Artículo de método

Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 de diciembre de 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe una técnica de transferencia de carga de tintes fluorescentes bisturí que mide la comunicación intercelular a través de canales brecha de la salida. Brecha de comunicación intercelular de la unión es un proceso celular importante mediante el cual se mantiene la homeostasis del tejido y la interrupción de esta señalización celular tiene efectos adversos para la salud.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un bisturí de carga fluorescente de transferencia de colorante técnica (SL-DT) que mide la comunicación intercelular a través de canales de salida brecha, que es un proceso intercelular importante por el cual se mantiene la homeostasis del tejido. La interrupción de la unión brecha de comunicación intercelular (GJIC) por agentes tóxicos, toxinas, drogas, etc. se ha relacionado con numerosos efectos adversos para la salud. Muchas enfermedades humanas basadas en la genética se han relacionado con mutaciones en genes brecha de la salida. La técnica de SL-DT es un ensayo funcional simple para la evaluación simultánea de GJIC en una gran población de células. El ensayo implica las células pre-carga con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana celular con una hoja de bisturí a través de una población de células. Se deja entonces que el colorante fluorescente para atravesar a través de canales de unión brecha a las células vecinas para un tiempo designado. El ensayo se termina entonces por adición de formalina a las células. La propagación de la fluorescent tinte a través de una población de células se evaluó con un microscopio de epifluorescencia y las imágenes se analizaron con cualquier número de paquetes de software que están disponibles morfométricas, incluyendo paquetes de software libre que se encuentran en el dominio público. Este ensayo también se ha adaptado para estudios in vivo utilizando rodajas de tejido de diferentes órganos de animales tratados. En general, el ensayo de SL-DT puede servir a una amplia gama de necesidades farmacológicas y toxicológicas in vitro, y puede ser potencialmente adaptada para sistemas de configuración de alto rendimiento con fluorescencia automatizado de imágenes y análisis de microscopía para dilucidar más muestras en un tiempo más corto.

Introducción

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El objetivo general de este método es proporcionar una técnica sencilla, completa y relativamente barato para evaluar la toxicidad potencial de los compuestos. Este es un enfoque in vitro que puede ser utilizado en múltiples líneas celulares. laboratorios de biología celular estándar equipadas con microscopios de epifluorescencia pueden conducir búsquedas utilizando este ensayo.

Nuestro conocimiento básico de las funciones celulares ha sido dependiente de bioensayos in vitro altamente, y se ha convertido en un componente esencial en las evaluaciones toxicológicas de los productos farmacéuticos, los contaminantes ambientales y contaminantes de los alimentos nacido. Desafortunadamente, no existe un único sistema de bioensayo in vitro que puede satisfacer integralmente las demandas de todas las evaluaciones toxicológicas. Muchos ensayos in vitro están diseñados y optimizados para evaluar, así como evaluar un criterio de valoración bioquímica o molecular específico. Estos se combinan muy a menudo en un alto rendimiento creado para reflejar una perturbación de unadeterminada vía de transducción de señales, tales como la señalización del receptor de estrógeno 1. Esta estrategia ha tenido bastante éxito, pero el gran número de vías de transducción de señales implicadas en la expresión de genes que hace que la tarea de elegir una vía de señalización específica para evaluar bastante complejo. Los altos protocolos a través de-puestos están siendo desarrollados y utilizados para medir simultáneamente numerosas vías de señalización, que ha sido un enfoque para superar algunas de las limitaciones de los ensayos individuales actualmente. Sin embargo, no todas las vías de señalización se han incorporado con éxito en enfoques más amplios, además de nuevas vías de señalización están siendo constantemente descubierto que complica aún más este proceso de evaluación. El uso extenso número de enfoques in vitro, particularmente alto rendimiento de procesamiento de sistemas, para las evaluaciones toxicológicas completas también son muy caros y no son propicias para la mayoría solo investigador dirigido proyectos de investigación.

