Un cultivo primario de células endoteliales corneales bovinas se utilizó para investigar el mecanismo de la transición endotelial-mesenquimal corneal. Además, se utilizó un modelo de endotelio corneal criolesión rata para demostrar transición endotelial-mesenquimal corneal in vivo.
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Artículo de método
En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células endoteliales de la córnea (CECs) desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la claridad corneal a través del bombeo activo. Un recuento reducido de CEC puede provocar edema corneal y disminución de la agudeza visual. Sin embargo, los CECs humanos son propensos a comprometer su potencial proliferativo. Además, la estimulación del crecimiento celular a menudo se complica por la transición gradual endotelio-mesenquimal (EnMT). Por lo tanto, es necesario comprender el mecanismo de la EnMT para facilitar la regeneración de las CEC con una función competente. En este estudio, preparamos un cultivo primario de CECs bovinas pelando las CECs con la membrana de Descemet del botón corneal y demostramos que las CECs bovinas exhibieron el proceso EnMT, incluyendo cambio fenotípico, translocación nuclear de β-catenina y reguladores de EMT caracol y, en el cultivo in vitro. Además, utilizamos un modelo de criolesión del endotelio corneal de rata para demostrar el proceso de EnMT in vivo. En conjunto, el cultivo primario in vitro de CECs bovinas y los modelos de criolesión del endotelio corneal de rata in vivo ofrecen plataformas útiles para investigar el mecanismo de la EnMT.
Introducción
Las células endoteliales corneales (CECs) desempeñan un papel vital en el mantenimiento de la claridad corneal y, por lo tanto, de la agudeza visual al regular el estado de hidratación del estroma corneal a través de un bombeo activo1. Debido al limitado potencial proliferativo de las CEC humanas, el número de células disminuye con la edad, y la reparación de las heridas endoteliales corneales después de una lesión generalmente se logra a través del agrandamiento y la migración celular, en lugar de la mitosis celular2. Cuando el recuento de CIC disminuye por debajo de un umbral de aproximadamente 500 células/mm2, el estado de deshidrat....
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Protocolo
Todos los procedimientos seguidos en este estudio estaba de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán.
1. Aislamiento, cultivo primario de preparación, y la inmunotinción de bovino CEC
- Adquirir nuevos ojos bovinos de un matadero local.
- Desinfectar los ojos en una solución de povidona yodada al 10% w / v durante 3 min. Lavarlas con la solución salina (PBS) tamponada con fosfato.
- Se recoge el botón corneal con un esca....
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Resultados
Después del aislamiento de CECs de la especie bovina, las células se cultivaron in vitro. La Figura 1 presenta las imágenes de contraste de fase de los países de Europa central de la especie bovina. La forma hexagonal de las células en confluencia indica que las células no estaban contaminadas por los fibroblastos del estroma corneal durante el aislamiento celular. Figura 2 representa la inmunotinción que se realizó utilizando anticuerpos contra.......
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Discusión
CECs son conocidos por su propensión a sufrir EnMT durante la proliferación celular. Para desarrollar estrategias para suprimir el proceso EnMT con fines terapéuticos, es necesario un conocimiento profundo del mecanismo EnMT. Describimos 2 modelos para investigar EnMT, a saber, la CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro y la rata modelo de lesión criogénica endotelio corneal. Nuestros resultados demuestran el proceso EnMT en ambos modelos. Además, el efecto de supresión de EnMT de marimast.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos al personal del Segundo Laboratorio Central, Departamento de Investigación Médica, Hospital Universitario Nacional de Taiwán por su apoyo técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tripsina | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco' s medio Eagle modificado y medio F12 de | Ham ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| suero fetal bovino | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimetilsulfóxido | Sigma | D2650 | |
| factor de crecimiento epidérmico humano | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulina, transferrina, selenio | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| toxina del cólera | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicina | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| anfotericina B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehído | Microscopía electrónica Ciencias 111219 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| albúmina sérica bovina | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anticuerpo anti-catenina antiactivo | Millpore | 05-665 | |
| anti-caracol | Santa cruz | sc28199 | |
| anti- | santa cruz | sc15391 | |
| anti-ratón IgG (H+L) secundaria anticuerpo | ThermoFisher Scientific | A-11001 | para la tinción del ABC de las CEC bovinas |
| anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón | ThermoFisher Scientific | A-11003 | para la tinción del ABC del endotelio corneal de rata |
| anti-conejo anti-conejo anticuerpo secundario | ThermoFisher Scientific | A-11008 | para la tinción de caracoles y de CECs bovinos |
| diluyente de anticuerpos | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| medio de montaje | Vector Laboratories | H-1000 | |
| microscopio confocal de barrido láser | ZEISS | LSM510 | |
| xilacina | Bayer | N/A | |
| tiletamina más zolazepam | Virbac | N/A medicamento | veterinario |
| clorhidrato de proparacaína solución oftálmica | Alcon | N/A | medicamento veterinario |
| 0.1% atropina | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | medicamento clínico |
| 0,3% gentamicina sulfato | Sinphar Group | N/A | fármaco clínico |
| factor de crecimiento básico de fibroblastos | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | fármaco clínico |
Referencias
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
- Morishige, N., Sonoda, K. H.
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Reimpresiones y permisos
