Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

Summary

Se describe un método mediante el cual se pueden utilizar nanopartículas de puntos cuánticos (QD) para estudios inmunocitoquímicos correlativos de tejido de patología humana incrustado en epoxi. Empleamos QDs conjugados con fragmentos de anticuerpos comerciales que se visualizan mediante microscopía de luz de fluorescencia de campo amplio y microscopía electrónica de transmisión.

Abstract

Se describe un método por el cual las nanopartículas punto cuántico (QD) pueden ser utilizados para estudios de inmuno correlativos de tejido patología humana utilizando fluorescencia de campo amplio microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para demostrar el protocolo hemos immunolabeled secciones ultrafinas epoxi de tumor somatostatinoma humano usando un anticuerpo primario a la somatostatina, seguido de un anticuerpo secundario biotinilado y estreptavidina conjugada con la visualización 585 nm cadmio-selenio (CdSe) puntos cuánticos (QD). Las secciones se montan sobre una rejilla de muestras TEM luego se coloca en un portaobjetos para su observación por microscopía óptica de campo amplio de fluorescencia. Microscopía de luz revela 585 nm etiquetado QD como fluorescencia naranja brillante formando un patrón granular en el citoplasma de células tumorales. A baja a la ampliación de gama media por microscopía de luz del patrón de marcación se puede reconocer fácilmente y el nivel de etiquetado no específica o de fondo evaluó. Esta es una críticapaso para la posterior interpretación del patrón immunolabeling por TEM y la evaluación del contexto morfológico. En la misma sección A continuación, se secó con papel secante y visto por TEM. QD sondas se ven para ser unido a un material amorfo contenido en gránulos de secreción individuales. Las imágenes se adquieren de la misma región de interés (ROI) que se observa al microscopio óptico para el análisis correlativo. Correspondiente imágenes de cada modalidad puede ser entonces mezclado para superponer los datos de fluorescencia en TEM ultraestructura de la región correspondiente.

Introduction

Light- correlativa y microscopía electrónica (CLEM) es un enfoque poderoso para el análisis de eventos dinámicos transitorios ^1, eventos raros ^{2, 3} y complejos sistemas ^4. Hay muchas permutaciones diferentes técnicas disponibles ⁵ dependiendo de la cuestión que se plantea sin embargo un requisito común es que la misma estructura en una sola muestra ⁶ se forma la imagen de múltiples modalidades de microscopía. Nuestro enfoque particular de CLEM fue desarrollado para el estudio de los tejidos patología humana de archivo y el caso utilizado aquí ha sido bien caracterizado y publicado previamente ^7. El obj....

Protocol

1. Tejido disección y fijación

1. disección de tejido
   1. Diseccionar piezas de tejido a partir de una muestra de tejido tumoral o biopsia resecado quirúrgicamente.
      Nota: El tejido utilizado en este estudio se fijó en formalina rutinariamente pero tejido fresco también es adecuado. Se seleccionaron un área confirmado y reportado por un anatomopatólogo para contener tumor somatostatinoma después de la tinción histológica de rutina y la inmunotinción anti-somatostatina (no mostrados).
   2. Utilice piezas de tejido de no más de aproximadamente 1,0 mm ^3.
2. Cacodilato tampón de preparación de

Results

El espécimen de tumor somatostatinoma utilizados para este estudio comprendió las células tumorales forman estructuras ductales mezclados con el tejido del estoma colagenosa. Por microscopía de luz de fluorescencia, las células tumorales individuales que contenían abundantes gránulos de secreción mostraron etiquetado positivo para la hormona somatostatina. Los núcleos apareció agujeros oscuros con el etiquetado no específica mínima detectable (Figura 1). En aumentos bajo.......

Discussion

Este estudio ha demostrado la utilidad potencial de los puntos cuánticos como sondas universales para los estudios de CLEM. Las nanopartículas de 585 nm QD utilizados mostraron fluorescencia brillante y estable cuando se observan con un microscopio óptico de campo amplio y fueron observados fácilmente por TEM. Un estudio previo realizado por uno de los presentes autores han demostrado también los puntos cuánticos para ser adecuado para super-resolución de la microscopía ^de luz ^7. Su fotoestabilidad.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cacodilato de sodio	Proscitech	C0205	Producto químico nocivo
Tetróxido de osmio	Proscitech	C010	Uso exclusivo en campana extractora
Acetato de uranilo	Univar-Ajax	569	Producto químico peligroso
Etanol 100%	Fronine	JJ008
Acetona 100%	Fronine	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
Metaperiodato de sodio	Analar BDH	10259
anticuerpo anti-somatostatina	Dako	A0566
Diluyente de anticuerpos	Dako	S3022
Qdot 585 Conjugado con estreptavidina	Invitrogen	Q10113MP
Biotinilado cabra anti-conejo Anticuerpo IgG	Sigma	B7389-1ML
Glutaraldehído 50%	EMS	16320
Suero normal de cabra	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Oxoid
BSAc (10%)	Aurion	900.022
Parafilm	Pechiney PP	M
Tiras indicadoras de pH (pH 2.0 - 9.0)	Merck	1.09584.0001
Micromoldes	Proscitech	RL063
Cuchillo de diamante	Diatome	Ultra 45
Microscopio electrónico de transmisión	FEI	Morgagni 268D
Microscopio óptico de fluorescencia	Carl Zeiss	Axioscopio A1
Rejillas 300 malla níquel (barra fina)	Agar Scientific	G2740N
Ultramicrótomo	RMC	Powertome
TEM software de control de cámara	Soft Imaging System	AnalySIS	versión 3.0
Software de procesamiento de imágenes	Adobe Systems Photoshop	CS2