GJIC es un proceso tightly controlado por los cambios en el voltaje, la concentración de calcio, el pH, equilibrio redox, regulados por las principales vías de transducción de señales intracelulares y las interacciones con la membrana y las proteínas del citoesqueleto 2,3. Por lo tanto, la inhibición de GJIC puede reflejar diferentes tipos de estrés celular, la interrupción de las diferentes funciones celulares, o perturbaciones de diferentes vías de transducción de señales. Otro enfoque para superar el uso de bioensayos limitados de transducción de señales es para tomar ventaja de los fenómenos biológicos que muchos, si no la mayoría, las vías de transducción de señales se modulan aún más por los sistemas de señalización intercelular de cooperación a través de canales de unión brecha 4-8. Aunque los sistemas de señalización intercelular también son numerosos y bajo el control de vía múltiple, la señalización intercelular a través de canales de salida brecha es en última instancia una función de los canales de ser abierto, parcialmente cerrada o completamente cerrada. Esto proporciona un punto final que se puede medir fácilmente utilizando diversosen los sistemas de bioensayo in vitro 7. Teniendo en cuenta que el punto de ajuste homeostático de un tejido requiere canales abiertos, para determinar el efecto de los compuestos sobre la brecha ocasiones la comunicación intercelular (GJIC) es un enfoque más amplio para determinar los posibles efectos tóxicos de los compuestos 4,8. En esencia, este fenómeno biológico fundamental que desempeña un papel central en la coordinación de múltiples eventos de transducción de señales que controlan la expresión de genes permite una amplia evaluación de los efectos tóxicos. Por lo tanto, los bioensayos que evalúan la GJIC son un excelente punto de partida para evaluar el potencial tóxico de compuestos.

Los más extensas técnicas utilizadas para evaluar GJIC se basan en la precarga de las células con una sonda fluorescente y luego el control de la migración del colorante de la célula de carga o células a las células adyacentes. Las técnicas para precargar el colorante han implicado microinyección 9, raspar de carga 10, y metil ésteres de las sondas 11 . La transferencia de colorante de carga fluorescente bisturí método (SL-DT) es una modificación de la carga de raspadura - dye ensayo de transferencia desarrollado por El Fouly 10. En lugar de la raspadura más invasivo, el método de bisturí de carga de este informe implica un rollo suave de un escalpelo con una cuchilla redonda a través de una monocapa de células que reduzcan al mínimo el daño invasiva (Figura 1). Las ventajas de esta técnica son la evaluación toxicológica de una población de células en lugar de células individuales del ensayo de microinyección. Además, la simplicidad de este ensayo permite la detección rápida de múltiples placas en un corto tiempo mientras que los métodos que utilizan técnicas de microinyección y técnicas que usan ésteres metílicos de sondas fluorescentes son que consume mucho más tiempo y requieren considerablemente más alto nivel de habilidad.

Aunque no existe un método único para satisfacer todas las necesidades de estudiar la GJIC; el ensayo SL-DT es un ensayo simple, bastante barato y versátil que puedesatisfacer muchas de las necesidades de las evaluaciones iniciales de la toxicidad de diversos compuestos. Las principales ventajas son: simplicidad, no hay necesidad especial para el equipo o las habilidades que se requieren para otros métodos tales como la microinyección, la recuperación de fluorescencia después de photobleaching ensayo (FRAP) y la activación local de ensayos de sondas fluorescentes moleculares, una evaluación rápida y simultánea de GJIC en un gran número de células, que conduzca a un alto rendimiento de la configuración con fluorescencia automatizado de formación de imágenes de microscopía y análisis, así como su capacidad de adaptación para los estudios in vivo.

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Protocolo

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El protocolo de este estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales y el Aprovechamiento de los Institutos Nacionales de Ciencias de la Salud de Japón, que es donde los experimentos in vivo se realizaron, para asegurar que las ratas fueron tratadas con humanidad y respeto por aliviar el sufrimiento.

