Artículo de método

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

DOI:

10.3791/54300

⸱

27 de septiembre de 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

En este artículo

Resumen

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Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante la última década ha habido un resurgimiento en el uso de protoplastos de plantas que van desde especies modelo para recortar las especies, para el análisis de las vías de transducción de señales, redes de regulación transcripcional, la expresión de genes, genoma de edición, y el silenciamiento de genes. Por otra parte, se ha hecho un progreso significativo en la regeneración de plantas a partir de protoplastos, que ha generado aún más interés en el uso de estos sistemas para la genómica de las plantas. En este trabajo, un protocolo ha sido desarrollado para la automatización de aislamiento de protoplastos y la transformación de 2 (A-2) un cultivo en suspensión de tabaco 'amarillo brillante' usando una plataforma robótica. Los procedimientos de transformación se validaron utilizando una proteína fluorescente de color naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) bajo el control del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (35S). expresión OFP en protoplastos se confirmó por microscopía de epifluorescencia. Los análisis también incluyen métodos de eficiencia de producción de protoplastos utilizando propidium yoduro. Por último, se utilizaron enzimas de grado alimenticio de bajo costo para el procedimiento de aislamiento de protoplastos, eludiendo la necesidad de enzimas de laboratorio de grado que son un costo prohibitivo en automatizada de alto rendimiento de aislamiento y análisis de protoplastos. Basado en el protocolo desarrollado en este trabajo, el procedimiento completo de aislamiento de protoplastos a la transformación puede llevarse a cabo en menos de 4 horas, sin ninguna entrada por parte del operador. Mientras que el protocolo desarrollado en este trabajo se validó con el cultivo de células BY-2, los procedimientos y métodos deben ser traducible a cualquier sistema de cultivo en suspensión planta / protoplastos, que debería permitir la aceleración de la investigación genómica de cultivos.

Introducción

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En los últimos años ha habido un importante impulso colocado en el diseño de los cultivos transgénicos para superar diversas enfermedades 1, dotar de resistencia al herbicida 2, conferir sequía 3,4 y tolerancia a la sal 5, prevenir herbivoría 6, aumentar la producción de biomasa 7, y disminuir la obstinación pared celular 8. Esta tendencia se ha visto favorecido por el desarrollo de nuevas herramientas moleculares para la generación de plantas transgénicas, incluyendo genoma de edición utilizando CRISPR y Talens 9, y el silenciamiento de genes a través de dsRNA 10, 11 miRNA y siRNA 12. Si bien estas tecnologías han simplificado la generación de plantas transgénicas, también han creado un cuello de botella, donde la gran cantidad de plantas transgénicas generadas no pueden ser examinados utilizando los sistemas tradicionales que se basan en la regeneración de plantas. En relación con este cuello de botella, mientras que el silenciamiento y construcciones de edición de genoma se pueden insertar rápidamente en plantas, muchos de losrasgos específicos no producen el efecto deseado, que a menudo no se descubre hasta que las plantas se analizan en el invernadero. En este trabajo, hemos desarrollado un método para la rápida detección automatizada, y de alto rendimiento de protoplastos de plantas, específicamente para hacer frente al actual bloqueo en la detección precoz de un gran número de genoma de edición y silenciamiento de genes objetivos.

