 hr).
  6. Durante este tiempo, preparar el número necesario de pocillos / placas recubiertas con laminina para la etapa 4.7. ratios de transferencia de células confluentes recomendada es de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos (o cantidad equivalente por unidad de superficie).
  7. Después de 6 horas, transferir cuidadosamente los agregados de colonias en un tubo de 15 ml con 5 ml pipeta. Lavar la placa con medio RB, a percibir los agregados restantes y añadir al mismo tubo de 15 ml (0,5 ml por pocillo de 24 pocillos y 1 ml por pocillo de placas de 6 pocillos). Espere 5 minutos hasta que el sedimento agregados, a continuación, aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento suelto.
  8. Añadir 2 ml de medio RB suplementado con 12 mM CHIR99021 y transferir cuidadosamentecon una pipeta de 5 ml a sus pozos previamente preparada laminina recubierto (como en la Sección 1.2.4) para permitir que las células se unan.
  9. Después de 24 horas, retirar con cuidado el medio de cada pocillo y añadir 1 ml de medio RB solamente.
    Nota: Algunos de los agregados serán sólo muy débilmente unida a la placa de cultivo; Por lo tanto, es importante no eliminar los agregados grandes que puedan haberse soltado durante el procedimiento de cambio de medio. Es importante, sin embargo, para eliminar la mayor cantidad de la pequeña restos de células como sea posible.
  10. Después de 24 horas, retire con cuidado el medio y se añade medio suplementado con RB IWP2, purmorphamine y SB431542 (5 mM cada uno).
  11. Cambiar el medio después de 2 días con medio RB solamente. Las células se empiezan a superar día siguiente.
  12. Cambiar el medio cada 3 - 4 días con medio RB solamente.

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Resultados

Con el fin de establecer un método simple para la diferenciación a gran escala de los cardiomiocitos de hPSCs, hemos creado un protocolo en el cual se trataron las células inicialmente con un activador de WNT / β-catenina (CHIR99021) 16 y, posteriormente, con inhibidores de la Wnt / β- catenina y factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) vías (IWP2 16 y SB431542 17, respectivamente) y, finalmente, un activador de la proteína sonic hedgehog (SHH) y la ...

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Discusión

Los cardiomiocitos derivados de hPSCs son una fuente extremadamente atractivo para su uso en el modelado de la enfermedad humana, la detección de pruebas de drogas / toxicidad y, quizás en el futuro, las terapias regenerativas. Uno de los principales obstáculos para el uso de estas células, sin embargo, es la capacidad para proporcionar suficiente material de alta calidad para su uso efectivo. Utilizando nuestro protocolo descrito, ofrecemos un método que supera esta limitación.

Recientement...

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Divulgaciones

El Chang Instituto de Investigación Cardíaca Victor no se involucra en, ni aprueba, la destrucción de embriones humanos para la investigación. Su contribución a este estudio se limitó a trabajar en células madre pluripotentes inducidas por el hombre.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por subvenciones proporcionadas por el Instituto Royan, el Consejo Iraní de Investigación y Tecnología de Células Madre, la Fundación Nacional de Ciencias de Irán (INSF), el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC; 354400), la Fundación Nacional del Corazón de Australia/Heart Kids Australia (G11S5629) y la Red de Investigación Cardiovascular de Nueva Gales del Sur. HF contó con el apoyo de una beca internacional de posgrado de la Universidad de Nueva Gales del Sur, Australia. RPH contó con el apoyo de una beca de NHMRC Australia. Los autores expresan su gratitud a los sujetos humanos que participaron en esta investigación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Knockout DMEMLife Technologies10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR)Life Technologies10828028
GlutamaxLife Technologies35050061
MEM Aminoácidos no esencialesLife Technologies11140-050
β-MercaptoethanolLife Technologies21985-023
Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)Miltenyi Biotec130-093-843
RPMI1640Life Technologies11875093
DPBS, sin calcio, sin magnesioLife Technologies14190144
DPBSLife Technologies14287072
Factor de unión (AF)Life TechnologiesS006100
ECM GelSigma-AldrichE1270
LamininInvitrogen23017-015
DMEMLife Technologies11965-092                                                                                                                                                                                                             
Suero bovino fatal (FBS)Life Technologies16140-071
B27 menos insulinaGibcoA18956-01
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies15070063
0.05% Tripsina/EDTALife Technologies25300-054
Colagenasa Tipo IVLife Technologies17140-019
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC7902
Mitomicina CBioaustralisBIA-M1183
CHIR99021Miltenyi Biotec130-104-172
IWP2Miltenyi Biotec130-105-335
SB431542Miltenyi Biotec130-095-561
PurmorphamineMiltenyi Biotec130-104-465
Inhibidor de ROCK Y-27632Miltenyi Biotec130-104-169
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Alcohol polivinílico (PVA)Sigma-Aldrich363073
GelatinaSigma-AldrichG1890
Azul de tripánBio-Rad145-0013
Accumax Tecnologías Celulares Innovadoras Inc.AM105
Sigmacote Sigma-AldrichSL2 
CELLSPINIntegra Biosciences183 001
Matraz giratorio con 1 péndulo, 100 ml Integra Biosciences182 023
Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)Preparados internamente (o disponibles comercialmente)
Líneas de células madre pluripotentes humanas (hPSC)Preparados internamente (o disponibles comercialmente)

Referencias

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