Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Summary

Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.

Abstract

La arquitectura de los órganos ramificados como los pulmones, los riñones y las glándulas mamarias surge a través del proceso de desarrollo de la morfogénesis ramificada, que está regulado por una variedad de señales solubles y físicas en el microambiente. Aquí se describe un método creado para estudiar el proceso de morfogénesis ramificada mediante la formación de tejidos epiteliales tridimensionales (3D) de forma y tamaño definidos que están completamente incrustados dentro de una matriz extracelular (MEC). Este método permite la formación de matrices de tejidos idénticos y permite el control de una variedad de factores ambientales, incluida la geometría del tejido, el espaciamiento y la composición de la MEC. Este método también se puede combinar con técnicas ampliamente utilizadas, como la microscopía de fuerza de tracción (TFM) para obtener más información sobre las interacciones entre las células y su ECM circundante. El protocolo se puede utilizar para investigar una variedad de procesos celulares y tisulares más allá de la morfogénesis ramificada, incluida la invasión del cáncer.

Introduction

El desarrollo de los tejidos epiteliales ramificados, conocidos como la morfogénesis de ramificación, está regulada por factores ambientales, y derivados de células, físicos. En la glándula mamaria, la morfogénesis de ramificación es un proceso iterativo mediante el cual guiada migración celular colectiva crea una arquitectura de árbol. El primer paso es la formación de yemas primaria de los conductos de la leche, seguido de la iniciación y elongación rama de ^1,2. La invasión de las ramas en el estroma circundante es inducida por la liberación sistémica de hormonas esteroides en la pubertad. Nuevos brotes primarios inician entonces desde los extremos de la....

Protocol

1. Preparación de soluciones

1. Para preparar una solución de 5 mg / ml de insulina, se diluye la insulina de stock en polvo con 5 mM de ácido clorhídrico (HCl) en dH ₂ O (500 mg de insulina en 100 ml de disolvente). Preparar 100 ml de disolvente mediante la adición de 50 l de HCl concentrado a 100 ml de agua destilada _(dH2O).
2. Para hacer una solución de PBS 1x de, diluir la solución madre 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1x con _dH2O en condiciones estériles.
3. Preparar el (PDMS) de elastómero de polidimetilsiloxano solución de la siguiente manera: mezclar el prepolímero PDMS junto con el agen....

Results

Esquemática general de microfabricación tejido epitelial mamaria

Un esquema general del procedimiento de microfabricación esbozar el flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura 1. El resultado final es una matriz de los tejidos epiteliales de la geometría idéntica y el espaciamiento que se incrustan completamente dentro de un gel de ECM. Un experimento representativo utiliza células epiteliales mamarias EpH4 de rató.......

Discussion

El protocolo descrito anteriormente describe un método para producir tejidos epiteliales idénticos de forma predefinida, lo que permite el control espacial del estrés mecánico experimentado por las células en el tejido. Se utiliza un molde elastomérico para crear cavidades en el colágeno tipo I que luego se llenan con células epiteliales y se cubren con una capa adicional de colágeno de modo que las células están completamente encapsuladas en un entorno de matriz de colágeno 3D. El cultivo adicional de estos tejidos y el.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS agente de curado	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Maestro de silicio con patrón litográfico	a sí mismo	N/A
Bote de pesaje de plástico	Fisher Scientific	08-732-115
Placas de Petri de 100 mm de diámetro	BioExpress	D-2550-2
Alcohol etílico 200 prueba	Pharmco-Aaper	111000200	Haga una solución de EtOH al 70% (v: v) mezclándola con dH2O
Hoja de afeitar American	Safety Razor 620179
1:1 Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio : Jamón' s F12 Mezcla de nutrientes (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
Suero Fetal Bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s solución salina equilibrada (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulina	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicina	Life Technologies	15750-060
10x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bovino colágeno tipo I (no pepsinizado)	Koken	IAC-50
Albúmina de suero bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Pinzas curvas de acero inoxidable	Dumont	7
placas de cultivo de tejidos de 35 mm de diámetro	BioExpress	T-2881-6
Tubos cónicos de 15 ml	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Circular #1 cubreobjetos de vidrio, 15 mm de diámetro	Bellco Glass Inc.	Pedido
0.05% 1x Tripsina-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldehído	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergente
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Resuspendido en dH2O a 50 mg/ml
Conejo anti-ratón Anticuerpo FAK	Life Tecnologías	AMO0672
Cabra anti-conejo Alexa 488 anticuerpo	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Se utiliza para codificar por colores los mapas de frecuencia de píxeles.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Software gratuito de análisis de imágenes que se utiliza para umbralizar, registrar y superponer imágenes para crear un mapa de frecuencia de píxeles. El plugin StackReg se utilizó para registrar imágenes binarias.