Artículo de método

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

DOI:

10.3791/54296

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18 de octubre de 2016

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1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

En este artículo

Resumen

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Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

Resumen

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Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos del sistema inmunitario que desempeñan un papel crucial en las respuestas de los linfocitos, los mecanismos de defensa del huésped y la patogénesis de la inflamación. El aislamiento y el estudio de las CD han sido importantes en la investigación biológica debido a sus características distintivas. Aunque son mediadores esenciales del sistema inmunitario, las CD son muy raras en la sangre, ya que representan aproximadamente entre el 0,1 y el 1% del total de células mononucleares sanguíneas. Por lo tanto, las alternativas para los métodos de aislamiento se basan en la diferenciación de las CD de los monocitos aislados de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Es imperativo tener en cuenta la utilización de técnicas de aislamiento adecuadas que combinen simplicidad, asequibilidad, alta pureza y alto rendimiento de las células. En el presente estudio, se compararán dos métodos distintos para la generación de CD. Los monocitos se seleccionaron por adherencia o se enriquecieron negativamente mediante el procedimiento de separación magnética seguido de diferenciación en CD con IL-4 y GM-CSF. La viabilidad, proliferación y fenotipo de los monocitos y MDDC se evaluaron mediante colorantes de viabilidad, ensayo MTT y análisis de marcadores de superficie CD11c/CD14 mediante citometría de flujo por imágenes. Aunque el método de separación magnética produjo un porcentaje significativamente mayor de monocitos con mayor capacidad proliferativa en comparación con el método de adhesión, los hallazgos han demostrado la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar y diferenciarse en MDDC CD11c+ viables después de siete días en cultivo. Ambos métodos arrojaron > 70% de MDDC CD11c+. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan información que contribuye al desarrollo de métodos fiables para el aislamiento y la caracterización de las CD humanas.

Introducción

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Las células dendríticas (DC) son mediadores esenciales de los sistemas inmune innata y adaptativa. Funcionan para inducir respuestas inmunes primarias y facilitar el desarrollo de la memoria inmunológica. Estas células son los principales responsables de captura de antígeno, la migración y la estimulación de las células T y por lo tanto se conocen como células presentadoras de antígenos (APC) profesionales 1 .Manipulation de países en desarrollo podría ser utilizado en una amplia variedad de campos de investigación y en la práctica clínica para el tratamiento de diferentes enfermedades inflamatorias tales como el VIH 6,7, cáncer, enfermedades autoinmunes 8 9, y las respuestas alérgicas 10. DCs también se están utilizando para la investigación de abuso de sustancias con el fin de resolver los mecanismos desconocidos y vías, tales como los asociados con la dependencia del alcohol 11 a 14, la dependencia de drogas 13,15, y la combinación de la infección y la sustancia VIH abuso 16-19. Estos estudios en curso y futuros estudios de investigación in el campo de la inmunología hacer en la generación in vitro de los países en desarrollo muy importante para la investigación. Sin embargo, hay varias dificultades asociadas con el aislamiento de las DC a partir de sangre humana, ya que sólo constituyen 0,1 a 1% de las células mononucleares de sangre total 20.

Hasta la fecha, algunos de los métodos bien establecidos para la generación de DCs in vitro consiste en plástico o vidrio adherencia de monocitos 21,22, densidad de centrifugación en gradiente de 23, la separación basada marcador específico tal como de células activadas por clasificación magnética 22, de células activadas por fluorescencia de clasificación 24, la selección positiva de los monocitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas recubiertas de dextrano 25, y el rápido aislamiento de los monocitos altamente purificados usando selección celular negativa totalmente automatizado 26. Sin embargo, el mejor método de elección sigue siendo controvertido. Por lo tanto, para mejorar las técnicas de generación de corriente continua, varios métodos han sido desarrollados en la quela pureza de estas células se puede aumentar en gran medida por la diferenciación de las células y los monocitos purificados progenitoras CD34 + aisladas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) 27. Como se ha mencionado antes, un método ampliamente utilizado y popular para la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) es explorar la capacidad de los monocitos se adhieran al vidrio o plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es un método rápido y sencillo que no requiere el uso de equipos complejos. Sin embargo, algunas desventajas de este proceso incluyen la contaminación de linfocitos, baja flexibilidad, y monocitos manipulación transitoria 28. Un método alternativo al método de adhesión es el aislamiento magnético de los monocitos de PBMC totales, en particular con el uso de un kit de monocitos enriquecimiento humano, que está diseñado para aislar los monocitos de PBMC por selección negativa 26. Durante este procedimiento, las células no deseadas son objeto de extracción con tetraméricacomplejos de anticuerpos y partículas magnéticas recubiertas de dextrano. La ventaja de este método de aislamiento es que las células marcadas no deseadas se separan mediante un imán, mientras que las células diana se pueden verter libremente fuera en un nuevo tubo sin necesidad de columnas. Hasta la fecha, con la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos que pueden etiquetar las poblaciones de células únicas, la técnica de separación magnética se ha convertido en no simplemente un método adicional, sino una necesidad para el aislamiento de células raras en el campo de la inmunología. Por ejemplo, las técnicas tales como clasificación celular magnética con paramagnéticas disponibles comercialmente MACS-nanopartículas han facilitado el desarrollo de nuevos enfoques para la investigación y aplicaciones clínicas 22,29. Por otra parte, los estudios de investigación recientes que comparan la generación de DC a partir de métodos de adherencia de monocitos y la tecnología MACS han demostrado una mayor pureza y la viabilidad de CC utilizando MACS monocitos 22,30 separadas.

