El calcio de imágenes en<em&gt; Drosophila</em&gt; En la activación del huevo

Resumen

Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca ²⁺ durante la activación del huevo en Drosophila.

Resumen

La activación del óvulo es un proceso universal que incluye una serie de eventos para permitir que el óvulo fertilizado complete la meiosis e inicie el desarrollo embrionario. Un aspecto de la activación del óvulo, conservado en todos los organismos examinados, es un cambio en la concentración intracelular de calcio (^Ca2+), a menudo denominado "onda de Ca2⁺". Si bien la velocidad y el número de oscilaciones de la onda Ca²⁺ varía entre especies, el cambio en el Ca²⁺ intracelular es clave para provocar eventos esenciales para el desarrollo embrionario. Estos cambios incluyen la reanudación del ciclo celular, la regulación del ARNm, la exocitosis de los gránulos corticales y el reordenamiento del citoesqueleto.

En el huevo maduro de Drosophila, la activación ocurre en el oviducto femenino antes de la fertilización, iniciando una serie de eventos dependientes de Ca²⁺. Aquí presentamos un protocolo para obtener imágenes de la onda Ca²⁺ en Drosophila. Este enfoque proporciona un sistema de modelo manipulable para interrogar el mecanismo de la onda Ca²⁺ y los cambios posteriores asociados con ella.

Introducción

Un cambio en el Ca intracelular ^{2 +} concentración en la activación del huevo (ovocito) es un componente conservado de todos los organismos estudiados ^1,2. Este evento inicia una amplia gama de procesos dependientes de Ca2 ^+, incluyendo la reanudación del ciclo celular y la traducción de mRNAs almacenados. Debido a esta necesidad de Ca2 ^+, la visualización de los cambios transitorios en las concentraciones intracelulares ^{de Ca2 +} ha sido de gran interés.

Históricamente, se seleccionaron los organismos modelo para los estudios sobre la activación del huevo en función del tamaño y la disponibilidad de sus huevos. Diversos enfoques de visualización se han utilizado para seguir y cuantificar los cambios en intracelular ^de Ca ^{2 +} concentraciones en estos sistemas, entre ellos: la aequorina fotoproteína en peces medaka ^3; Ca ²⁺ tintes fluorescentes sensibles como la Fura-2 en el erizo de mar y el hámster ^4,5; y calcio verde-1-dextrano en Xenopus ^6.

La generación y mejora de los indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) ha transformado la capacidad de visualizar Ca ²⁺ dinámica in vivo ^7. Estas construcciones genéticas se expresan en tejidos específicos y limitan la necesidad de preparaciones de tejidos invasivos ^8.

GCaMPs son una proteína fluorescente (GFP) con base en la clase verde de Gecis que han sido muy eficaces debido a su alta afinidad ^de Ca2 ^+, y la capacidad de relación señal-ruido para ser personalizadas ^9-11. En presencia de Ca2 ^+, el complejo GCaMP sufre una serie de cambios de conformación, a partir de la unión de Ca2 ⁺ a la calmodulina, que resulta en un aumento de la intensidad de fluorescencia del componente GFP ^9.

GCaMPs se han utilizado ampliamente en la investigación sobre las neuronas de Drosophila para visualizar cambios en el calcio intracelular ^12. Los últimos applicatien GCaMP de la tecnología para la visualización ^de Ca2 ⁺ en los huevos maduros de Drosophila ha revelado un solo transitoria ²⁺ onda de CA en la activación del huevo ^13,14. La ola ^de Ca2 ⁺ puede ser visualizado a bajo aumento durante la ovulación in vivo ¹³ o con mayor ampliación usando un ensayo de activación ex vivo ^13,14. En el ensayo ex vivo, los oocitos maduros individuales están aisladas de los ovarios y se activan utilizando una solución hipotónica, referidos como tampón de activación, que se ha demostrado para recapitular los acontecimientos de la activación in vivo ^15-17.

Este ensayo ex vivo permite la fácil alta resolución de visualización de la onda ^{2 +} Ca bajo diferentes condiciones experimentales incluyendo la interrupción farmacológica, manipulaciones físicas y mutantes genéticos. Este artículo demuestra la preparación de huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo e ªe microscopía posterior se utiliza para visualizar la onda de Ca ²⁺ usando GCaMP. Este enfoque puede ser utilizado para probar la iniciación y el control de la onda de Ca2 ⁺ y de sondear los resultados de aguas abajo.

Protocolo

Nota: Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación para la disección

Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton y Weil et al. al. ^18. Realice los pasos siguientes dos días antes de la proyección de imagen.

