Artículo de método

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

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DOI:

10.3791/54312

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30 de enero de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

En este artículo

Resumen

Se describe un ensayo rápido, a base de molecular Influenza A y B. El ensayo detecta la influenza cada objetivo en los 15 minutos mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. El ensayo de la gripe A y B es fácil de usar y requiere práctica en un mínimo de tiempo para llevar a cabo.

Resumen

La gripe es una enfermedad respiratoria contagiosa causada por el virus de la influenza A y B en los seres humanos y causa una cantidad significativa de la morbilidad y la mortalidad cada año. La influenza A y B del ensayo fue la primera prueba rápida de la gripe molecular CLIA renunciado disponible. La prueba de la gripe A y B funciona mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. Aquí, el rendimiento de la Influenza A y el ensayo B en congelado, archivadas hisopo nasofaríngeo (NPS) muestras almacenadas en medio de transporte viral (VTM) se compararon con un ensayo de panel de respiratoria.

El rendimiento del ensayo A y B de la gripe se evaluó mediante la comparación de los resultados con el método de referencia del panel respiratorio. La sensibilidad para el virus de la gripe A fue total de 67,5% (IC del 95% (IC), 56,6-78,5) y la especificidad fue del 86,9% (IC, 71,0 a 100). Para las pruebas de virus de la gripe B, la sensibilidad y la especificidad fueron del 90,2% (IC, 68,5-100) Y 98,8% (IC, 68,5 a 100), respectivamente.

Este sistema tiene la ventaja de un tiempo de prueba significativamente más corto que cualquier otro ensayo molecular actualmente disponibles y el procedimiento simple, libre de pipeta se ejecuta en un sistema totalmente integrado, cerrado, que ocupa poco espacio. En general, la influenza A y B de ensayo evaluados en este estudio tiene el potencial de servir como una prueba de diagnóstico rápido de la influenza en el punto de atención.

Introducción

Infecciones por virus de la influenza como resultado una cantidad significativa de la morbilidad y la mortalidad cada año 1, 2, 3. La gripe sin complicaciones se caracteriza por síntomas constitucionales y respiratorias, tales como fiebre, mialgia, dolor de cabeza y tos no productiva 4, 5. Las personas mayores, niños pequeños, pacientes inmunocomprometidos y pacientes con comorbilidades subyacentes están en un mayor riesgo de sufrir complicaciones graves como neumonía, miocarditis, enfermedad del sistema nervioso central, o la muerte 6, 7.

Infección de la gripe es único de otros virus respiratorios en ese pronta administración de la terapia antiviral dentro de las 48 h del inicio de los síntomas puede reducir la gravedad de la enfermedad y la longitud 8. La identificación rápida de la gripe también ha sidodemostrado reducir el uso de antibióticos innecesarios 9, 10. Además, los pacientes hospitalizados con infecciones por influenza deben ser colocados en habitaciones aisladas con las precauciones de control de infecciones. Sin embargo, las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe no pueden ser difíciles de distinguir clínicamente de la gripe. Por esta razón, las pruebas de diagnóstico rápido y preciso para la influenza es muy importante para el manejo clínico del paciente.

Varios ensayos están disponibles para la detección e identificación de virus de influenza. Pruebas de detección de antígenos de la gripe rápido (RIDT) son ampliamente utilizados en la práctica clínica como pruebas de punto de atención, ya que son fáciles de usar y proporcionan resultados dentro de 15 a 30 minutos 11, 12; Sin embargo, sus sensibilidades varían ampliamente (10-80%), dependiendo del fabricante y de la población que se está probando, y el tipo influenza y subtyPE 13, 14, 15. Ensayos de fluorescencia directa (DFA) proporcionan sensibilidades superiores sobre RIDTs, pero el tiempo de procesamiento es mayor (~ 3 h) y deben ser completado por técnicos cualificados 16, 17. El cultivo del virus ha sido el estándar de oro para el diagnóstico de la gripe y ha mejorado la sensibilidad sobre ambos RIDTs y DFA 18. Sin embargo, el cultivo del virus de la gripe puede tomar de 2-14 d para completar, lo que disminuye su utilidad en la ayuda a la gestión de pacientes 19. Por último, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) han reemplazado a las técnicas de cultivo como el nuevo estándar de oro en el diagnóstico de la gripe. NAAT se considera que tienen la mayor sensibilidad para la detección de la gripe en un par de horas. Sin embargo, AEAC son los ensayos más caras y requieren equipos especializados y técnicos para llevar a cabo 5 , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

