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Artículo de método

Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

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DOI:

10.3791/54307

⸱

7 de agosto de 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

En este artículo

Resumen

Se describe un método mediante el cual se pueden utilizar nanopartículas de puntos cuánticos (QD) para estudios inmunocitoquímicos correlativos de tejido de patología humana incrustado en epoxi. Empleamos QDs conjugados con fragmentos de anticuerpos comerciales que se visualizan mediante microscopía de luz de fluorescencia de campo amplio y microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

Se describe un método por el cual las nanopartículas punto cuántico (QD) pueden ser utilizados para estudios de inmuno correlativos de tejido patología humana utilizando fluorescencia de campo amplio microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para demostrar el protocolo hemos immunolabeled secciones ultrafinas epoxi de tumor somatostatinoma humano usando un anticuerpo primario a la somatostatina, seguido de un anticuerpo secundario biotinilado y estreptavidina conjugada con la visualización 585 nm cadmio-selenio (CdSe) puntos cuánticos (QD). Las secciones se montan sobre una rejilla de muestras TEM luego se coloca en un portaobjetos para su observación por microscopía óptica de campo amplio de fluorescencia. Microscopía de luz revela 585 nm etiquetado QD como fluorescencia naranja brillante formando un patrón granular en el citoplasma de células tumorales. A baja a la ampliación de gama media por microscopía de luz del patrón de marcación se puede reconocer fácilmente y el nivel de etiquetado no específica o de fondo evaluó. Esta es una críticapaso para la posterior interpretación del patrón immunolabeling por TEM y la evaluación del contexto morfológico. En la misma sección A continuación, se secó con papel secante y visto por TEM. QD sondas se ven para ser unido a un material amorfo contenido en gránulos de secreción individuales. Las imágenes se adquieren de la misma región de interés (ROI) que se observa al microscopio óptico para el análisis correlativo. Correspondiente imágenes de cada modalidad puede ser entonces mezclado para superponer los datos de fluorescencia en TEM ultraestructura de la región correspondiente.

Introducción

Light- correlativa y microscopía electrónica (CLEM) es un enfoque poderoso para el análisis de eventos dinámicos transitorios 1, eventos raros 2, 3 y complejos sistemas 4. Hay muchas permutaciones diferentes técnicas disponibles 5 dependiendo de la cuestión que se plantea sin embargo un requisito común es que la misma estructura en una sola muestra 6 se forma la imagen de múltiples modalidades de microscopía. Nuestro enfoque particular de CLEM fue desarrollado para el estudio de los tejidos patología humana de archivo y el caso utilizado aquí ha sido bien caracterizado y publicado previamente 7. El objetivo era, en primer lugar, para maximizar los datos analíticos de una sola biopsia o pieza quirúrgica y en segundo lugar, utilizar la microscopía de luz fluorescente para ayudar a aclarar el contexto del patrón de etiquetado inmuno visto a nivel ultraestructural.

nanocristales de puntos cuánticos (QDs) ofrecen el potencial de un marcador universal de ABL del sistemae para ser visto por ambos, el microscopio óptico de fluorescencia y microscopía electrónica de 8, 9, 10. Su estructura núcleo cristalino permite puntos cuánticos de diferentes tamaños para generar una amplia gama de picos de emisión de fluorescencia cuando es excitado por la luz en longitudes de onda lejos de su espectro de emisión 11. Su peso atómico es suficiente para producir la densidad de electrones que es detectable por microscopía electrónica de transmisión, microscopía de barrido electrónico de transmisión (STEM) o microscopía electrónica de barrido de emisión de campo. Ellos son particularmente adecuados para inmuno estudios que se pueden observar incluso puntos cuánticos individuales dando una sensibilidad máxima de una vez al día por cada molécula diana 12. Además, dependiendo de la QD utiliza pueden poseer una firma elemental individuo adecuado para el mapeo.

