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Artículo de método

En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

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DOI:

10.3791/54329

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20 de agosto de 2016

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

En este artículo

Resumen

Un cultivo primario de células endoteliales corneales bovinas se utilizó para investigar el mecanismo de la transición endotelial-mesenquimal corneal. Además, se utilizó un modelo de endotelio corneal criolesión rata para demostrar transición endotelial-mesenquimal corneal in vivo.

Resumen

Las células endoteliales de la córnea (CECs) desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la claridad corneal a través del bombeo activo. Un recuento reducido de CEC puede provocar edema corneal y disminución de la agudeza visual. Sin embargo, los CECs humanos son propensos a comprometer su potencial proliferativo. Además, la estimulación del crecimiento celular a menudo se complica por la transición gradual endotelio-mesenquimal (EnMT). Por lo tanto, es necesario comprender el mecanismo de la EnMT para facilitar la regeneración de las CEC con una función competente. En este estudio, preparamos un cultivo primario de CECs bovinas pelando las CECs con la membrana de Descemet del botón corneal y demostramos que las CECs bovinas exhibieron el proceso EnMT, incluyendo cambio fenotípico, translocación nuclear de β-catenina y reguladores de EMT caracol y, en el cultivo in vitro. Además, utilizamos un modelo de criolesión del endotelio corneal de rata para demostrar el proceso de EnMT in vivo. En conjunto, el cultivo primario in vitro de CECs bovinas y los modelos de criolesión del endotelio corneal de rata in vivo ofrecen plataformas útiles para investigar el mecanismo de la EnMT.

Introducción

Las células endoteliales corneales (CECs) desempeñan un papel vital en el mantenimiento de la claridad corneal y, por lo tanto, de la agudeza visual al regular el estado de hidratación del estroma corneal a través de un bombeo activo1. Debido al limitado potencial proliferativo de las CEC humanas, el número de células disminuye con la edad, y la reparación de las heridas endoteliales corneales después de una lesión generalmente se logra a través del agrandamiento y la migración celular, en lugar de la mitosis celular2. Cuando el recuento de CIC disminuye por debajo de un umbral de aproximadamente 500 células/mm2, el estado de deshidratación del estroma corneal no puede mantenerse, lo que conduce a queratopatía ampollosa y deterioro de la visión3,4.

El limitado potencial proliferativo de las CECs humanas se ha atribuido a varios factores, incluyendo la reducción de la expresión del factor de crecimiento epidérmico y su receptor en las células envejecidas5, el TGFβ2 antiproliferativo en el humor acuoso6 y la inhibición de contacto2,7. Aunque algunos factores de crecimiento, como el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), pueden aumentar la proliferación en un endotelio corneal humano cultivado, la eficiencia del cultivo sigue siendo limitada8,9. Además, las CECs pueden sufrir un cambio fenotípico durante la expansión ex vivo, parecido a la transición epitelio-mesenquimal (EMT)10-13. La transición endotelio-mesenquimal (EnMT) se caracteriza por desestabilización de la unión celular, pérdida de polaridad apical-basal, reordenamiento del citoesqueleto, expresión de actina del músculo liso alfa y secreción de colágeno tipo I14. Todas estas características pueden anular la función normal de las CECs, dificultando el uso de CECs cultivadas ex vivo en la ingeniería de tejidos. Además, la EnMT se ha asociado con la patogénesis de varias enfermedades endoteliales corneales, incluyendo la distrofia corneal endotelial de Fuchs y la formación de membrana retrocorneal15,16. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de EnMT puede ayudar a manipular el proceso de EnMT y facilitar la regeneración de las CEC para permitir una función competente.

En este estudio, describimos un método para aislar las CEC bovinas del botón corneal. En el cultivo primario in vitro, se observó el proceso de EnMT, incluyendo un cambio fenotípico, la translocación nuclear de β-catenina y los reguladores de EMT caracol y. Además, describimos un método para demostrar EnMT in vivo mediante el uso de un modelo de criolesión del endotelio corneal de rata. Usando estos 2 modelos, demostramos que marimastat, un inhibidor de la metaloproteinasa de matriz (MMP) de amplio espectro, puede suprimir el proceso de EnMT. Los protocolos descritos facilitan el análisis detallado del mecanismo de EnMT y el desarrollo de estrategias para manipular el proceso de EnMT para su posterior aplicación clínica.

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Protocolo

Todos los procedimientos seguidos en este estudio estaba de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán.