El ensayo de la influenza A y B se describe aquí es la primera prueba rápida de la gripe molecular CLIA renunciado a que está fácilmente disponible. Este ensayo funciona mediante el empleo de una reacción nicking endonucleasa de amplificación (NEAR) que utiliza la amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. Este ensayo se diferencia de la gripe A de B, requiere 2 minutos para configurar y procesar una muestra, y requiere un total de 15 minutos para completar.

A continuación, presentamos el protocolo para el ensayo de influenza A y B. Además, proporcionamos un conjunto de datos de muestra comparando el rendimiento de la influenza A y B en el ensayo de frotis nasofaríngeo archivado (NPS) los especímenes almacenados en un medio de transporte viral (VTM) a otro panel de ensayo de patógenos respiratorios.

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Protocolo

DECLARACIÓN DE ÉTICA: El uso de muestras clínicas está aprobado y sigue las directrices del Centro de Cáncer Junta de Revisión Institucional Kettering Memorial Sloan-por delante del izquierdo.

1. Antes de empezar el ensayo

NOTA: La influenza A y B de ensayo está aprobado para muestras de frotis nasofaríngeos y de frotis nasofaríngeo almacenados en medios de transporte viral. Los hisopos se incluyen en el kit y deben ser utilizados para un rendimiento óptimo. Sin embargo, rayón, espuma, acudieron hisopos o hisopos nasales de poliéster también se pueden utilizar para recoger muestras de hisopos nasales.

  1. Para recoger una muestra de exudado nasal, inserte el hisopo en la fosa nasal que tiene el drenaje más visible, o que es más congestionada. Con una rotación suave, empuje el hisopo en la fosa nasal hasta que encuentre resistencia y girar varias veces contra la pared nasal antes de retirar lentamente de la fosa nasal. Almacenar los hisopos y transportarlos en viales que contienen 3 ml de medio de transporte viral (VTM).
    NOTA: La atención cuidadosa a correspondIATE recogida de muestras debe ser tomado como la recogida de muestras inadecuada puede producir resultados erróneos.
    NOTA: Las muestras de torunda deben analizarse lo antes posible después de la recogida. Sin embargo, pueden ser almacenados a temperatura ambiente durante un máximo de 2 horas o refrigeradas a 2-8 ° C durante un máximo de 24 horas si la prueba no está disponible inmediatamente. muestras recién recogidas son ideales para un rendimiento óptimo del análisis. La manipulación inadecuada de la muestra, almacenamiento y / o transporte pueden dar resultados erróneos.
    NOTA: Como medida de precaución, las personas que realizan esta prueba deben tratar todas las muestras como potencialmente infecciosas siguiendo las precauciones universales al manipular las muestras.
  2. Trae todas las muestras a temperatura ambiente antes de la prueba.
    NOTA: Todos los componentes de la prueba son para un solo uso y no se deben utilizar para llevar a cabo múltiples pruebas. No mezclar los componentes del kit de distintos lotes. No utilice los reactivos del kit después de la fecha de caducidad.
  3. Llevar el receptor de la muestra azul para ROOla temperatura m antes de la prueba. La base de la prueba de naranja puede ser probado sin la necesidad de calentar a temperatura ambiente.
  4. Deje todas las piezas de ensayo en el envoltorio de aluminio hasta inmediatamente antes de su uso. Encienda el instrumento presionando el botón de encendido en el lateral del instrumento. Introduzca el identificador de usuario y pulse 'Aceptar'.