El uso de protoplastos, en oposición a las células vegetales intactas, tiene varias ventajas para el desarrollo de una plataforma automatizada. En primer lugar, los protoplastos se aislaron después de la digestión de la pared celular vegetal, y con esta barrera ya no está presente, la eficiencia de transformación se incrementa 13. En las células vegetales intactas sólo hay dos métodos bien establecidos para la transformación biolística, 14 y transformación mediada por Agrobacterium 15. Ninguno de estos métodos se puede traducir fácilmente a plataformas de manejo de líquidos, como biolística requiere equipo especializado para transfoconfirmación, mientras transformación mediada por Agrobacterium requiere co-cultivo y la posterior eliminación de las bacterias. Tampoco son susceptibles de métodos de alto rendimiento. En el caso de protoplastos, la transformación se lleva a cabo rutinariamente utilizando polietilenglicol (PEG) transfección mediada por 16, que sólo requiere varios intercambios de solución, y es ideal para las plataformas de manejo de líquidos. En segundo lugar, los protoplastos, por definición, son cultivos de una sola célula, y por lo tanto los problemas asociados con la formación de grumos y de la cadena en cultivos de células vegetales, no se observan en los protoplastos. En cuanto a la detección rápida utilizando un espectrofotómetro basado en placas, agrupación de células o células en múltiples planos dará lugar a dificultades en la adquisición de mediciones consistentes. Desde protoplastos son también más denso que su medio de cultivo, que sedimentan en el fondo de los pozos, la formación de una monocapa, que es propicio para la espectrofotometría a base de placa. Por último, mientras que los cultivos en suspensión de células vegetales son primarily derivado de callus 17, los protoplastos se pueden cosechar a partir de un número de tejidos de la planta, dando lugar a la capacidad de identificar la expresión específica de tejido. Por ejemplo, la capacidad de analizar Raíz o expresión de hoja específica de un gen puede ser muy importante a la predicción fenotipo. Por estas razones, los protocolos desarrollados en este trabajo se validaron utilizando protoplastos aislados del tabaco utilizado ampliamente (Nicotiana tabacum L.) 2 (A-2) cultivo en suspensión 'amarillo brillante'.

El cultivo en suspensión BY-2 se ha descrito como la célula "HeLa" de las plantas superiores, debido a su uso ubicuo en el análisis molecular de las células vegetales 18. Recientemente, AP-2 células se han utilizado para estudiar los efectos de los factores de estrés vegetal 19-22, intracelular localización de la proteína 23,24, y la biología celular básica 25-27 demuestra la amplia utilidad de estas culturas en biología vegetal. Una ventaja adicional de la AP-2 culturas es lacapacidad de sincronizar los cultivos con afidicolina, que puede conducir a la reproducibilidad mejorada para la expresión génica estudia 28. Además, se han desarrollado métodos para la extracción de BY-2 protoplastos usando enzimas de bajo coste 29,30, como enzimas utilizadas tradicionalmente para generar protoplastos son costo prohibitivo para los sistemas de alto rendimiento. Como tal, el protocolo descrito a continuación ha sido validado con el cultivo en suspensión BY-2, pero debe ser modificable a cualquier cultivo en suspensión de células vegetales. Experimentos de prueba de concepto se realizan utilizando una proteína de la fluorescencia naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) de los Porites de coral Porites duros 31 bajo el control del promotor CaMV 35S.

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Protocolo

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1. Establecimiento de suspensión Cultivos Celulares

  1. Preparar líquido BY-2 medios de comunicación mediante la adición de 4,43 g Linsmaier y Skoog medios basales, 30 g de sacarosa, 200 mg de KH 2 PO 4, y 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 ml de agua destilada el agua y el pH a 5,8 con 0,1 M de KOH. Después de ajustar el pH, ajustar el volumen final a 1.000 ml con agua destilada y se autoclave. Los medios pueden ser almacenados hasta 2 semanas a 4 ° C.
  2. Inocular un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de líquido BY-2 medios de comunicación y una sola pieza de BY-2 del callo (> 1 cm de diámetro) cultivadas en sólidos BY-2 (del líquido BY-2 medios con la adición de 1% agar) y sellar con papel de aluminio. Incubar cultivo a 28-30 ° C con agitación durante 5 días.
    NOTA: POR-2 callo se mantuvo en medio sólido para almacenamiento a largo plazo, ya que los cultivos líquidos se cubran rápidamente. volumen de cultivo se puede ajustar según sea necesario, típicamente un cultivo de 100 ml será capaz de cargar treinta y tres 6-wplacas de ELL.
  3. Transferencia de 2 ml de la fase de registro BY-2 de cultivo a 98 ml de frescas medios BY-2 y se incuba durante 5-7 días a 28-30 ° C con agitación.
    NOTA: Sub-cultivo de cultivos líquidos establecidos puede llevarse a cabo utilizando regularmente 1: 100 diluciones de las culturas antiguas 5-7 día, en lugar de la inoculación con el callo.
  4. Mezclar a fondo la cultura, como las células se depositan rápidamente, y la transferencia de 6 ml del cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml de fondo cónico y dejar que las células se depositan durante al menos 10 min. Ajustar el volumen de células empaquetadas a 50% del volumen total mediante la eliminación de sobrenadante.
  5. Agitar tubo por inversión y pipeta de 500 l en cada pocillo de una placa de 6 pocillos para la digestión. Utilice pipetas de todo el taladro para transferir las células en esta etapa, ya que son densos y obstruye los puntas de pipeta estándar.