Los presentes estudios actualesuna comparación entre dos métodos para la generación de DCs humanas de monocitos aislados de PBMC: 1) los monocitos de aislamiento por adherencia y 2) el aislamiento de monocitos por selección negativa utilizando un kit comercial de monocitos enriquecimiento humano. Este estudio proporciona evidencia para demostrar que la selección procedimiento de separación magnética negativa para aislar monocitos genera el mayor rendimiento de monocitos con diferencias significativas en la viabilidad de monocitos en comparación con los monocitos aislados por el método de adherencia. A su vez, después de siete días, los monocitos aislados por separación magnética diferencian en MDDCs con significativamente mayor capacidad de proliferación y una mayor cantidad de células que expresan doble positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo sin afectar MDDC viabilidad. En general, el estudio actual se diferencia de los estudios anteriores mencionadas anteriormente, ya que demuestra la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar y diferenciarse en CD11c +MDDCs (> 70%) después de siete días en cultivo sin comprometer su viabilidad. Además, el enfoque actual prevé la primera caracterización de tiempo / poblaciones diferentes CD11c CD14 MDDCs por el flujo de imágenes citometría.

En resumen, ya que los países en desarrollo desempeñan un papel central en relación con la investigación en el campo de la inmunología, diferentes parámetros deben tenerse en cuenta a la hora de considerar cómo se han obtenido y qué métodos se utilizan para aislar y cultivar en vitro. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo proporcionar información sobre dos diferentes métodos de aislamiento de monocitos y cómo estos métodos afectan diferencialmente la viabilidad de monocitos y el rendimiento con el tiempo afecta a la viabilidad de células dendríticas, proliferación y fenotipo. Estos hallazgos contribuirán en gran medida al campo de la inmunología y proporcionarán un protocolo detallado de DC aislamiento, purificación y caracterización.

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Protocolo

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Los estudios de sangre humana en general han sido revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la UIF, el protocolo IRB # aprobación del IRB-13-0440. leukopaks humanos se adquirieron en el banco de sangre de la comunidad en Miami, FL.

1. Aislamiento de PBMC por Norma Técnica gradiente de densidad

  1. Realizar una dilución 1: 1 de sangre con solución salina tamponada con fosfato 1x-en un matraz T75.
  2. Pipetear 15 ml de la solución de gradiente de densidad en 50 ml tubos de centrífuga y cuidadosamente capa (25 - 30 ml / tubo) de la sangre diluida sobre este gradiente.
  3. Centrifugar durante 20 min a 1.200 xg con una aceleración de 1 y deceleración de 0.
  4. Después de la centrifugación, recoger la capa de interfaz (células blancas de la sangre) en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y lavar las células dos veces en PBS (3 min a 1.080 xg). Desechar el sobrenadante cada vez.
  5. Tratar las células con tampón de lisis de amonio-cloruro de potasio (ACK) (para lisar las células rojas de la sangre). Añadir 10 ml de tampón y enCubate durante 15 min a 4 ° C.
  6. Lavar las células dos veces con PBS, centrifugar durante 3 minutos a 1.080 xg y desechar el sobrenadante cada vez.
  7. Guardar el precipitado, el cual contendrá los PBMCs.
  8. Proceder con método de purificación de monocitos de elección.