1. SL-DT Bioensayo

  1. Seed 3 10 5 WB-F344 células epiteliales de hígado de rata Onto 35 placas de cultivo de diámetro mm x contienen Eagles Modificado Medio más suero bovino fetal al 5%, y cultivar las células en una incubadora a 37 ºC, 100% de humedad relativa (RH), 5% CO 2.
  2. Cultivar las células hasta que llegan a 100% de confluencia (típicamente, 2 días) y llevar a cabo el tratamiento experimental deseado de las células como se describe a continuación.
    1. Lleven a cabo experimentos de dosis de respuesta
      1. Añadir 10 l y 20 l de una solución 2 mM de stock de fenantreno en 100% de acetonitrilo y 4 l, 6 l, y 8 l de una solución madre 20 mM de phenanthrene en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada volumen añadido de la solución madre.
      2. Añadir 4 l, 6 l, 8 l, 10 l y 20 l de una solución 100% de acetonitrilo para tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada volumen añadido de solución de acetonitrilo para servir como el control del vehículo.
      3. Incubar las placas durante 15 minutos en una incubadora a 37 ° C, 100% de humedad relativa y 5% de CO 2.
      4. Continúe en el paso 1.3.
    2. Conducta Tiempo experimentos de respuesta
      1. Añadir 7 l de una solución madre 20 mM de fenantreno en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada punto de tiempo (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
      2. Añadir 7 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada punto de tiempo para servir como el control del vehículo.
      3. Incubar las placas para cada tiempo p designadomixto en una incubadora a 37 ° C, 100% de humedad relativa y 5% de CO2.
      4. Continúe en el paso 1.3.
    3. Lleven a cabo experimentos de tiempo de recuperación
      1. Añadir 7 l de una solución madre 20 mM de fenantreno en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento durante 15 min.
      2. Añadir 7 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento durante 15 min para servir como el control del vehículo.
      3. Decantar el medio que contiene el fenantreno o acetonitrilo y enjuague 3x cada uno con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      4. Añadir 2 ml de medio de crecimiento fresco a cada placa y se incuba durante los tiempos de recuperación deseado (es decir, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) en una incubadora a 37 ° C, 100 % HR y 5% de CO 2.
      5. Continúe en el paso 1.3.
    4. Los experimentos Mecanismo de Conducta
      1. Añadir el inhibidor de la transducción de señales, es decir,
      2. Añadir 5 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento durante 15 min para servir como el control del vehículo.
      3. Añadir 7 l de una solución madre 20 mM de fenantreno en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento más el D609 para un 15 min adicionales.
      4. Añadir 7 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento más el 100% de acetonitrilo durante 15 min adicionales para servir como el control del vehículo.
      5. Continúe en el paso 1.3.
  3. Descartar el medio de cultivo por cualquiera suavemente vertiendo el medio o por succión al vacío.
    Nota: Eliminar el medio de cultivo que contiene residuos peligrosos adecuadamente.
  4. Enjuagar las células tres veces cada uno con 3 ml de PBS y, o bien decantación o aspirado between enjuaga.
  5. Pipetear 1 ml de 1 mg / ml de Lucifer Yellow colorante disuelto en PBS (LY) en cada placa de células.
  6. Precargar el medio de contraste en las células rodando suavemente una hoja de acero quirúrgico # 20 con un borde redondeado a través de una población de células en tres áreas diferentes de la placa.
    1. Comience colocando el bisturí perpendicular (90 ° de ángulo) y 5 mm desde el borde de la placa de cultivo, y luego rodar el bisturí desde este ángulo perpendicular a aproximadamente un ángulo de 15 ° (véase la Figura 1).
      Nota: Esto se logra apretando el bisturí entre el dedo índice y el pulgar. Utilizar la gravedad para permitir que el bisturí para ir suavemente desde los 90 ° a 15 ° posición (como la hoja redondeada simplemente rueda sobre las células). Este movimiento dejará una línea de muesca visualmente perceptible.
  7. Se incuban las células con la solución de LY durante 3 min a temperatura ambiente.
  8. Decantar o aspirar el LY y enjuagar tres veces con 3 ml de PBS para recoger todos extracellular teñir para eliminar la fluorescencia de fondo extracelular.
  9. Añadir 0,5 ml de solución de formalina tamponada con fosfato 10% para fijar las células.
    Nota: Después de la fijación en formol, el aire seco de las células y almacenar en la oscuridad durante un máximo de dos años con photobleaching mínima del colorante LY. Cuando se requiera, rehidratar con solución de formalina al 10% para visualizar el frente de colorante fluorescente.
  10. Ver las células fijadas usando un microscopio de epifluorescencia equipado con un cubo dicroico para los picos de excitación / emisión de 428/536 nm con un aumento de 200X. Alinear todas las placas de manera que la línea de indentación es paralela al campo de visión horizontal.
    Nota: Un cubo FITC dicroico funciona bien.
    1. Capturar la imagen con una cámara CCD y el software de soporte.
      1. Abra el software de soporte para la cámara CCD y el uso de los ajustes de exposición automática. Usa el botón de "captura" para adquirir digitalmente la imagen. Guarda la imagen como archivos .tif utilizando el botón "Guardar".

