Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias

Summary

Este protocolo describe el uso de una estrategia de intercambio de tampón a base de microfluídica inercial para purificar células de ingeniería micro / nanopartículas con el agotamiento eficiente de partículas no unidos.

Abstract

células de ingeniería con cargadas con sustancias activas, micro / nanopartículas (NP) se está convirtiendo en un método cada vez más popular para mejorar las propiedades terapéuticas nativas, permitirá bio imágenes y controlar el fenotipo celular. Una cuestión fundamental todavía insuficientemente reconocidos es el importante número de partículas que permanecen sin unir después del marcaje de células que no se pueden eliminar fácilmente mediante centrifugación convencional. Esto conduce a un aumento en el ruido de fondo de imagen bio y puede impartir efectos transformadores en las células no objetivo vecinos. En este protocolo, se presenta una estrategia basada en la microfluídica inercial tampón de intercambio denominado como Decano de flujo de fraccionamiento (DFF) para separar eficientemente las células marcadas de PN libres en una forma de alto rendimiento. El microdispositivo espiral desarrollado facilita la recogida continua (> recuperación de células 90%) de células purificadas (THP-1 y MSC) en suspensión en una nueva solución tampón, mientras que el logro% agotamiento de colorante fluorescente no unido o NPs de tinte cargado (sil> 95ica o PLGA). Esto solo paso, la estrategia de purificación de células basadas en el tamaño hace posible un rendimiento de procesamiento de alta celular (10 ⁶ células / min) y es muy útil para la purificación de células a gran volumen de células micro / nanopartículas de ingeniería para lograr la aplicación clínica libre de interferencias.

Introduction

La ingeniería de células por micro / nanopartículas cargadas con agente (NPS) es un método de integración libre, versátil y sencilla, genómica para mejorar la capacidad de bioimagen y aumentar / suplementar sus propiedades terapéuticas nativos en la medicina regenerativa. ^1-3 modificaciones celulares se consiguen mediante el etiquetado de la membrana plasmática o el citoplasma con un exceso de concentración de agente PN-cargado para saturar los sitios de unión. Sin embargo, un inconveniente principal de este método es las cantidades significativas de partículas no unidas que permanece en solución después de los procesos de etiquetado de células, lo que pot....

Protocol

1. Las nanopartículas (NP) Etiquetado de las células madre mesenquimales y monocitos

1. células madre Cultura mesenquimales (MSC) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos para ≥80% de confluencia antes de etiquetado. Del mismo modo, la cultura células THP-1 (ATCC) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS a una densidad de ~ 10 ⁶ células / ml.
2. PN carga de sílice (~ 500 micras) con una solución de colorante calceína (200 M) con agitación durante la noche. Fabrique PLGA-calceína AM (CAM) utilizando un protocolo descrito previamente. ^22....

Results

Después de marcar las células con bio de imagen NPs agente cargado durante la noche, se cosechan las células marcadas (que contiene partículas libres) y se purificaron por microdispositivo espiral DFF para eliminar NPs libres en un solo proceso la etapa (Figura 1A). El 2-entrada, microcanal espiral de 2 salidas está diseñado por el software de ingeniería y microfabricado utilizando SU-8 fotoprotector. La oblea de silicio modelada se utiliza entonces como plantilla para e.......

Discussion

La tecnología de purificación de células DFF descrito en este documento permite la separación rápida y continua de células marcadas en una forma de alto rendimiento. Este enfoque de separación es ideal para gran volumen de muestra o el procesamiento de muestras de alta concentración de células, y es mejor que la filtración a base de membrana convencional que es propenso a la obstrucción después de un uso prolongado. Del mismo modo, la separación magnética basada en la afinidad requiere pasos adicionales de etiquetado de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Líneas celulares & Células
	Lonza	PT-2501
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)	Lonza	12-614F
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	10270-106
Células monocíticas THP-1 (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medios	Lonza	12-702F
Reactivos & Materiales
0.01% poli-L-lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Jeringa	BD	302113	3 ml Luer-Lock
60 ml Jeringa	BD	309653	60 ml Luer-Lock
Albúmina sérica bovina (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calceína, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calceína	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grado 2.5 L
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Portaobjetos de microscopio simple	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Cinta adhesiva	3M	21200702044	18 mm x 25 m
NPs de sílice (∼ 200 μ m)	Sigma-Aldrich	748161	Tamaño de poro 4 nm
Punta de jeringa	JEC Technology		7018302 23 G 0,013 x 0,25
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0,02 x 0,06" 100
Poly (D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Punzón de biopsia	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Desecator Scienceware		111/4 IN OD
Cámara de alta velocidad	Phantom	V9.1
Microscopio de contraste de fase invertida	Nikon	Eclipse Ti
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-002
Bomba de jeringa	Chemyx	CX Fusion 200