1. Tomar un vial mosca que contiene aproximadamente 10 ml de alimento sólido y añadir una pequeña cantidad de levadura seca a una esquina, a menos de 1 g es suficiente.
   Nota: Para obtener información acerca de los viales de moscas o comida ver 'Mantenimiento de Drosophila' ^19.
2. Añadir 1 - 3 gotas de agua para hidratar la levadura.
3. Dejar reposar el vial en un ángulo de 45 ° y permita 3 - 5 min para que la levadura para tomar el agua.
4. Mientras que la levadura está absorbiendo el agua, seleccionar una botella de moscas que expresan UASt- GCaMP5 myr ²⁰ impulsado por bañera-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que han surgido recientemente (a myristoyRELAClONADAS forma de la GCaMP5 fue elegido para proporcionar una alta relación señal a ruido a través de la inmovilización del GECI a la membrana en el huevo).
5. Anestesiar las moscas en la botella con gas _CO2. Asegúrese de mantener la botella invertida a fin de no perder las moscas en la comida húmeda.
6. Inclinar las moscas anestesiadas sobre un bloque de CO ₂ y tipo 10 - 15 hembras y 5 machos utilizando un pincel con un microscopio de disección. Nota: Es estándar para incluir los machos para proporcionar hembras saludables para la disección.
7. Cuando el vial de la etapa 1.3 está listo, añadir las moscas seleccionados al vial. Tenga cuidado de mantener la horizontal vial hasta que las moscas se vuelven activos.
8. Coloque el vial a 25 ° C durante aproximadamente 36 horas.
9. Devolver los restantes moscas de la plataforma de CO ₂ a la botella o descarte.

2. Disección de Drosophila ovarios

Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con Weil et al. Alabama. 18.

1. Después de 36 horas, anestesiar las moscas del vial yeasted con _CO2.
2. Una vez que las moscas dentro del vial se anestesian propina en la almohadilla de CO ₂ que ser resuelto con un cepillo de pintura con un microscopio de disección.
3. Seleccione una hembra.
4. Aislar los dos ovarios de la hembra. Para el protocolo completo y detallado ver Weil et al. al. ^18. En resumen:
   1. Coloque una pequeña gota de aceite de hidrocarburo halogenado oxigenada (serie 95) en un 1,5 N, 22 x 40 mm cubreobjetos.
   2. Agarrar a la hembra con unas pinzas en la parte anterior del abdomen.
   3. Celebración de las mujeres bajo el microscopio de disección, utilice el segundo conjunto de pinzas para eliminar suavemente la parte posterior de la hembra.
   4. Limpie el tejido posterior de la segunda pinza.
   5. Estrújalo la cavidad abdomen con las segundas pinzas de la anterior a la posterior del abdomen. Los dos ovarios opacos deben atenerse a las pinzas cuando se encuentre fuera de la FEMALe.
   6. Tocar los ovarios en el aceite.
   7. Eliminar cualquier tejido de los fórceps frotando las pinzas.
   8. Repita estos pasos (2.4.1 - 2.4.7) para obtener tres cubreobjetos, cada uno de los ovarios que contienen de una mosca.

3. Aislamiento de óvulos maduros individual

1. Bajo un microscopio de disección estándar con la ampliación fijado a 4X, en el primer cubreobjetos desde el paso 2.4, separar los dos ovarios rasgando el oviducto.
2. Introducir un par de pinzas cerradas en el centro de un solo ovario, teniendo cuidado de no perforar ningún cámaras de huevos.
3. Inserte una sonda de disección estándar en el centro del ovario al lado de las pinzas cerradas.
4. arrastrar suavemente la sonda de disección a través del ovario hacia el polo posterior, donde se encuentran los óvulos maduros (etapa 14 cámaras de huevos).
5. Repetir los pasos 3.1 - 3.4 2-5 veces dependiendo del tamaño del ovario y el número de huevos.
   Nota: La adición de CO ₂ típicamente causa la deposición de un solo huevo que aparecerá más grande con apéndices dorsales planteadas que los huevos depositados previamente. Este huevo debe ser desechada para la imagen, puesto que ya se ha activado dentro de la hembra.
   Nota: los huevos maduros son propensos a separarse fácilmente del tejido conectivo del ovario.
6. Si no hay óvulos maduros son visibles fuera del ovario, continuará burlas con la sonda de disección con suavidad.
7. Una vez que los huevos maduros son visibles en el cubreobjetos fuera del ovario, maniobrar 3-5 en una línea en el centro del cubreobjetos.
   Nota: Para obtener los mejores resultados, ejecute la sonda suavemente a lo largo del lado de los huevos.
   Nota: Evite tirar de los apéndices dorsales ya que esto puede dañar el huevo.
   Nota: Dependiendo de la imagen futura creación, alinear los huevos de aproximadamente 200 micras aparte perpendicular a la cubreobjetos de área máxima de imagen.
8. Una vez alineado, eliminar el resto del tejido ovárico arrastrándolo fuera de los huevos alineados utilizando el forceps.
9. Eliminar el exceso de aceite frotando con la esquina de una toallita médica. Tenga cuidado de no tocar los huevos maduros con el médico toallita huevos maduros que están en contacto se perderán.
10. Dibuje una cruz sobre el cubreobjetos con un marcador para simplificar la localización de la muestra bajo el microscopio.
11. Ajuste el cubreobjetos en un lugar seguro y dejar las cámaras de huevos preparados en el cubreobjetos para descansar durante 5 - 10 minutos a. Esto permite que el huevo se asiente en el aceite. Las muestras se pueden utilizar hasta 1 hora después de la disección.
12. Repetir los pasos 3.1 hasta 3.11 para el resto de los cubreobjetos con ovarios en ellos.