2. Adaptación de la SL-DT Ensayo de tejido hepático

  1. Eliminar aproximadamente un cm rebanada 2 x 2 del lóbulo izquierdo del hígado de una a 5 semanas de edad, utilizando macho Fischer 344 ratas tijeras de disección y colocarlo en un plástico pesan plato cubierto con una gasa húmeda 12.
  2. Pipetear 0,5 ml de una solución de PBS que contiene 1 mg / ml cada uno de amarillo lucifer y rodamina-dextrano (RD) sobre la superficie de la rodaja de hígado en el plástico pesan placa.
    Nota: La RD es un colorante que no pueden atravesar los canales de salida brecha y marcará las células que fueron cargados.
  3. Hacer tres a cinco incisiones de aproximadamente 1 cm de largo en la superficie de la rodaja de hígado que tiene la solución de colorante en la placa de pesaje con una hoja afilada y luego añadir colorante adicional suficiente para llenar las incisiones.
  4. Incubar el tejido durante 3 minutos a temperatura ambiente en el plástico pesan placa.
  5. Enjuague tres veces con 5 ml de PBS.
  6. Fijar el tejido ovedejarían de en 30 ml de 10% de formalina tamponada con fosfato en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml en la oscuridad a temperatura ambiente.
  7. Al día siguiente, lavar las rodajas con agua, recortar el tejido alrededor de la incisión con tijeras de disección en 1 x 1 x 0,5 cm 3 tiras y luego usar técnicas estándar para incrustar las rebanadas en parafina 13.
  8. Sección las rebanadas perpendiculares a la línea de incisión para espesor de 5 micras y almacenar las muestras en la oscuridad hasta que esté listo para obtener imágenes utilizando técnicas estándar de seccionamiento con un micrótomo 13.
  9. Utilizar un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara digital CCD para visualizar y capturar las imágenes de los frentes de tinte fluorescente de acuerdo a la sección 1.10 7.