1. Aislamiento, cultivo primario de preparación, y la inmunotinción de bovino CEC

  1. Adquirir nuevos ojos bovinos de un matadero local.
  2. Desinfectar los ojos en una solución de povidona yodada al 10% w / v durante 3 min. Lavarlas con la solución salina (PBS) tamponada con fosfato.
  3. Se recoge el botón corneal con un escalpelo y tijeras en condiciones estériles. membrana de la cáscara de la de Descemet con pinzas bajo un microscopio de disección (tenga en cuenta que en este estudio, los ojos bovinos fueron enucleados por un matadero local, por lo tanto, el primer procedimiento del estudio fue la desinfección de los ojos preenucleated en el laboratorio).
  4. Incubar la membrana de Descemet en 1 ml de trypsin a 37 ° C durante 30 min. Recoge los países de Europa central bovina por centrifugación a 112 xg durante 5 min. Resuspender las células en 1 ml de medio suplementado epitelial hormonal (SHEM) que contiene volúmenes iguales de HEPES-tamponada medio de Dulbecco modificado de Eagle y medio F12 de Ham, suplementado con suero bovino fetal al 5%, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de la epidermis humana factor de crecimiento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenio, 1 nmol / l de la toxina del cólera, 50 mg / ml de gentamicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B.
  5. Sembrar las células (aproximadamente 1 x 10 5 células por ojo) en una placa de 6 cm. Cultura en el Shem. Incubar la placa a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO2 en aire. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días.
  6. Cuando las células alcanzan la confluencia, lavarlos con PBS y se incuban en 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recójalas por centrifugación a 112 xg durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de la SHEM.
    1. Contar las células en un hemocitómetro. Sembrar las células en los portaobjetos de cubierta en una densidad de 1 x 10 4 por pocillo en una placa de 24 pocillos, y cultivar las células en la SHEM. Para investigar el efecto de supresión de EnMT marimastat, se incuban las células en SHEM con 10 M de marimastat añadieron al medio de cultivo, y cambiar el medio de cultivo cada 3 días.
  7. Fijar las células en un punto de tiempo indicado con 250 l de paraformaldehído al 4%, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar con 250 l de 0,5% de Triton X-100 para 5 min. Bloque con 10% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
  8. Se incuban las células con anticuerpos primarios contra activa beta-catenina (ABC), caracoles, babosas y una noche a 4 ° C. La dilución de los anticuerpos primarios utilizados es 1: 200. Los anticuerpos se diluyeron en diluyente de anticuerpo compuesto por PBS 10 mM, 1% w / v albúmina de suero bovino, y 0,09% w / v de azida de sodio.
  9. Lavar las células dos veces con PBS durante 15 min, y se incuba lam con el anticuerpo conjugado con Alexa Fluor-secundario (1: 100 en diluyente de anticuerpo) a temperatura ambiente durante 1 hr.
  10. Contratinción el núcleo de la célula, cubriendo las células con 2 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, se lavan las células dos veces con PBS durante 15 min, y montarlos con solución de montaje anti-decoloración.
  11. Obtener imágenes de inmunofluorescencia en las longitudes de onda de excitación de 405 y 488 nm mediante el uso de un microscopio confocal de barrido láser con 20X aumento del objetivo.

2. Modelo de rata de la córnea del endotelio lesión criogénica y intracameral Inyección

  1. Anestesie 12 semanas de edad ratas Sprague-Dawley macho con inyecciones intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) y tiletamina más zolazepam (18 mg / kg). pellizcar suavemente la piel de los animales para confirmar la anestesia adecuada en ausencia de contracciones de la piel.
  2. Inculcar una gota de clorhidrato de proparacaína 0,5% en el ojo derecho de cada rata para minimizar el dolor ojo y el reflejo de parpadeo. Instilartetraciclina pomada para el ojo izquierdo para evitar la sequedad de la córnea.
  3. Se enfría una sonda de acero inoxidable (diámetro = 3 mm) en nitrógeno líquido. Aplicar la sonda de acero inoxidable a la córnea central del ojo derecho durante 30 segundos. inculcar frecuentes PBS para el ojo derecho durante el procedimiento para evitar la sequedad de la córnea.
  4. Inculcar 0,1% atropina y 0,3% de sulfato de gentamicina inmediatamente después de criolesión y una vez al día para aliviar el dolor ocular resultante de espasmo ciliar y para prevenir la infección.
    1. Después del procedimiento, mantienen las ratas caliente usando una lámpara de calor, y observar su recuperación cada 15 minutos después de la anestesia hasta recuperar el control del motor. Además, aplique una pomada de tetraciclina en el ojo derecho para evitar la sequedad de la córnea durante el período de recuperación.
  5. Repetir la lesión criogénica de la córnea durante 3 días consecutivos.
  6. Para la entrega de marimastat o bFGF en la cámara anterior de los ojos de rata, anestesiar las ratas como se describió anteriormente. Inculcar una gotade clorhidrato de proparacaına 0,5% en el ojo derecho para minimizar el dolor de los ojos y el reflejo de parpadeo.
  7. El riego de la superficie ocular con PBS estéril. Realizar paracentesis de la cámara anterior con un microscopio de operación mediante la inserción de una aguja 30 G unida a una jeringa de 1 ml en la córnea clara paralimbales en un plano por encima y paralelo al iris.
  8. Girar la aguja de bisel hacia arriba y presione ligeramente la herida corneal para drenar un poco de humor acuoso y reducir la presión intraocular. Inyectar 0,02 ml de la droga intracameral. comprimir suavemente el trayecto de la aguja con una punta de algodón durante la retirada de la aguja.
  9. Fotografiar la parte externa del ojo en un punto de tiempo indicado bajo el microscopio quirúrgico.