muestras de patología humanos ofrecen beneficios significativos para la investigación biomédica traslacional. muestras de tejido de biopsia quirúrgica y se someten rutinariamente para los bancos biológicos y con appropética piados espacios libres se puede acceder a los estudios de investigación. Tejido humano no tiene problemas de relevancia o interpretación que pueden producirse en animales o en modelos in vitro de la enfermedad. Sin embargo, la preparación de muestras de las muestras de patología a menudo no es óptima. No puede haber retraso en el tejido que se está colocada en fijador, fijador apropiado utilizar tal como formalina en lugar de glutaraldehido para TEM y muestreo apropiado. métodos CLEM tienen el potencial para optimizar la información de diagnóstico y pronóstico disponible a partir de una sola muestra humana. Sin embargo, algunos enfoques correlativos recientemente desarrollados tales como los que emplean Mini Generador Singlet Oxygen (miniSOG) no están disponibles para uso en la patología debido a la necesidad de la etiqueta a ser codificado genéticamente en la célula de interés 13. Por esta razón hemos explorado la utilidad de etiquetado QD de tejido TEM preparado de forma rutinaria para inmuno estudios correlativos. Aplicada a los puntos cuánticos epoxi grabado al agua fuerte o secciones de resina acrílica de limuestras de biopsias y tejidos ghtly aldehído fijos ofrecen la posibilidad de obtener correlativa microscopía de luz de fluorescencia y datos que el sistema de una sola muestra.

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Protocolo

1. Tejido disección y fijación

  1. disección de tejido
    1. Diseccionar piezas de tejido a partir de una muestra de tejido tumoral o biopsia resecado quirúrgicamente.
      Nota: El tejido utilizado en este estudio se fijó en formalina rutinariamente pero tejido fresco también es adecuado. Se seleccionaron un área confirmado y reportado por un anatomopatólogo para contener tumor somatostatinoma después de la tinción histológica de rutina y la inmunotinción anti-somatostatina (no mostrados).
    2. Utilice piezas de tejido de no más de aproximadamente 1,0 mm 3.
  2. Cacodilato tampón de preparación de
    1. Preparar una solución tampón de stock (1 M) mediante la adición de 21,4 g de cacodilato de sodio (ver Lista de Materiales) y 3,0 ml de 1% de solución de cloruro de calcio a 90 ml de agua destilada y a continuación, el relleno de la solución a un volumen final de 100 ml. Se agita la solución y se deja reposar durante la noche para que el reactivo se disuelve totalmente cristalina.
    2. preparar un tampón de solución de trabajo mediante la adición de 20 ml de solución madre a 170 ml de agua y después de comprobar el pH con tiras indicadoras. Ajustar el pH a 7,4 mediante la adición de 3 - 4 gotas de HCl 3%. Rellenar la solución a un volumen final de 200 ml con molaridad final de 0,1 M.
  3. Fijador Preparación y Uso
    1. Añadir una ampolla de 10 ml de solución de glutaraldehído al 50% a 20 ml de solución de sodio cacodilato de valores (1 M). Rellenar con agua destilada hasta 190 ml. Comprobar el pH y ajustar a 7,4 mediante la adición de 1 - 4 gotas de ácido clorhídrico 3% (HCl) si es necesario.
    2. Rellenar con agua destilada hasta un volumen final de 200 ml.
    3. Sumergir el tejido en fijador que contenía 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M de sodio tampón cacodilato pH 7,4 durante 24 horas a 4 ° C en un tubo de muestra de vidrio. Desechar fijador usar después de 1 semana.