4. Preparación de la Imagen

1. Llevar tampón de activación preparado ¹⁵ a temperatura ambiente.
   Nota: tampón de activación es un tampón hipotónico: 3,3 mM NaH ₂ PO _4, 16.6 mM KH ₂ PO _4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polietilenglicol 8000, 2 mM CaCl _2, se llevó a pH 6,4 con una 1: relación de 5 de NaOH: KOH.Para obtener más información, véase Mahowald de 1983 ^15. Alícuotas de tampón de activación se pueden almacenar a -20 ° C durante meses y a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
2. transportar cuidadosamente preparados, cubreobjetos tampón de activación y pipetas de vidrio para la instalación de imágenes.
   Nota: Un campo amplio, confocal, disco giratorio o un microscopio de lámina de luz se pueden utilizar. Recomendamos el uso de un microscopio invertido. Nuestros resultados representativos se obtuvieron usando un microscopio confocal.
3. Un objetivo adecuado para obtener imágenes de todo el óvulo maduro debe ser elegido (en este caso: 20X 0,7 NA).
4. Montar la primera cubreobjetos preparado a la platina del microscopio. Tenga cuidado de no romper los cubreobjetos en el escenario.
5. Cualitativamente seleccionar un campo de visión con una cámara de huevos maduros para la activación. Imagen No pinchado cámaras de huevos o aquellos con formación de vesículas en la membrana.
   Nota: Para ver los pasos 4.6 - 4.7, los comandos de software variarán dependiendo de microscopio y el fabricante.
6. Conjunto de imágenes párrafometros para la excitación estándar GFP (488 nm) y emisión (500 - 580 nm). También configurar una vista de campo brillante con el fin de visualizar y orientar el óvulo maduro y aceite desplazado.
7. Seleccione el más bajo de Z-plano en el que los óvulos maduros son visibles y establecer un Z-pila completa que se aplicará a 40 micras, con aproximadamente 2 micras por paso. Establecer los parámetros de lo que no hay retraso entre la adquisición de Z-pila. Establecer las series de tiempo para capturar durante aproximadamente 30 min.

La activación ex vivo de imágenes 5. Huevo

1. Iniciar la captura de imágenes.
2. Espere a 1 - 2 completos Z-pilas para ser adquiridos. Esto muestra el óvulo maduro antes de la activación.
3. Retirar aproximadamente 300 l de tampón de activación en una pipeta de vidrio.
4. Colocación de la punta de la pipeta de vidrio que contiene tampón de activación en un ángulo de 45 ° por encima del cubreobjetos, mueva lentamente la pipeta en la trayectoria del haz hasta que está directamente encima del óvulo maduro está formando la imagen. La pipeta de vidrio debeser de 1 - 2 cm por encima del petróleo.
5. Añadir 1 - 2 gotas de tampón de activación en menos de 5 segundos desde la pipeta de vidrio. Esto debería desplazar el aceite. Evitar la adición de exceso de tampón de activación o tocar el huevo con la pipeta de vidrio, ya que puede causar el desplazamiento del óvulo maduro. Tenga cuidado de no tocar el cubreobjetos con la pipeta ya que esto puede causar un cambio en el plano focal o burbujas de aire para formar en el aceite de inmersión entre el objetivo y el cubreobjetos.
6. Mientras que la adición de tampón de activación durante la adquisición de imagen, compruebe el canal de campo brillante para asegurar que el aceite ha sido desplazado por el tampón de activación.
   Nota: Esto primera aparecer como una sombra debido a la pipeta romper la trayectoria del haz, pero también dará lugar a la aparición de pequeñas gotitas de aceite. Algunas gotas de aceite pueden permanecer asociado con el óvulo maduro que afectará a los resultados experimentales y calidad de imagen.
7. Si el aceite no se desplaza de la adición inicial de repetición de tampón de activación pasos 5,4-50.6.
8. Una vez que el aceite se desplaza con éxito, permitirá a las series de tiempo hasta su finalización.
   Nota: Debido a la hinchazón de los ovocitos en la activación, algunas cámaras de huevos se moverán de manera espectacular fuera del plano focal o campo de visión después de la adición de tampón de activación. En esta situación, detener la adquisición y montar la siguiente cubreobjetos.
9. Después de la secuencia de imágenes se ha completado la adquisición, guardar los datos.

