Este protocolo describe una técnica de transferencia de carga de tintes fluorescentes bisturí que mide la comunicación intercelular a través de canales brecha de la salida. Brecha de comunicación intercelular de la unión es un proceso celular importante mediante el cual se mantiene la homeostasis del tejido y la interrupción de esta señalización celular tiene efectos adversos para la salud.
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Artículo de método
Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe un bisturí de carga fluorescente de transferencia de colorante técnica (SL-DT) que mide la comunicación intercelular a través de canales de salida brecha, que es un proceso intercelular importante por el cual se mantiene la homeostasis del tejido. La interrupción de la unión brecha de comunicación intercelular (GJIC) por agentes tóxicos, toxinas, drogas, etc. se ha relacionado con numerosos efectos adversos para la salud. Muchas enfermedades humanas basadas en la genética se han relacionado con mutaciones en genes brecha de la salida. La técnica de SL-DT es un ensayo funcional simple para la evaluación simultánea de GJIC en una gran población de células. El ensayo implica las células pre-carga con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana celular con una hoja de bisturí a través de una población de células. Se deja entonces que el colorante fluorescente para atravesar a través de canales de unión brecha a las células vecinas para un tiempo designado. El ensayo se termina entonces por adición de formalina a las células. La propagación de la fluorescent tinte a través de una población de células se evaluó con un microscopio de epifluorescencia y las imágenes se analizaron con cualquier número de paquetes de software que están disponibles morfométricas, incluyendo paquetes de software libre que se encuentran en el dominio público. Este ensayo también se ha adaptado para estudios in vivo utilizando rodajas de tejido de diferentes órganos de animales tratados. En general, el ensayo de SL-DT puede servir a una amplia gama de necesidades farmacológicas y toxicológicas in vitro, y puede ser potencialmente adaptada para sistemas de configuración de alto rendimiento con fluorescencia automatizado de imágenes y análisis de microscopía para dilucidar más muestras en un tiempo más corto.
Introducción
El objetivo general de este método es proporcionar una técnica sencilla, completa y relativamente barato para evaluar la toxicidad potencial de los compuestos. Este es un enfoque in vitro que puede ser utilizado en múltiples líneas celulares. laboratorios de biología celular estándar equipadas con microscopios de epifluorescencia pueden conducir búsquedas utilizando este ensayo.
Nuestro conocimiento básico de las funciones celulares ha sido dependiente de bioensayos in vitro altamente, y se ha convertido en un componente esencial en las evaluaciones toxicológicas de los productos farmacéuticos, los contaminantes ambienta....
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Protocolo
El protocolo de este estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales y el Aprovechamiento de los Institutos Nacionales de Ciencias de la Salud de Japón, que es donde los experimentos in vivo se realizaron, para asegurar que las ratas fueron tratadas con humanidad y respeto por aliviar el sufrimiento.
1. SL-DT Bioensayo
- Seed 3 10 5 WB-F344 células epiteliales de hígado de rata Onto 35 placas de cultivo de diámetro mm x contienen Eagles Modificado Medio más suero bovino fetal al 5%, y cultivar las células en una incubadora a 37 ºC, 100% de humedad relativa (RH), 5% CO 2.
- Cultivar las células hasta que llegan a....
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Resultados
Interrupción de la GJIC se ha utilizado ampliamente como un biomarcador para la identificación de compuestos tóxicos en el nivel no genotóxico, epigenética de control del gen que induce efectos adversos para la salud 14. Por ejemplo, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son contaminantes ubicuos del entorno, pero varían en sus toxicidades epigenéticos como una función de sus estructuras moleculares 15. Los HAP de menor peso molecular se encuentran normalmente.......
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Discusión
El ensayo SL-DT es una técnica sencilla y versátil en la medición de la GJIC, pero hay varios problemas críticos que deben ser explicados en el diseño de protocolos experimentales apropiados. Para las mediciones robustas de GJIC utilizando el ensayo de SL-DT tiene que haber un tinte de propagación de la LY a través de uniones de las células. Como mínimo, un tiempo adecuado se debe seleccionar para asegurar que el tinte se propaga a través de ocho o más filas de células a partir de las células de bisturí cargado en ambas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Con el apoyo de las subvenciones #R01 ES013268-01A2 del NIEHS, y los contenidos son únicamente responsabilidad del autor y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales del NIEHS, y con el apoyo del proyecto CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| WB-F344 células epiteliales de hígado de rata | De los Dres. J. W. Grisham y M. S. Tsao de la Universidad de Carolina del Norte (Chapel Hill, NC) | ninguna | Proporcionada por los Dres. J. W. Grisham y M. S. Tsao Universidad de Carolina del Norte-Chapel Hill-NC |
| Placas de cultivo de 35 mm | Corning | 430165 | |
| matraces de cultivo de 25 cm2 | Corning 430639 | ||
| Matraces de cultivo de 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| D-medium, un medio modificado para Eagles | ThermoFisher/GIBCO | Fórmula No. 78-5470EF | |
| suero fetal bovino | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| solución salina tamponada con fosfato | casera | ver a continuación el ingrediente cat# | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Amarillo CH, sal de litio | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rodamina-dextrano | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-metilantraceno | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| fenantreno | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Biociencia | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| solución al 37% formaldehído JT | Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 cuchilla quirúrgica | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| Tubos estériles cónicos de 50 ml | Thermo scientific | ||
| Microscopio de epifluorescencia Nikon | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Cubo dicroico Nikon FITC | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ Sistema de | ||
| imagen | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2. | |
| ImageJ | Instituto Nacional de Salud http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referencias
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S.
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Etiquetas
Transferencia de colorante fluorescente mediante carga de bisturtransferencia del colorante Lucifer Yellowmicroscop a de epifluorescenciaensayo de toxicidad por fenantrenoperturbaci n de la membrana celularan lisis de migraci n de colorantesevaluaci n de los efectos de agentes t xicostoxicolog a in vitroensayo de biomarcadores funcionales