2. Monocitos purificación por adherencia Método

  1. Preparar medio de cultivo celular completo que contiene L-glutamina (300 mg / ml) y suplementado con penicilina (50 U / ml) -streptomycin (50 mg / ml) y suero bovino fetal al 10%.
  2. Permitir PBMCs que se adhieran durante aproximadamente 2 horas por cultivo en un matraz T75 a una concentración de 5 x 10 7 células por 10 ml de medio completo a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador humidificado.
  3. Después de la incubación, retirar las células flotantes no adherentes del frasco de cultivo y lavar suavemente las células adherentes dos veces con PBS.
  4. Se incuban las células adherentes en medio de cultivo celular completo suplementado con 2 l / ml de granulocitos humano macrophage factor estimulante de colonias (GM-CSF) y la interleucina 4 (IL-4) se almacenan a una concentración de solución madre de 10 mg / ml.
  5. Cambiar la mitad del medio y reponer citoquinas cada 48 hr.
  6. Permitir 5 - 7 días para la diferenciación de los monocitos en MDDCs.

3. monocitos purificación por el Método de Separación Magnética

  1. Recoger PBMCs de técnica de gradiente de densidad estándar, se vierte en un tubo de poliestireno de 5 ml y volver a suspender en tampón PBS a una concentración de células / ml.
  2. Añadir cóctel de monocitos enriquecimiento humano usando células de 50 l / ml, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante 10 min.
  3. Después de la incubación, añadir partículas magnéticas usando células 50 l / ml, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante 5 min.
  4. Llevar suspensión de células hasta un volumen total de 2,5 ml mediante la adición de tampón PBS, mezclar bien pipeteando arriba y abajo 2 - 3 veces.
  5. Coloque el tubo de poliestireno sin tapa en el dispositivo magnético y dejar de lado a TA durante 2.5 minutos.
  6. Después de la incubación y en un movimiento continuo, recoger el imán y verter la fracción de monocitos purificados deseada en un tubo limpio de centrifugación de 50 ml.
  7. Se incuban las células adherentes en medio completo de cultivo celular suplementado con 2 l / ml de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) humano y la interleucina 4 (IL-4) se almacenan a una concentración de solución madre de 10 mg / ml.
  8. Cada 48 horas, cambie la mitad del medio, girar hacia abajo a 1.080 xg durante 5 min y una nueva suspensión de pellets con nuevos medios (cRPMI) y citoquinas.
  9. Permitir 5 - 7 días para la diferenciación de los monocitos en MDDCs.

4. Trypan Blue ensayo de exclusión de viabilidad

Nota: Utilice esta técnica para obtener el rendimiento de células y la viabilidad de las PBMC, monocitos, y MDDCs.

  1. células de la cosecha utilizando estándar de tripsina-EDTA y realizar lavados de los frascos y el sedimento de células usando PBS. Dependiendo del tamaño de la pastilla, resuspender en 5 a 10 ml de PBS para disolver el sedimento.
  2. En un tubo de microcentrífuga, lleve a cabo una dilución 1: 1 de reactivo de azul de tripano con sedimento celular diluido.
  3. De esta mezcla, alícuota de 10 l en un recuento de células de diapositivas y leer los resultados usando un contador de células automatizado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Si un contador de células automatizado no está disponible, un recuento de células similares es posible utilizando un hemocitómetro o un contador manual.

5. Ensayo MTT

  1. Células de la placa a una concentración de 4 x 10 4/100 l de medio completo en cada pocillo en una placa de 96 pocillos. Permitir 24 horas para que las células se adaptan a la cultura.
  2. Incubar y realizar lecturas a 0 (día 0), 36 (día 3) y 84 (día 7) hr respectivamente.
  3. Al término de la incubación se desea, eliminar el medio y reemplazar con 100 l de PBS solo.
  4. Preparar 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio solución de bromuro (MTT) (5 mg / ml) mediante la adición de 10 ml de DiMethsulfóxido il (DMSO) a 1 g de dodecilsulfato de sodio (SDS).
  5. Añadir 10 l (5 mg / ml) de solución de MTT a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 2 horas adicionales.
  6. Después de la incubación, retirar los sobrenadantes que contienen PBS y la mezcla de MTT no convertido (solución de color amarillo-color).
  7. Añadir 100 l de solución de SDS-DMSO a cada pocillo e incubar durante una hora adicional.
  8. Leer la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de microplacas.

6. Análisis de Superficie Celular La tinción por Imaging Citometría de Flujo

  1. Después de 7 días de diferenciación a partir de monocitos purificados, dispensar 1x10 6 alícuotas celulares de las células dendríticas derivadas de monocitos en el número apropiado de tubos de 1,5 ml.
  2. Comienza por tinción de la superficie celular por las células de bloqueo utilizando 50 l de inactivado por calor (HI) en suero humano, se incuba a 4 ° C durante 10 min.
  3. Después de la incubación, centrifugar las células a 720 xg durante 5 minutos, desechar el sobrenadante.
  4. A los teléfonos pellet, añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo respectivos (por ejemplo, anti-CD11c o anti-CD14) y se incuba a 4 ° C durante 20 min protegidas de la luz. En tubos separados, preparar individuales fluorocromo manchado muestras / ml), ya que se necesitan para la compensación.
  5. Después de la incubación, lavar las células dos veces en 1 ml de tampón PBS y se centrifuga cada vez a 720 xg durante 5 min.
  6. Mantener células protegidas de la luz, re-suspender en tampón PBS a una concentración de células / 100 l para citometría de flujo análisis.
  7. Con el fin de puerta en células viables, añadir 1 l de DAPI a cada tubo antes de la adquisición de las células en el flujo único de imágenes de células citometría de instrumento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Análisis estadístico

  1. Introducir todos los datos en una hoja de cálculo.
  2. Comparación de los resultados utilizando la prueba t de estudiante y / o ANOVA de una vía, según proceda.
  3. Considere diferencias estadísticamente significativas si p <0,05.

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Resultados

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Rendimiento de los monocitos por separación magnética es mayor en comparación con los monocitos por adherencia Rendimiento Método

Los datos presentados en la Figura 1 PBMC pantalla y los recuentos de células de monocitos por el método de exclusión con azul de tripano en el día del aislamiento de PBMCs y la separación de los monocitos. En promedio, los monocitos aislados mediante el método de l...

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Discusión

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Sobre la base de las dificultades conocidas de aislar y generar MDDCs a partir de sangre humana, el presente estudio tuvo como objetivo proporcionar una comparación exhaustiva de los dos métodos bien establecidos para la generación de MDDCs. El primer método en comparación es un método tradicional bien establecida para la generación de MDDCs mediante la explotación de la capacidad de los monocitos para adherirse al vidrio o de plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es rápido y renta...

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Divulgaciones

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Todos los autores no revelan intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Esta investigación está respaldada por el Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo, premio K99/R00 AA021264. Se ha recibido apoyo de laboratorio adicional como parte del paquete inicial del Departamento de Inmunología, el Instituto de Farmacología Neuroinmune, la Facultad de Medicina Herbert Wertheim y la Oficina de Investigación y Desarrollo Económico de FIU. Gianna Casteleiro contó con el apoyo de NIH/NIGMS R25 GM061347. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03Debe utilizarse en RT
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Life Technologies10010-023
ACK Tampón de lisadoCalidad Biológica118-156-101
RPMI 1640 medioLife Technologies22400-089
Antibiótico-Antimicótico (100x)Life Technologies15240-062
Suero fetal bovino (FBS)Life Technologies16000-044
Tampón RoboSepStemCell20104
EasySep Kit de enriquecimiento de monocitos humanosStemCell19059
TC20 Contador celular automatizadoBio-Rad145-0101
FITC-DextranSigma AldrichFD4-100MG
Tinción azul de tripano (0.4%)Life Technologies15250-061
Synergy 2 lector multimodoBiotek7131000
XTT Biorreactivo de sal de sodio (XTT)Sigma AldrichX4626-100MG
Biorreactivo de dimetilsulfóxido (DMS)Sigma AldrichD8418-500ML
Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT)Sigma Aldrichm5655-500MG
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Bio-RAD161-0302
Metosulfato de fenazina (DMSO)Sigma AldrichP9626-1G
Suero humano inactivado (HI)ChemiconS1-100ML
Citómetro de flujo Accuri C6BD Accuri653119
FlowSight Citómetro de flujo AmnisEMD Millipore100300

Referencias

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Monocyte IsolationDendritic Cell GenerationImaging Flow CytometryMagnetic SeparationAdherence MethodCD11c CD14 AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsHuman Monocyte DifferentiationViability Proliferation AssessmentSingle Cell Analysis

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