3. Explotación del Rat botón corneal y Inmunoticción

  1. Para practicar la eutanasia a las ratas, los coloca en una cámara de la eutanasia y de infundir 100% de CO 2 a una velocidad de llenado del 10-30% del volumen de la cámara por minuto. Mantener CO 2 de infusión para unaminuto adicional después de falta de respiración y color de los ojos se desvaneció.
  2. Penetrar en el ojo de la rata en el limbo con una cuchilla afilada. Cortar las córneas con tijeras corneales a lo largo del limbo. Aplanar las córneas en una diapositiva. Hacer incisiones radiales adicionales si las córneas se encogen.
  3. Fijar las córneas con 250 l de paraformaldehído al 4%, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar con 250 l de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, y se bloquea con 10% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
  4. Incubar las córneas con anticuerpos primarios contra ABC durante la noche a 4 ° C con una dilución de 1: 200 en diluyente de anticuerpo. Lavar las córneas dos veces con PBS durante 15 min, y se incuba con el anticuerpo secundario (1: 100 en diluyente de anticuerpo) a temperatura ambiente durante 1 hr. Contratinción el núcleo de la célula, cubriendo las células con 2 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, y lavar las células dos veces con PBS durante 15 min.
  5. Montar las córneas en la solución de montaje protectora de la fluorescencia. Transmisión exteriorner las imágenes de inmunofluorescencia en longitudes de onda de excitación de 405 nm y 561 con un microscopio confocal de barrido láser de 20 aumentos objetivo.

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Resultados

Después del aislamiento de CECs de la especie bovina, las células se cultivaron in vitro. La Figura 1 presenta las imágenes de contraste de fase de los países de Europa central de la especie bovina. La forma hexagonal de las células en confluencia indica que las células no estaban contaminadas por los fibroblastos del estroma corneal durante el aislamiento celular. Figura 2 representa la inmunotinción que se realizó utilizando anticuerpos contra...

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Discusión

CECs son conocidos por su propensión a sufrir EnMT durante la proliferación celular. Para desarrollar estrategias para suprimir el proceso EnMT con fines terapéuticos, es necesario un conocimiento profundo del mecanismo EnMT. Describimos 2 modelos para investigar EnMT, a saber, la CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro y la rata modelo de lesión criogénica endotelio corneal. Nuestros resultados demuestran el proceso EnMT en ambos modelos. Además, el efecto de supresión de EnMT de marimast...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos al personal del Segundo Laboratorio Central, Departamento de Investigación Médica, Hospital Universitario Nacional de Taiwán por su apoyo técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
tripsinaThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s medio Eagle modificado y medio F12 deHam ThermoFisher Scientific11330
suero fetal bovinoThermoFisher Scientific26140-079
dimetilsulfóxidoSigmaD2650
factor de crecimiento epidérmico humanoThermoFisher ScientificPHG0311
insulina, transferrina, selenio ThermoFisher Scientific41400-045
toxina del cóleraSigmaC8052-1MG
gentamicinaThermoFisher Scientific15750-060
anfotericina BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldehídoMicroscopía electrónica Ciencias 111219
Triton X-100SigmaT8787 
albúmina sérica bovinaSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
anticuerpo anti-catenina antiactivoMillpore05-665
anti-caracolSanta cruzsc28199
anti-santa cruzsc15391
anti-ratón IgG (H+L) secundaria anticuerpoThermoFisher ScientificA-11001para la tinción del ABC de las CEC bovinas
anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratónThermoFisher ScientificA-11003para la tinción del ABC del endotelio corneal de rata
anti-conejo anti-conejo anticuerpo secundarioThermoFisher ScientificA-11008para la tinción de caracoles y de CECs bovinos
diluyente de anticuerposGenemed Biotechnologies10-0001
4',6-diamidino-2-fenilindolThermoFisher ScientificD1306
medio de montajeVector LaboratoriesH-1000
microscopio confocal de barrido láserZEISSLSM510
xilacina BayerN/A
tiletamina más zolazepamVirbacN/A medicamentoveterinario
clorhidrato de proparacaína solución oftálmicaAlconN/Amedicamento veterinario
0.1% atropinaWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Amedicamento clínico 
0,3% gentamicina sulfatoSinphar GroupN/Afármaco clínico 
factor de crecimiento básico de fibroblastosThermoFisher ScientificPHG0024fármaco clínico 
cabra

Referencias

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