6. posteriores a la adquisición de Procesamiento de Imágenes

1. Abra el conjunto de datos utilizando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o el software de procesamiento de imágenes equivalentes, y seleccione los archivos relevantes para el análisis.
2. Para construir una proyección de los datos adquiridos seleccionar: Imagen> Pilas> Z-proyecto.
3. Seleccionar un comienzo Z-rebanada y una parada de Z-rebanada, por lo general toda la sección. Seleccione un tipo de proyección, usualmente la 'Max Intensidad'. Compruebe casilla 'Todo Marcos de tiempo' para aplicar los ajustes seleccionados para toda la serie.
4. Simás de un canal de fluorescencia ha sido fotografiado, utilice la herramienta de canales para permitir el movimiento entre los colores, hacer un compuesto, o hacer que la escala de grises de la imagen. Seleccionar Imagen> Colores> herramienta de Canales.
5. Para ajustar el brillo de la imagen y contraste seleccione Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste.
6. Para exportar una sola imagen, mover cursor escala de tiempo de fotograma correspondiente y seleccione Archivo> Guardar como> JPEG, o cualquier formato preferido.
7. Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar.
   Nota La velocidad de fotogramas del software de imágenes será requerido para dar una indicación de la hora en la imagen.
8. Para exportar la serie de tiempo como una película, seleccione: Archivo> Guardar como> AVI, a continuación, seleccione la velocidad de fotogramas (~ 7 fotogramas por segundo).
9. Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar.
10. Para guardar el archivo en formato ajustado Fiji, seleccione Archivo> Guardar.

Resultados

Aquí hemos demostrado cómo preparar los huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo. Los huevos que expresan un GECI permitir imágenes de Ca ²⁺ en la dinámica de la activación del huevo y el inicio del desarrollo embrionario (Figura 1). Debe tenerse en cuenta que dependiendo de la GCaMP utilizado, específicamente la presencia de un grupo miristoilo, los resultados pueden tener ligeras diferencias cualitativas ^{13 14.} También hemos demostrado un papel para la actina funcional durante la activación del huevo por la adición de un inhibidor de la polimerización de actina, citocalasina D, al tampón de activación (figura 2) ^14.

Un requisito para el citoesqueleto a la activación del huevo se conserva. En C. elegans, después de la fertilización, los componentes del citoesqueleto se reorganiza para preparar el embrión de una célula de la primera división asimétrica ^21,22. En el erizo de mar, la alteración de cytoskeleTal re-organización después de la activación se ha demostrado que afecta el ciclo celular mediante la prevención de la formación del anillo contráctil ^23. El papel de la actina en la mediación de una ola ^de Ca2 ⁺ y su función en la activación del huevo aguas abajo en Drosophila aún no se ha aclarado completamente.

En Drosophila, co-visualización del Ca ²⁺ onda y del citoesqueleto de actina se puede conseguir utilizando este ensayo de activación ex vivo. Series de tiempo de múltiples canales puede ser adquirida y la dinámica del Ca2 ⁺ intracelular se puede emparejar con cambios en la organización de la actina en el ovocito (Figura 3).