2. Aislamiento de protoplastos

  1. Encienda todos los componentes del sistema robótico (Figura 1) y abra la tarea de programar la placa motor suavemercancía. El programa de la programación de tareas integra el motor de microplacas con el resto del equipo para permitir la transferencia de las placas entre cada pieza del equipo.
  2. Antes de la experimentación, definir las especificaciones técnicas de los aparatos de laboratorio (por ejemplo, platos, tapas) utilizados en el protocolo, así como posiciones inicial y final de cada pieza de material de laboratorio, en el software de la placa de motor, de la siguiente manera:
    1. Haga clic en Configuración de la barra de herramientas principal en el software de la placa de motor y seleccione el contenedor de comandos Administrar tipos.
    2. Si el tipo de contenedor aparece en la biblioteca de tipos de contenedores existentes, a continuación, seleccione el contenedor adecuado.
    3. Si el tipo de envase no aparece en la biblioteca de tipos de contenedores existentes continuación, haga clic en Agregar para especificar un nuevo tipo de contenedor.
    4. Después de la adición de un nuevo tipo de contenedor, introduzca las dimensiones del nuevo contenedor (altura, anchura, dimensiones de apilamiento, y la pinza de compensación) en las fichas apropiadas y haga clic en Guardar.
      1. Si las dimensiones correctas no están disponibles por el fabricante, a continuación, determinar con precisión todas las dimensiones al milímetro más cercano usando calibres. Los errores en la medición de las dimensiones de los contenedores van a resultar en una falla del motor placa.
    5. Repita los pasos 2.2.2 a 2.2.4.1 para todos los tipos de contenedores que el motor placa tendrá que enfrentar. Después de la terminación de este paso para todos los aparatos de laboratorio, es necesario definir el comienzo y la ubicación final para cada contenedor (etapa 2.2.6).
      NOTA: Para este protocolo incluye el material de laboratorio de la placa de 6 pocillos, la placa de pozo profundo, y la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente.
    6. Para definir la posición de inicio y final de cada contenedor, haga clic en la pestaña de inicio / fin en un protocolo específico. En primer lugar, seleccionar la posición de inicio de cada contenedor. A continuación, marque la casilla de Lidded / Unlidded tanto en la posición inicial y final. Repita este procedimiento para todos los contenedores.
      NOTA: Si el contenedor será dejado en otro pedazo de equipment (en lugar de la placa de motor) la localización final puede dejarse en blanco.
  3. En esta etapa cargar manualmente todas las placas en la posición de partida para todo el flujo de trabajo. Cargar las placas de detección fluorescentes de 96 pocillos en hoteles 2, placas de 6 pocillos con células BY-2 en hotel 3, una placa de 96 pozos profundos que se utiliza para la transformación en calentador de placas / enfriador nido 2, y un cónico de 50 ml tubo que contiene la solución de enzima (véase el archivo de consulta, sección 1.2.2) en el dispensador de multi-modo.
    1. Si la transformación se lleva a cabo en el protocolo, pre-cargar la placa de pozo profundo 96 con 10 l de plásmido de ADN por pocillo (1 mg / l, A 260/280> 1,8) que contiene el constructo indicador OFP y se incuba en la placa calentador / refrigerador a 4 ° C. Cada pozo se utiliza para una sola transformación, por lo tanto el número de pozos llenos dependerá de la configuración experimental.
  4. Cargar todos los suministros y placas en el automaticed plataforma de manejo de líquidos en los lugares designados y definir la posición de cada elemento en el software de control de automatización (Figura 1B).
    1. Cargar una placa de 96 pocillos precargada con 200 l de 40% de PEG MMG (0,4 M de manitol, 100 mM de MgCl 2, MES 4 mM, pH 5,7) en la columna 1, 200 l de yoduro de propidio (PI, 1 mg / ml) en la columna 2, y 200 l de etanol en la columna 3 (nido 2), y una caja de puntas de pipeta en el nido 8.
    2. Para definir la ubicación del material de laboratorio en el software de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, seleccione Herramientas en el menú y haga clic en Editor de material de laboratorio.
    3. Seleccione el tipo de material de laboratorio en el menú desplegable o definir un nuevo tipo de material de laboratorio utilizando el botón Nuevo material de laboratorio.
    4. Definir la posición de cada pieza de material de laboratorio seleccionadas mediante la selección de la ficha Protocolo principal y haciendo clic en Configurar para laboratorio. Asegúrese de que cada pieza de material de laboratorio colocado en la plataforma de manejo de líquidos automatizado esdefinir antes de ejecutar el protocolo.
    5. Para activar los protocolos automatizados, haga clic en la ventana del perfil Explorer y seleccione el nombre del protocolo que va a ejecutar (el aislamiento de protoplastos, recuento de células, y la transformación mediada por PEG).
    6. Haga clic en Ejecutar para inicializar todos los dispositivos que serán utilizados en el protocolo.
    7. Por último, en la ventana del Explorador de trabajo, haga clic en Agregar unidad de trabajo para verificar todos los contenedores / material de laboratorio en el sistema y comenzar el protocolo automatizado.
      NOTA: Las descripciones completas de los protocolos automatizados están contenidas en el archivo suplementario.