2. Procesamiento e inclusión de tejidos

  1. osmio Tetroxido de tinción
    1. Después de la fijación es completa, sumergir el tejido en tampón de cacodilato de sodio (0,1 M) durante 20 min y luego repetir durante otros 20 min.
    2. Preparar una tetróxido de osmio acuosa al 2% (OsO4) Solución de trabajo mediante la adición de 8,0 ml de una OsO _ solución al 4 de almacén 5% a 2,0 ml de solución tampón de cacodilato de sodio de valores (1 M) y 10,0 ml de agua destilada para obtener un volumen final de 20.0 ml.
    3. Eliminar el tampón y luego sumergir el tejido en 2% OSO 4 a pH 7,4 durante 4 horas a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN Tenga cuidado al preparar decantación y OsO4 soluciones, llevar equipo de protección personal adecuado y el trabajo en una campana de humos en todo momento.
  2. Acetato de uranilo tinción
    1. Después osmication tejido, retire la solución de OsO4 y sumergir el tejido en acetato de sodio al 2% durante 10 min. Quitar acetato de sodio 2%, entonces sumerja en acetato de uranilo al 2% durante 1 hora atemperatura ambiente.
  3. Deshidración
    1. Deshidratar el tejido a través de alcoholes graduados. Utilice% de etanol 50 por 10 minutos, 70% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 min y dos cambios de 100% de etanol durante 20 min cada uno a temperatura ambiente.
    2. Realizar dos cambios de acetona al 100% durante 30 minutos cada uno.
  4. La impregnación de resina y curado
    1. Mezclar la resina epoxi de baja viscosidad en un vaso de polietileno desechable. Añadir 10,0 g de dióxido de vinilciclohexeno (ERL 4221) monómero epoxi, 6 g de diglicidiléter de polipropilenglicol (DER 732) y 26,0 g de anhídrido succínico nonenilo (NSA). Agitar completamente a mano usando palos de madera durante 2 min.
    2. Añadir quince gotas de 2-dimetilaminoetanol acelerador (DMAE) epoxi y agitar de nuevo durante 2 min. Tenga cuidado para mezclar completamente los componentes ERL, DER y la NSA antes de añadir el acelerador DMAE.
    3. Iniciar la impregnación de resina del tejido mediante la sustitución de 100% de acetona con 1: 1 de resina aacetona durante 1 hora, luego vuelva a colocar con 6: 1 de resina de acetona durante 3 horas, y finalmente el 100% de resina durante la noche.
    4. Transferir el tejido en resina fresca en 8 micromoldes mm. Curado a 70 ° C durante la noche. Resina debe ser difícil, pero no frágil después del curado.

3. Ultramicrotomía

  1. Cuchillo, los parámetros de corte y la Sección Espesor
    1. Colocar un cuchillo de diamante cortes semifinos en el ultramicrotomo y cortar secciones de tejido con un espesor de 500 nm.
    2. Flotar secciones sobre el baño de agua detrás del filo de la navaja. Recoger las secciones sobre un portaobjetos de vidrio y secarlos hacia abajo por 10 a 20 segundos con una placa caliente a aproximadamente 110 ° C
    3. Grabar las secciones con solución de etóxido de sodio durante 20 segundos y luego lavar con etanol al 100% después con agua destilada. Mancha con un 2% de azul de metileno en el 1% de bórax durante 20 segundos en la placa caliente, enjuague con agua corriente del grifo durante 5 segundos y seco en la placa caliente durante 5 segundos. Entonces stain con 1,5% fucsina básica en la placa caliente durante 5 s después secar en la placa caliente durante 20 s.
    4. Examinar con el microscopio óptico de campo claro y confirmar que las células tumorales y una región de interés (ROI) están presentes en la sección.
    5. Cambiar la cuchilla de diamante cortes semifinos a una cuchilla de diamante ultra delgado y ajustar el ángulo de cuchillo y la velocidad de corte correcta según lo recomendado por el fabricante de cuchillos.
    6. Cortar secciones ultrafinas a 90 nm de espesor. Observar la coloración de oro de las secciones cuando flotan en el baño de agua.
    7. Estirar y aplanar las secciones agitando vapor de cloroformo de un 1 cm 2 pedazo de papel de filtro dentro de unos pocos milímetros de las secciones. Tenga cuidado de no llevar el papel empapado de cloroformo en contacto con la superficie del agua.
  2. Sección ultrafina Rejilla de montaje
    1. Alza los cortes ultrafinos de la superficie del agua utilizando una barra fina rejilla TEM de níquel de 300 mallas que se ha sumergido en la sección adhesivsolución de e. Localizar las secciones en el lado opaco de la rejilla. Las rejillas tienen una superficie mate o mate en un lado y una superficie pulida o brillante en el otro lado. No se requiere ninguna película de soporte. Nota: Es necesario para manejar estas rejillas con fórceps anti-magnéticas para evitar las redes que se pegan a las pinzas.
    2. Preparar el adhesivo sección mediante la colocación de 20 cm de cinta adhesiva transparente en un vial de 5 ml con 2,0 ml de acetona. Tapar y agitar el frasco, dejar reposar durante 10 minutos y luego retirar la cinta adhesiva dejando la solución.