3. Cuantificación de la GJIC

  1. Medir la propagación colorante fluorescente utilizando un paquete de software de morfometría (por ejemplo, ImageJ).
    1. Haga clic en la ficha "Archivo" y haga clic en "abrir" para abrir elsalvado imagen.
    2. Haga clic en la "Herramienta de mano libre" en la barra de herramientas Tab para trazar el contorno de la frente de colorante.
    3. Haga clic en la pestaña "Analizar" y haga clic en "Medida".
      Nota: Esto generará un valor de área en una hoja de cálculo, que puede ser copiado en otros programas de hoja de cálculo, si se desea.
  2. Utilizando un programa de hoja de cálculo, calcular la fracción de la control (FOC) dividiendo el área de la propagación colorante en la placa experimental por el área del colorante viajó en la placa de control utilizando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-1
    A e = área de la propagación de colorante en las células expuestas a una variable experimental, tales como las células tratadas con un producto químico en una dosis o tiempo específico
    A c = área de la propagación de colorante en el control, que son las células tratadas con el vehículo usado para disolver el producto químico de interés
    Nota: Para determinar el efecto del vehículo,A e sería el área de la propagación de colorante en las células tratadas por el vehículo y A c sería la zona de la propagación de colorante en las células no tratadas por el vehículo. El efecto del vehículo debería ser preferiblemente menor que 10%.

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Resultados

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Interrupción de la GJIC se ha utilizado ampliamente como un biomarcador para la identificación de compuestos tóxicos en el nivel no genotóxico, epigenética de control del gen que induce efectos adversos para la salud 14. Por ejemplo, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son contaminantes ubicuos del entorno, pero varían en sus toxicidades epigenéticos como una función de sus estructuras moleculares 15. Los HAP de menor peso molecular se encuentran normalmente...

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Discusión

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El ensayo SL-DT es una técnica sencilla y versátil en la medición de la GJIC, pero hay varios problemas críticos que deben ser explicados en el diseño de protocolos experimentales apropiados. Para las mediciones robustas de GJIC utilizando el ensayo de SL-DT tiene que haber un tinte de propagación de la LY a través de uniones de las células. Como mínimo, un tiempo adecuado se debe seleccionar para asegurar que el tinte se propaga a través de ocho o más filas de células a partir de las células de bisturí cargado en ambas...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con el apoyo de las subvenciones #R01 ES013268-01A2 del NIEHS, y los contenidos son únicamente responsabilidad del autor y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales del NIEHS, y con el apoyo del proyecto CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
WB-F344 células epiteliales de hígado de rataDe los Dres. J. W. Grisham y M. S. Tsao de la Universidad de Carolina del Norte (Chapel Hill, NC)ningunaProporcionada por los Dres. J. W. Grisham y M. S. Tsao Universidad de Carolina del Norte-Chapel Hill-NC
Placas de cultivo de 35 mmCorning430165
matraces de cultivo de 25 cm2Corning 430639
Matraces de cultivo de 75 cm2Corning430641
D-medium, un medio modificado para Eagles ThermoFisher/GIBCO Fórmula No. 78-5470EF
suero fetal bovinoThermoFisher/GIBCO 10437
0,25% tripsina-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
solución salina tamponada con fosfatocaseraver a continuación el ingrediente cat#137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Baker - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
Lucifer Amarillo CH, sal de litioSigma-Aldrich ChemicalL0259
rodamina-dextranoSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-metilantracenoSigma-Aldrich Chemical
fenantrenoSigma-Aldrich ChemicalP11409
resveratrolSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609Tocris Biociencia 1437
acetonitrilEMDAX0145-1
solución al 37% formaldehído JTBaker - Mallinckrodt 2106-01
#20 cuchilla quirúrgicaFine Science Tools Inc. 10317-14
Tubos estériles cónicos de 50 mlThermo scientific 
Microscopio de epifluorescencia Nikon Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Cubo dicroico Nikon FITCNikon -Mager Scientific96107
Nikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ Sistema de
imagenNikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2.
ImageJInstituto Nacional de Salud http://imagej.nih.gov/ij/
339652 Cámara CCD Sistema de imagen CCD

Referencias

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Transferencia de colorante fluorescente mediante carga de bisturtransferencia del colorante Lucifer Yellowmicroscop a de epifluorescenciaensayo de toxicidad del fenantrenoperturbaci n de la membrana celularan lisis de migraci n de coloranteevaluaci n de los efectos de t xicostoxicolog a in vitroensayo de biomarcadores funcionales

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