3. Establecer curva estándar para contar las células

  1. Concentrar manualmente protoplastos a una concentración de 1 x 10 6 protoplastos / ml en un volumen de 1 ml. Centrifugar protoplastos a 1.000 xg durante 10 min, y eliminar el sobrenadante.
  2. Adición manual de 900 l de etanol al 70% (se mantiene a 4 ° C) al sedimento de protoplastosy volver a suspender el sedimento. Incubar durante 10 minutos en hielo para fijar las células.
  3. Añadir 100 l de PI (1 g / ml) a los protoplastos para etiquetar los núcleos y permitir la detección por el lector de placas.
  4. Carga de 80 l de líquido BY-2 medios en cada columna y fila de la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente a partir de la columna 2.
  5. En la columna 1 de una placa de cribado de 96 pocillos fluorescente, añadir 70 l de protoplastos y 50 l por 2 los medios de comunicación a cada pocillo en la columna.
  6. Colocar la placa en nido 6 de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, y ejecutar una serie de dilución de 2 veces.
    1. Para llevar a cabo una dilución en serie en la plataforma de manejo de líquidos automatizado, haga clic en Iniciar Asistente de dilución en serie y ajustar el volumen de transferencia (60 l), número de mezclas y volumen (2, 70 l), pozos iniciales (columna 1, filas AF), la dilución Wells (2-11 Columnas, Filas AF), y aspirar y dosificar propiedades (0,5 mm del fondo del pozo).
    2. Después de ajustar los parámetros, guardar unad ejecutar el protocolo.
      NOTA: Dado que todos los protoplastos se marcan con PI (debido a la fijación de las células), la fluorescencia es proporcional a la concentración de protoplastos.
    3. Después de que se completó la dilución en serie, retirar la placa de nido 9 y se insertan en el lector de placas y ejecutar el protocolo de curva estándar en el software lector de placas.
      NOTA: una curva estándar a continuación, se genera comparando la fluorescencia de PI (excitación 536 nm / emisión 620 nm) en cada pocillo con la concentración de protoplastos conocido.
  7. Tras la finalización del protocolo de lector de placas, eliminar la placa y recoger las células transgénicas para la esterilización en autoclave u otros procedimientos de-vitalizar tal como se definen en los protocolos de seguridad de la biotecnología.