4. Immunolabeling

  1. El desenmascaramiento de antígeno
    1. Preparar 1 ml de solución de ataque metaperyodato de sodio saturado en agua destilada fresca y usarlo inmediatamente. Coloque las gotas de la solución de decapado sobre una superficie limpia labfilm.
    2. Coloque rejillas completamente secas con secciones abajo en gotitas de la solución metaperyodato de sodio a temperatura ambiente durante 30 min. La transferencia de las rejillas de dro agua destiladaPLET de 60 segundos de lavado.
  2. La incubación del anticuerpo y QD sonda de etiquetado
    1. Llevar a cabo todas las incubaciones y etiquetado en gotas de solución colocados sobre una superficie limpia Parafilm.
    2. Coloque la rejilla en una gota de 0,05 M de glicina en PBS durante 10 min para bloquear aldehído residual en la sección. Retire el bloque de aldehído mediante secado brevemente el borde de la red.
    3. Coloque la rejilla en una gota de 1% de suero normal de cabra (NGS) y 1% BSAC (10%) en PBS durante 10 min. Preparar la solución de bloqueo mediante la adición de 10 l de NGS y 100 l de Bsac a 890 l de PBS para dar un volumen final de 1.000 l.
    4. Acondicionar las secciones mediante la colocación en una gota de diluyente de anticuerpo de 10 min.
    5. Realice la incubación immunolabeling usando el anticuerpo policlonal anti-somatostatina diluido 1:10 con diluyente de anticuerpo dando una concentración de 3,47 g / L. Nota: incubación del anticuerpo se realiza mediante la colocación de rejillas en gotas durante 1 hora a temperat habitaciónure en una cámara húmeda.
    6. Eliminar el reactivo de anticuerpo de la etapa 4.2.5 secando el borde de la red de lavar las secciones en diluyente para 2 x 5 min.
    7. Incubar en anticuerpo secundario (de cabra biotinilado anti-conejo policlonal) diluido 1:10 durante 1 hora a temperatura ambiente. Eliminar la solución de anticuerpo secundario. Lavar en diluyente de 2 x 5 min.
    8. Incubar en puntos cuánticos conjugados de estreptavidina (585 nm) diluido 1:10 durante 1 hora a temperatura ambiente. Cubrir con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz durante la incubación.
    9. Lávese las rejillas en agua destilada fresca durante 2 min. Seque los bordes de la rejilla seco.