Figura 1:. A Single Ca ²⁺ onda en serie Drosophila huevo Tiempo de activación de la ex vivo maduro Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 después de la unaddition de tampón de activación (AH). El aumento de Ca ²⁺ citoplasmático se origina en el polo posterior (B) y se propaga (BF) con una velocidad media de aproximadamente 1,5 micras / seg. Iniciación de la onda se observa típicamente dentro de 3 min de la adición de tampón de activación. Después de la activación, los niveles de calcio intracelulares del óvulo maduro vuelve a los niveles (G, H) de activación pre. Ver película suplementario 1 (tiempo total de 33 min). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La adición de citocalasina D para la activación del búfer perturba Ca²⁺ propagación de las ondas. Series de tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 tras la adición de tampón de activación que contiene 10 mg / ml de citocalasina D concentración final (AH). Mientras que la onda ^de Ca2 ⁺ se inicia en el polo posterior (A), se ve comprometida y no llega a la parte anterior del huevo (F) (puntas de flecha en blanco denotan la parte delantera de la ola). No se observaron más cambios Ca ²⁺ durante 30 min). Ver película suplementario 2 (tiempo total de 30 minutos). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Co-visualización de actina y Ca ²⁺ en ELa activación gg en serie de Drosophila. Tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 (Cian) y UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) tras la adición de tampón de activación (AH). La ²⁺ onda Ca inicia desde el polo posterior y se recupera como en la Figura 1. Actina parece estar cambiando con el tiempo, las puntas de flecha blanca (A vs H). La falta de detección de la señal ^de Ca2 ⁺ en el centro del huevo maduro es debido al movimiento de la muestra durante la captura de imagen. Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El primer paso crítico en este protocolo es aislar los óvulos maduros sin dañarlos. Esto se puede lograr mediante maniobras gentiles de los huevos con la sonda de disección. La práctica permitirá que esta manipulación se ejecute sin dañar los huevos. Un segundo paso crucial es evitar la pérdida de la muestra cuando se aplica tampón de activación al huevo maduro en aceite. La aplicación del tampón de activación debe realizarse lentamente y sin contacto con el cubreobjetos. Este paso puede ser un desafío si la configuración del microscopio no permite un fácil acceso a la muestra. Es aconsejable mover partes axilares del microscopio, como una incubadora de temperatura.

Se pueden realizar modificaciones a este protocolo para visualizar otros factores marcados con fluorescencia, en lugar de Ca²⁺ en la activación del huevo. De manera más general, las diferentes etapas del desarrollo de Drosophila o los resultados de agregar un tampón diferente podrían analizarse utilizando este protocolo.

Es posible que sea necesario solucionar problemas si la configuración del microscopio no es óptima para visualizar la señal de la muestra. Esto se puede lograr aumentando o disminuyendo la potencia del láser, alterando el rango de captura y ajustando los parámetros de la pila Z. Otro problema podría ser que los huevos se muevan constantemente fuera del campo de visión al agregar el búfer de activación. Si esto sucede regularmente, deje que los huevos maduros se asienten en los cubreobjetos durante un período de tiempo más largo, de 15 a 20 minutos. Tenga en cuenta que el uso de un aceite de mayor viscosidad alterará el desplazamiento del aceite por tampón de activación.

Esta técnica presentada aquí está limitada por la distancia de trabajo del objetivo, la deshidratación de los óvulos maduros y la capacidad de diseccionar los óvulos maduros sin dañarlos. Sin embargo, en comparación con los métodos de imagen in vivo en los que el ovocito maduro pasa a través de la hembra adulta y se deposita ¹³, nuestro método permite una mayor resolución espacial, la opción de manipular físicamente el óvulo maduro antes de la activación y la capacidad de probar el papel de la activación del óvulo sin fertilización.

Hay muchas aplicaciones futuras potenciales de esta técnica, incluida la prueba de construcciones reporteras para componentes celulares en la activación del huevo y la visualización de la onda Ca²⁺ en fondos mutantes ^14,24. Junto con herramientas experimentales y genéticas, el ensayo de activación de huevos ex vivo que se presenta aquí permite el estudio de los efectos desencadenantes, de propagación y posteriores de la onda de Ca²⁺ universalmente conservada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Levadura activa seca	Fleischman' s	#2192
Microscopio de disección	Leica	MZ6	Varios funcionarán
Lámpara	Mircotec Fibra óptica	MF0-90	Varios funcionarán
Toallitas médicas	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Rotulador	Stabilo	841/46	OHPen universal, negro - disponible en la mayoría de las papelerías. Anchura superfina 0,4 mm
CO2 almohadilla	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cubreobjetos n.º 1,5, 22 x 50 mm	International- Nº1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Aceite de halocarbono, serie 95	Halocarbon Products Corp.	Distribuidor en Europa:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Se puede utilizar en lugar de aceite de halocarbono, serie 95
Fórceps	Fine Science Tools	11252-00	Si bien estas herramientas deben estar limpias, no es necesario el uso de un autoclave, el etanol sería suficiente.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Pipeta de vidrio	Fisherbrand,FB50251		Pasteur Pipetas, vidrio, desenchufada, 150 mm de longitud
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm