Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.
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Artículo de método
Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos
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Resumen
Resumen
Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos del sistema inmunitario que desempeñan un papel crucial en las respuestas de los linfocitos, los mecanismos de defensa del huésped y la patogénesis de la inflamación. El aislamiento y el estudio de las CD han sido importantes en la investigación biológica debido a sus características distintivas. Aunque son mediadores esenciales del sistema inmunitario, las CD son muy raras en la sangre, ya que representan aproximadamente entre el 0,1 y el 1% del total de células mononucleares sanguíneas. Por lo tanto, las alternativas para los métodos de aislamiento se basan en la diferenciación de las CD de los monocitos aislados de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Es imperativo tener en cuenta la utilización de técnicas de aislamiento adecuadas que combinen simplicidad, asequibilidad, alta pureza y alto rendimiento de las células. En el presente estudio, se compararán dos métodos distintos para la generación de CD. Los monocitos se seleccionaron por adherencia o se enriquecieron negativamente mediante el procedimiento de separación magnética seguido de diferenciación en CD con IL-4 y GM-CSF. La viabilidad, proliferación y fenotipo de los monocitos y MDDC se evaluaron mediante colorantes de viabilidad, ensayo MTT y análisis de marcadores de superficie CD11c/CD14 mediante citometría de flujo por imágenes. Aunque el método de separación magnética produjo un porcentaje significativamente mayor de monocitos con mayor capacidad proliferativa en comparación con el método de adhesión, los hallazgos han demostrado la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar y diferenciarse en MDDC CD11c+ viables después de siete días en cultivo. Ambos métodos arrojaron > 70% de MDDC CD11c+. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan información que contribuye al desarrollo de métodos fiables para el aislamiento y la caracterización de las CD humanas.
Introducción
Las células dendríticas (DC) son mediadores esenciales de los sistemas inmune innata y adaptativa. Funcionan para inducir respuestas inmunes primarias y facilitar el desarrollo de la memoria inmunológica. Estas células son los principales responsables de captura de antígeno, la migración y la estimulación de las células T y por lo tanto se conocen como células presentadoras de antígenos (APC) profesionales 1 .Manipulation de países en desarrollo podría ser utilizado en una amplia variedad de campos de investigación y en la práctica clínica para el tratamiento de diferentes enfermedades inflamatorias tales como el VIH 6,7, cáncer, enfermedades au....
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Protocolo
Los estudios de sangre humana en general han sido revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la UIF, el protocolo IRB # aprobación del IRB-13-0440. leukopaks humanos se adquirieron en el banco de sangre de la comunidad en Miami, FL.
1. Aislamiento de PBMC por Norma Técnica gradiente de densidad
- Realizar una dilución 1: 1 de sangre con solución salina tamponada con fosfato 1x-en un matraz T75.
- Pipetear 15 ml de la solución de gradiente de densidad en 50 ml tubos de centrífuga y cuidadosamente capa (25 - 30 ml / tubo) de la sangre diluida sobre este gradiente.
- Centrifugar durante 2....
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Resultados
Rendimiento de los monocitos por separación magnética es mayor en comparación con los monocitos por adherencia Rendimiento Método
Los datos presentados en la Figura 1 PBMC pantalla y los recuentos de células de monocitos por el método de exclusión con azul de tripano en el día del aislamiento de PBMCs y la separación de los monocitos. En promedio, los monocitos aislados mediante el métod.......
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Discusión
Sobre la base de las dificultades conocidas de aislar y generar MDDCs a partir de sangre humana, el presente estudio tuvo como objetivo proporcionar una comparación exhaustiva de los dos métodos bien establecidos para la generación de MDDCs. El primer método en comparación es un método tradicional bien establecida para la generación de MDDCs mediante la explotación de la capacidad de los monocitos para adherirse al vidrio o de plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es rápido y renta.......
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Divulgaciones
Todos los autores no revelan intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Esta investigación está respaldada por el Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo, premio K99/R00 AA021264. Se ha recibido apoyo de laboratorio adicional como parte del paquete inicial del Departamento de Inmunología, el Instituto de Farmacología Neuroinmune, la Facultad de Medicina Herbert Wertheim y la Oficina de Investigación y Desarrollo Económico de FIU. Gianna Casteleiro contó con el apoyo de NIH/NIGMS R25 GM061347. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Debe utilizarse en RT |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Tampón de lisado | Calidad Biológica | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medio | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Tampón RoboSep | StemCell | 20104 | |
| EasySep Kit de enriquecimiento de monocitos humanos | StemCell | 19059 | |
| TC20 Contador celular automatizado | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Tinción azul de tripano (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 lector multimodo | Biotek | 7131000 | |
| XTT Biorreactivo de sal de sodio (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Biorreactivo de dimetilsulfóxido (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Bio-RAD | 161-0302 | |
| Metosulfato de fenazina (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Suero humano inactivado (HI) | Chemicon | S1-100ML | |
| Citómetro de flujo Accuri C6 | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Citómetro de flujo Amnis | EMD Millipore | 100300 |
Referencias
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Stein....
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Reimpresiones y permisos