5. microscopía de fluorescencia de luz

  1. Fuente de Luz para filtrado y Cubos
    1. Utilice la iluminación de 365 nm de luz LED (diodo emisor) para gran campo de la microscopía de luz fluorescente. Insertar un filtro de cubo con las siguientes características: (Ex G 365 nm, BS FT 395 y EM LP 420 nm).
      Nota: Este filtro de cubo wenfermo permite los espectros de emisión de todos los puntos cuánticos tamaños para ser visualizado de forma simultánea en la misma longitud de onda de excitación.
  2. Visualización de imágenes y Secciones
    1. Coloque la sección de rejilla inmunotinción abajo sobre un portaobjetos de vidrio en una gotita de agua y cubrir con un cubreobjetos de vidrio (número espesor 1,5). Utilizar el microscopio óptico para evaluar el patrón de marcación, el nivel de cualquier marcaje no específico y para establecer que los controles negativos son claros de etiquetado.
    2. Identificar retorno de la inversión en relación con barras de rejilla. Buscador de rejillas pueden ser útiles para establecer las coordenadas de estructuras diana.
    3. Adquirir imágenes de etiquetado positivo en la sección utilizando una cámara digital a todo color con el ajuste de la cámara en "FL automática del color" y "balance de blancos" fijado en 3,200K. Utilice la cámara en el modo "automático de la exposición" con un ajuste "Gamma" entre 0,45 y 1,00 para optimizar la apariencia de las imágenes y "Analog Gain" fijado en 1x.Haga clic en el icono de la cámara en el software de interfaz gráfica de Zen 2 Lite para "vivo", enfocar la imagen a continuación, haga clic en "Snap" para capturar la imagen a la memoria de cuadros.
    4. Guardar imágenes como archivos .tif para evitar la compresión y la pixelación cada vez más evidente.
    5. Preparar una impresión que muestra la posición del retorno de la inversión en relación con las barras de rejilla u otros hitos de tejido importantes. Estas impresiones serán útiles para la posterior navegación de la sección y volver a la búsqueda de regiones de interés por microscopía electrónica de transmisión (TEM).
    6. Retire la rejilla de la diapositiva, lavar con agua destilada y secar suavemente los bordes secos.
      Nota: No utilice excesivamente intensa iluminación para adquirir imágenes de fluorescencia. La fotoestabilidad de los puntos cuánticos permite tiempos de imagen de hasta unos pocos segundos, pero tenga cuidado de no prolongar la exposición como la extinción de la señal QD puede ocurrir después de aproximadamente 1 minuto en agua. fotoestabilidad prolongado o permanente se obtiene solamente cuando QD etiquetado secciones se deshidratan con tolueno y seincrustado bajo cubreobjetos de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Sin embargo, este proceso va a continuación, excluir la posibilidad de un examen correlativa de la misma sección por TEM.

6. Microscopía Electrónica de Transmisión

  1. TEM configurar y Visualización
    1. La transferencia de la cuadrícula en el TEM para el examen usando un voltaje de aceleración de 100 kV. Usar bajo aumento de aproximadamente 1,400X para navegar por la red y encontrar regiones de interés que se correlacionan con los puntos de vista de microscopía de luz. Ver grupos de puntos cuánticos un factor de aumento de todo 50.000X.
    2. Observe los puntos cuánticos individuales con un aumento de 70,000X o por encima. Observe los puntos cuánticos como estructuras cristalinas irregulares con densidad de electrones moderado.
  2. Imaging
    1. Utilizar una cámara digital para obtener imágenes de TEM. Un blanco y negro 1.392 x 1.040 píxeles del sensor es adecuado.
    2. Adquirir imágenes haciendo clic en el icono de "Cámara" en "Sí" en el microscope interfaz gráfica del software de imágenes, a continuación, en "Off" para guardar la imagen en la memoria de cuadros. Nota: estas operaciones serán diferentes dependiendo del sistema de microscopio que se utilice. Utilice la cámara en el modo de exposición automática con un ajuste "Gamma" de 1,00.
    3. Guardar imágenes como archivos .tif.

7. CLEM Imaging

  1. Localización de un retorno de la inversión de fluorescencia por TEM
    1. Utilice una impresión de la imagen de microscopía de luz para localizar correspondientes regiones de interés por TEM. características arquitectónicas de tejidos tales como vasos sanguíneos y estructuras luminales son útiles para la navegación alrededor de la sección mediante TEM.
    2. Capturar una imagen de la ROI correspondiente por TEM.
  2. CLEM superposición de imágenes
    1. Asegúrese de que la imagen TEM se orienta correctamente la imagen de microscopía de luz con y corregir la ampliación de cada uno para que la misma estructura se ve en cada modalidad es del mismo tamaño.
    2. Orientarcomieron la microscopía de luz y las imágenes de TEM y visualizarlas de lado a lado o como superposiciones para poner de relieve las características ultraestructurales de las regiones de interés immunolabeled.
    3. Crear una imagen de superposición usando Photoshop CS2. En primer lugar, ampliar la imagen de fluorescencia a la misma ampliación de una imagen de baja potencia como TEM. Orientar las dos imágenes y luego les pega al lado del otro en un lienzo.
    4. Acoplar la imagen.
    5. Crear la superposición de fluorescencia de esta imagen compuesta. Haga clic en la "herramienta Marco rectangular", seleccione la imagen de fluorescencia y crear una capa duplicada de la misma.
    6. Ajuste el "Estilo de capa / Opciones de fusión" al 30 - 40% de transparencia.
    7. Haga clic en la "Herramienta Mover" y arrastre la capa superpuesta la imagen de fluorescencia correspondiente sobre TEM. Alinear las imágenes.
    8. Después de lograr la alineación, "aplanar" las capas para producir la imagen superpuesta final.
    9. Utilice la opción "herramienta Marco rectangular" para seleccionar la nueva imagen superpuesta unand copiarlo en un nuevo lienzo. Guardar como un archivo .tiff.

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Resultados

El espécimen de tumor somatostatinoma utilizados para este estudio comprendió las células tumorales forman estructuras ductales mezclados con el tejido del estoma colagenosa. Por microscopía de luz de fluorescencia, las células tumorales individuales que contenían abundantes gránulos de secreción mostraron etiquetado positivo para la hormona somatostatina. Los núcleos apareció agujeros oscuros con el etiquetado no específica mínima detectable (Figura 1). En aumentos bajo...

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Discusión

Este estudio ha demostrado la utilidad potencial de los puntos cuánticos como sondas universales para los estudios de CLEM. Las nanopartículas de 585 nm QD utilizados mostraron fluorescencia brillante y estable cuando se observan con un microscopio óptico de campo amplio y fueron observados fácilmente por TEM. Un estudio previo realizado por uno de los presentes autores han demostrado también los puntos cuánticos para ser adecuado para super-resolución de la microscopía de luz 7. Su fotoestabilidad...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo de Xiao Juan Wu (Laboratorio de Inmunohistoquímica) y del Departamento de Anatomía Patológica, Servicio de Patología del Sudoeste de Sydney (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, Nueva Gales del Sur, Australia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cacodilato de sodioProscitechC0205Producto químico nocivo
Tetróxido de osmioProscitechC010Uso exclusivo en campana extractora
Acetato de uraniloUnivar-Ajax569Producto químico peligroso
Etanol 100%FronineJJ008
Acetona 100%FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Metaperiodato de sodioAnalar BDH10259
anticuerpo anti-somatostatinaDakoA0566
Diluyente de anticuerposDakoS3022
Qdot 585 Conjugado con estreptavidina  InvitrogenQ10113MP
Biotinilado cabra anti-conejo Anticuerpo IgGSigmaB7389-1ML
Glutaraldehído 50%EMS16320
Suero normal de cabraInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
Tiras indicadoras de pH (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
MicromoldesProscitechRL063
Cuchillo de diamanteDiatomeUltra 45
Microscopio electrónico de transmisiónFEIMorgagni 268D
Microscopio óptico de fluorescenciaCarl ZeissAxioscopio A1
Rejillas 300 malla níquel (barra fina)Agar ScientificG2740N
UltramicrótomoRMCPowertome
TEM software de control de cámaraSoft Imaging SystemAnalySISversión 3.0
Software de procesamiento de imágenesAdobe Systems PhotoshopCS2
BR0014G incorporado

Referencias

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