2. Ejecución de la prueba

  1. Para comenzar el proceso de prueba, toque 'Test Run' en la pantalla del instrumento. Introduzca la identificación del paciente mediante el uso de un teclado en pantalla o un escáner de código de barras y pulse 'Aceptar'. Abra la tapa e inserte la base de pruebas de Orange en el soporte de base de prueba de Orange.
  2. Confirmar que la prueba correcto se muestra en la pantalla y pulse 'Aceptar'. Inserte el receptor muestra azul en el soporte receptor de la muestra azul.
    NOTA: No abra el receptor de la muestra antes de colocar en el instrumento ya que esto evitará que el tampón de elución de alcanzar la temperatura de funcionamiento correcto y puede afectar al rendimiento de la prueba.
  3. Espere a que el receptor de la muestra se caliente. Cuando se lo indique el instrumento, retire el sello de papel de aluminio y colocar el hisopo del paciente para ser probado en el receptor de la muestra.
    NOTA: Al retirar el papel de aluminio, colocar dos dedos en el borde del receptor de ejemplo para asegurar que se mantenga en su lugar.
  4. Mezclar vigorosamente el hisopo en el líquido durante 10 segundos, presionando la torunda contra el lado del receptor muestra, tal como lo mezclas para ayudar a desalojar la muestra de la torunda. Pulse 'OK' para proceder. Si hisopos de pruebas almacenados en medio de transporte viral, vórtice del VTM durante 10 segundos a continuación, añadir 200 l para el receptor de la muestra.
  5. Presione el cartucho de transferencia blanca en el receptor de la muestra azul. Continúe presionando en el receptor de la muestra hasta que el indicador naranja se eleva.
  6. Levantar y luego conectar el cartucho traslado a la zona de pruebas. Observe el indicador naranja descender una vez que la transferencia de cartucho está instalado correctamente. Cierre la tapa y no abra hasta que la "Prueba completa"Aparece un mensaje en la pantalla.

3. Control de Calidad

  1. Toque 'análisis cc Run' en la pantalla principal. Seleccione la prueba de control de calidad para ser ejecutado. Para confirmar el tipo de prueba para que coincida con la muestra de control de calidad destinada al ensayo tocando 'OK' y siguiendo las instrucciones en pantalla para completar la prueba.

Interpretación 4. Resultado

  1. Después de la realización de la prueba se ha completado, observar los resultados de la prueba se muestra en la pantalla con las interpretaciones de la presencia de la influenza A, B, subtipos desconocidos. Para obtener resultados válidos repita la prueba.

5. Mantenimiento y limpieza

  1. Limpiar el equipo, la zona de banquillo que rodea todos los días con un 70% de etanol o solución de lejía al 10%. Pulverizar la solución de limpieza en un paño sin pelusa humedecido para limpiar. No vierta las soluciones directamente en el instrumento.

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Resultados

En este estudio, las muestras de NPS archivados se obtuvieron de pacientes que se presentan con síntomas similares a la gripe en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) durante un brote de influenza entre el 15 de diciembre de 2012 y el 1 de marzo de 2013. Las muestras de NPS se presentaron en 3 ml de VTM y probado como parte de la práctica clínica habitual con un ensayo molecular que detecta un panel de virus respiratorios (RP), incluyendo la gripe a, a-1, a-3, a y B. Durante ...

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Discusión

Los virus de influenza son importantes causas mundiales de morbilidad y mortalidad. El diagnóstico rápido y preciso de la gripe es una de las principales claves para manejar los brotes de gripe durante la temporada respiratoria. Otras pruebas basados ​​en antígenos son rápidos y fáciles de realizar; sin embargo, tienen bajas sensibilidades 13. Por otra parte, las pruebas moleculares tradicionales han mejorado la sensibilidad, pero requieren técnicos de laboratorio más experimentados de realizar y...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al personal del Servicio de Microbiología Clínica del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center por su ayuda en la recolección de muestras clínicas. Este estudio fue apoyado en parte por un acuerdo de investigación entre MSKCC y Alere Scarborough (SK2013-0262).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Kit de pruebaAlere425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Escáner de código de barrasAlereEQ001001
Alere Impresora universalAlere55115 (Global), alereiprinter ( EE.UU.)
200 y micro; l pipeta
200 y micro; l puntas
Medio de transporte viralRemelM4-RT
de precisiónde pipeta desechables

Referencias

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