basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo para utilizar el ARN interferente pequeño específico de la proteína de choque térmico 27 (HSP27) para evaluar la función de HSP27 durante la cicatrización de heridas epiteliales corneales. La interferencia de ARN es el mejor método para reducir eficazmente la expresión génica para investigar la función de las proteínas en varios tipos de células.

Resumen

El ARN interferente pequeño (siRNA) es uno de los métodos de interferencia de ARN más utilizados para el silenciamiento a corto plazo de genes codificadores de proteínas. El siRNA es un dúplex de ARN sintético creado para dirigirse específicamente a una transcripción de ARNm para inducir su degradación, y se ha utilizado para identificar nuevas vías en varios procesos celulares. Existen pocos informes sobre el papel de la proteína de choque térmico fosforilada 27 (HSP27) en la cicatrización de heridas epiteliales corneales. En este trabajo, las células epiteliales de la córnea humana cultivadas se dividieron en un grupo transfectado de siRNA de control codificado y un grupo transfectado de siRNA específico de HSP27. A continuación, se realizaron ensayos de lesiones direccionales inducidas por arañazos, Western blot y citometría de flujo. Concluimos que HSP27 tiene funciones en la cicatrización de heridas epiteliales corneales que pueden implicar la apoptosis y migración de células epiteliales. Aquí se proporcionan descripciones paso a paso de la preparación de la muestra y el protocolo del estudio.

Introducción

Las células epiteliales corneales (CEC) se desprenden continuamente en la película lagrimal, mientras que se sustituyen de forma simultánea por las células desde el limbo y capas basales epiteliales corneales. ¹ Varios factores estresantes extrínsecos pueden inducir la apoptosis y la descamación de CECs. ² Las proteínas de choque térmico (HSPs) están muy conservadas y se puede dividir en dos familias según su tamaño molecular. ³ la familia HSP más grande incluye HSP90, HSP70, y Hsp60, y la familia más pequeña incluye HSP27. ⁴ la fosforilación de HSP27 se sabe que juega un papel importante en la supervivencia celular y es necesario para la migración celular a causa del papel de esta proteína en la remodelación de la actina. ^5-7 por lo tanto, hemos intentado probar el posible papel de la fosforilación de HSP27 en la migración de CEC y la apoptosis en un modelo in vitro de la curación de heridas epiteliales.

ARN de interferencia (RNAi), utilizando tanto las pequeñas o cortas ARN de interferencia (siRNA) tiene generated interés tanto en la biología básica y aplicada, ya que potencialmente permite la expresión de cualquier gen de interés para ser derribado. ⁸ En ^esto, hemos utilizado siRNA-HSP27 específico para evaluar la contribución de HSP27 para la cicatrización de heridas CCA y la apoptosis. Los métodos tradicionales de ARNi para genes knock-down en células utilizan dúplex de ARN sintéticos, incluyendo dos oligonucleótidos 21-mer no modificados que se pueden ensamblar para crear siRNAs. La RNAi siRNA que hemos utilizado en el presente estudio es un método simple y altamente eficaz para transfectar células, y este reactivo trabaja con diversas líneas de células inmortalizadas. En el presente estudio, se demuestra los métodos utilizados para este análisis, incluyendo un ensayo de cero inducida por la herida direccional, el Western Blot, ensayo de transfección siRNA, ensayo de inmunofluorescencia y citometría de flujo.

Protocolo

1. Línea celular

1. Cultura 10 ⁶ células telomerasa inmortalizado humanos corneales epiteliales (HCECs) en una placa de 6 pocillos (densidad: 1039,9 células / mm ²⁾ en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO ₂ utilizando medio de crecimiento epitelio bronquial (BEGM) hasta que alcanzan 95% de confluencia.

2. Análisis de Western Blot después de crear heridas epiteliales de Scratch

1. Streak una punta estéril de 200 l pipeta sobre la superficie de un pozo de confluentes HCECs cultivadas cuatro veces al plato en una cabina de seguridad biológica (Clase II, Tipo A2) e incubar HCECs por separado en una incubadora a 37 ° con una atmósfera con 5% de CO ₂ para 1, 5, 10, 30, 60, y 120 min.
2. Utilice una placa de 6 pocillos para seis muestras diferentes de acuerdo con el tiempo de incubación después de la herida epitelial corneal.
3. Lavar las monocapas HCEC heridos tres veces con 1 x PBS y luego añadir 2,0 ml BEGM a cada pocillo.
4. Separar HCECs utilizando 2ácido ml 0,25% de tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) por pocillo durante 5 min, centrifugar a 900 xg durante 5 min en un tubo de 15 ml, y aspirado de tripsina-EDTA usando una pipeta de 1 ml.
5. Suspender HCECs con 1 ml de PBS 1x y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.
6. Centrifugar HCECs a 10.000 xg durante 15 seg y aspirado de 1x PBS utilizando una pipeta de 1 ml.
7. Resuspender HCECs en 100 l de tampón de lisis enfriado en hielo (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM, NaF 25 mM, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo [PMSF], inhibidores de la proteasa [1 M de pepstatina A, 1 leupeptina mu M, y 0,1 M de aprotinina] y 0,5% de Triton X-100 [pH 7]) y mezclar bien.
8. Se incuban las células durante 30 min en hielo para inducir la lisis celular.
9. lisados ​​centrifugar a 4ºC a 10.000 xg durante 15 min, y luego transferir los sobrenadantes a nuevos tubos de 1,5 ml (90 ml de alícuotas) y almacenar a -80 ° C.
10. Determinar las concentraciones de proteína total de lisados ​​celulares utilizando el pr BradfordOtein ensayo. ⁹
11. Cargar 30 g de proteínas celulares totales en un gel de acrilamida al 10% o 12% para electroforesis de dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), y luego por electroforesis de transferencia separados bandas de proteínas a filtros de nitrocelulosa con una corriente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C para utilizar en ensayos de Western blot.
12. membranas de filtro de bloque de nitrocelulosa con un 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) durante 1 hora, añadir anticuerpos policlonales de conejo primaria contra HSP27 no fosforilada (dilución 1: 1.000) o el anticuerpo policlonal de conejo primaria contra fosforilada HSP27 (1 : 1000 dilución) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA), y se incuban las membranas durante la noche a 4 ° C en un agitador.
13. Detectar bandas inmunorreactivas utilizando anticuerpos anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra (1: 10.000 de dilución) en BSA al 5% después del lavado durante 10 minutos 3 veces con TBST.
14. Incubar la membrana en los reactivos de transferencia de Western de luminol (6-7 ml por cada 10 cm × 5 cm de membrana) durante 1 min a temperatura ambiente.
15. Retire la membrana de la solución de reactivo, eliminar el exceso de líquido con una toalla absorbente, y coloque en un protector de hojas de plástico.
16. Trabajar en un cuarto oscuro con una luz de seguridad, colocar la membrana cubierto en un casete de película con el lado de la proteína hacia arriba.
17. Colocar una película de rayos X en la parte superior de la membrana y exponer durante 1 min.

3. Ensayo de transfección siRNA ¹⁰

1. HCECs de cultivo a 5 x 10 ⁵ células / pocillo en una placa de 6 pocillos en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO ₂ usando BEGM hasta que alcanzan 95% de confluencia.
2. Diluir el reactivo de transfección (2,5 o 7,5 l) con 100 l reducción de medio de suero para la transfección (el factor de dilución fue de 41 o 14.3) y disolver la HSP27-específica y revueltos siRNA control en 100 l medio con suero reducido a crear 10 o 50 nM de -HSP27 específico y revueltos siRNA control.
3. Mezclar 100 μ; Solución siRNA l con 100 l de reactivo de transfección diluido (relación 1: 1) y se incuba la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Añadir los complejos lípido-siRNA para las células. A continuación, después de 4 horas de cambio de los medios de comunicación para completar BEGM e incubar las células durante 2 días a 37 ° C.
5. Analizar las células transfectadas por el Western Blot, como se describe a partir de las secciones 4.1 a 4.7.

4. Western Blot ensayo para células transfectadas con siRNA ¹¹

1. Extraer-HSP27 específico y revueltos de control HCECs siRNA-transfectadas en una cabina de seguridad biológica usando 100 l de tampón de lisis enfriado en hielo (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), NaF 25 mM, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), inhibidores de la proteasa, y 0,5% de Triton X-100, pH 7).
2. Se incuban las células durante 30 min en hielo para inducir la lisis celular.
3. lisados ​​de pellets a 10.000 xg durante 15 min y luego transferir los sobrenadantes de bañera fresca 1,5 mlES (90 l alícuotas) y almacenar a -80 ° C.
4. Determinar las concentraciones de proteína de los lisados celulares utilizando el ensayo de proteínas de Bradford. ⁹
5. Cargar las muestras con cantidades iguales de proteínas totales de células en un gel de acrilamida al 10% o 12%, siempre que el gel SDS-PAGE y electroforesis transferir las bandas de proteínas separadas a filtros de nitrocelulosa con una corriente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C hasta utilizar en ensayos de Western blot.
6. Bloque membranas de filtro de nitrocelulosa con 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) durante 1 hora, añadir anticuerpos primarios contra fosforilada y no fosforilada HSP27 (dilución 1: 1000), Akt fosforilada (dilución 1: 1000), no fosforilada Akt (dilución 1: 1000, que se utiliza como marcador de la supervivencia celular), asociada a Bcl-2 de proteínas X (dilución 1: 1000, que se utiliza como una proteína pro-apoptótica), y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1 : dilución 200, que se utiliza como control de carga) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA), yincubar las membranas durante la noche a 4 ° C en un agitador.
7. Detectar bandas inmunorreactivas utilizando anticuerpos anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra (1: 10.000 de dilución) en BSA al 5% después de lavar 3 veces con TBST, 10 minutos cada lavado.
8. Incubar la membrana en los reactivos de transferencia de Western de luminol (6-7 ml por 10 cm × 5 cm de membrana) durante 1 min a temperatura ambiente.
9. Retire la membrana de la solución de reactivo, eliminar el exceso de líquido con una toalla absorbente, y coloque en un protector de hojas de plástico.
10. Trabajar en un cuarto oscuro con una luz de seguridad, colocar la membrana de cubierta en una casete de película con el lado de la proteína hacia arriba.
11. Coloque película de rayos X en la parte superior de la membrana y exponer para 1 min.

5. rasguño inducida direccional hiriente Ensayo de Evaluación de la migración celular ¹²

1. En una cabina de seguridad biológica, hacer una herida arrastrando una punta de pipeta estéril a través de la superficie de un pozo de cultivos confluentes de-HSP27 siRNA transfectadas o HCECs siRNA transfectadas de control revueltos.
2. Inmediatamente después de la herida, se lavan las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y mantenerlas en cultivos BEGM en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO ₂ durante 24 horas después de la herida.
3. Fotografiar imágenes HCEC utilizando un microscopio vertical con un aumento de 100X de 24 horas después de la lesión y realizar aplanamiento fondo usando el filtro comando en el software de análisis de imágenes.
4. Usando el comando Seleccionar mediciones, definir el área de interés (AOI), con la misma forma poligonal tamaño que puede cubrir perpendicularmente desde un extremo al otro de la herida inicial, y determinar tres diferentes AOI en la zona de la herida de cada muestra.
5. contar automáticamente el número de células en cada campo usando las opciones del menú de medida de recuento / Tamaño.

6. Análisis de Flujo Citometría de apoptosis

1. Cultura HSP27-siRNA-transfectadas y control sHCECs que contienen cada uno 10 nM siRNA RNAi-transfectó a una concentración de 5 x 10 ⁵ células / pocillo en placas de 6 pocillos hasta que las células alcanzan la confluencia 95% en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO ₂ en BEGM.
2. Separar HCECs utilizando 2 ml 0,25% de tripsina-EDTA por pocillo durante 5 min, centrifugar a 900 xg durante 5 min en un tubo de 15 ml, y aspirado de tripsina-EDTA usando una pipeta de 1 ml.
3. Lavar las células dos veces con PBS frío y luego volver a suspender las células en 1x tampón (0,1 M de HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, y CaCl 25 mM ₂₎ de unión a una concentración de 10 ⁶ células / ml.
4. Transferencia de 100 l suspensión de células (1 x 10 ⁵ células) en un tubo de cultivo de 5 ml.
5. Añadir 5 l isotiocianato de fluoresceína conjugado de Anexina V y 5 l de yoduro de propidio.
6. vórtice suavemente las células y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
7. Añadir 200 l de tampón de unión 1X a cada tubo y analizar las células mediante un flujo cytometer dentro de 1 hora.

Resultados

La expresión de HSP27 fosforilada aumentó significativamente a los 5, 10, y 30 min después de cero hiriendo compara con HCECs ilesos ^13. El análisis de transferencia Western reveló que la expresión de HSP27 fosforilada y fosforilada Akt se redujo significativamente tanto, mientras que la expresión de Bax fue significativamente mayor en HCECs siRNA transfectadas-HSP27 específica (Figura 1A-E). La expresión HSP27 fosforilada se redujo en un 30% y 40% en 10 nM y ...

Discusión

En este estudio, evaluamos el papel potencial de HSP27 en la herida epitelial corneal utilizando enfoques in vitro . Los pasos críticos involucraron la transfección de ARNip para la eliminación de HSP27 para observar la función de HSP27 en células sometidas a estrés. En particular, estos experimentos revelaron un papel para HSP27 en la migración de células epiteliales y la apoptosis durante la cicatrización de heridas epiteliales corneales. A diferencia de estudios anteriores¹⁰ que utilizaron ARNip es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cabina de seguridad biológica	CHC LAB Co., Ltd,  Daejeon, República de Corea	CHC-777A2-06	Clase II, Tipo A2
ARNi sigiloso y comercio; siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		ARNi siRNA; siRNA de control codificado y siRNA específico de HSP27
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175 Medio de	crecimiento del epitelio bronquial
Inhibidor de la proteasa	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340 ,P7626	1 μ M Pepstatina A, 1 μ M Leupeptin, 0.1 μ Ensayo de proteína M Aprotinin
Bradford	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, CA	# 500-0001	Ensayo de proteínas Bradford
Filtros de nitrocelulosa	Amersham, Little Chalfont, Reino Unido	RPN3032D	membrana Western blot membrana
HSP27 no fosforilada	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	dilución 1:1.000 (HSP27 total)
HSP27 fosforilado (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	dilución 1:1.000 HSP27 fue fosforilado en Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reactivo	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Reactivo de transfección
Akt fosforilado (Ser473)	Tecnología de señalización celular, Danvers, MA	No. 4060	Dilución 1:1,000 Akt fue fosforilado en Ser473 (marcador de supervivencia celular)
Akt no fosforilado	Tecnología de señalización celular, Danvers, MA	No. 4061	dilución 1:1,000 (Akt total)
Proteína X asociada a Bcl-2	Tecnología de señalización celular, Danvers, MA Nº	4062	1:1.000 (marcador de proteínas antiapoptóticas)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	Nº 4063	control de carga 1:1.000 (gen de mantenimiento doméstico)
Anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	dilución 1:10.000
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	medio sérico reducido para la transfección
software de análisis de imágenes	Olympus, Inc., Tokio, Japón	Image-Pro Plus 5.0
Leche desnatada en polvo	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Alemania	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Cloruro de sodio	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Placa de cultivo de seis pocillos	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35,00 mm de diámetro / pocillo
Plato de culutura de 24 pocillos	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Agitador orbital	N-Bioteck, Inc., Seúl, Corea del Sur	NB1015
Albúmina sérica bovina	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ
Película de rayos X de	Kodak, Rochester, NY		Casete de rayos X médicos con pantalla verde 400
reactivo de luminol de Western blot	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Kit de detección de apoptosis de anexina V I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547