4. Análisis microscópico de Transformación

  1. Retire la placa con protoplastos transformados (el producto de Protocolo Automatizado 3, Archivo Suplementario) del Hotel 1 del sistema robótico.
  2. Giroen microscopio invertido, cámara, y la lámpara fluorescente.
  3. Seleccione el objetivo de 10X para inicial se centra en los protoplastos, encender la lámpara de halógeno, y cerrar el obturador de la lámpara fluorescente.
  4. Carga de placa en el sistema microscópico y se centran en los protoplastos utilizando campo claro.
  5. Después de centrarse en protoplastos, apague la lámpara halógena y abrir el obturador de la lámpara fluorescente.
  6. Seleccione el filtro CY3 / TRITC establecido para la visualización de la proteína pporRFP expresada por los protoplastos transgénicos.
  7. Analiza cada pocillo para determinar el número de protoplastos que expresan la pporRFP marcador fluorescente.
  8. Calcular la eficiencia de transformación como el número total de protoplastos que expresan el marcador fluorescente el número total de protoplastos.
  9. Recoger las placas que contienen células transgénicas en bolsas de bioseguridad aprobados para el tratamiento en autoclave u otros procedimientos de-vitalizar tal como se definen en los protocolos de bioseguridad '.

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Resultados

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En el estudio actual, la tasa de duplicación de BY-2 varió desde 14 hasta 18 hr depende de la temperatura a la cual se incubaron los cultivos, coherente con los informes anteriores de una longitud media del ciclo celular de 15 hr. Con esta velocidad de duplicación, un 1: se utilizó el inóculo de partida 100 para iniciar los cultivos, lo que lleva a los cultivos con un volumen de células empaquetadas (PCV) de 50% en 5-7 días. En el protocolo actual, en el que se hicieron crecer cultivos e...

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Discusión

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El protocolo descrito anteriormente ha sido validado con éxito para el aislamiento de protoplastos, enumeración, y la transformación mediante el cultivo de células de tabaco suspensión BY-2; Sin embargo, el protocolo puede ampliarse fácilmente a cualquier planta de cultivo en suspensión. En la actualidad, el aislamiento de protoplastos y la transformación que se ha logrado en numerosas plantas, incluido el maíz (Zea mays) 10, la zanahoria (Daucus carota) 32, el álamo (Populus ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada - Energía (ARPA-E) Premio No. DE-AR0000313.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Orbitor RS Transportador de microplacasThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Lector multimodoBioTek
MultiFlo FX Dispensador multimodoBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Calefactor/enfriador ultraplanoInheco
Vworks Software de automatizaciónAgilentSoftware utilizado para controlar y escribir protocolos para Agilent
Bravo Momentum SoftwareThermo ScientificSoftware de programación de tareas para el control de Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekutilizado para controlar y escribir protocolos para
el microscopio invertido MultiFlo FX IX81Olympus
Zyla de 3 grifosAndor
ET-CY3/TRITC Juego de filtrosChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Frasco de muestra de enzimascelulasa de bajo costo
Rohapect UFAB Frasco de muestra de enzimaspectinasa de bajo costo
Rohapect 10LAB Frasco de muestras de enzimaspectinasa/arabinasa de bajo costo
Linsmaier & Skoog Medio basalLaboratorios de fitotecnologíaL689
Ácido 2,4-diclorofenoxiacéticoLaboratorios de fitotecnologíaD295
yoduro de propidioSigma AldrichP4170
Poli(etilenglicol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-Fanteriormente Fluka PEG
Yoduro de propidioFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Acetato de sodioFisher ScientificBP333-500
ManitolSigma AldrichM1902-1KG
SacarosaFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher Scientific AC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
Placa de 6 pocillosThermo Scientific103184
Placa de pocillos de 1,2 ml de 1,2 ml de pocillosThermo ScientificAB-0564
Placa inferior óptica de 96 pocillosThermo Scientific165305
Finntip 1000 Puntasde pipeta de diámetro anchoThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500
7000190Cámara microscópica

Referencias

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  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13(2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831(2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

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