Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la fabricación de una plataforma de cultivo de hepatocitos tridimensional emergente, el andamio de cristal coloidal invertido, y las técnicas concomitantes para evaluar el comportamiento de los hepatocitos. Los poros de tamaño controlable, la interconectividad y la capacidad de conjugar proteínas de la matriz extracelular con el andamio de poli(etilenglicol) (PEG) mejoran el rendimiento de las células Huh-7.5.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado
En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad para mantener la función de los hepatocitos in vitro, para el propósito de probar la citotoxicidad xenobióticos ', el estudio de la infección por virus y el desarrollo de fármacos dirigidos en el hígado, requiere una plataforma en la que las células reciben señales bioquímicas y mecánicas adecuadas. sistemas recientes de ingeniería de tejidos de hígado han empleado andamios tridimensionales (3D) compuestas de hidrogeles sintéticos o naturales, dado su alta retención de agua y su capacidad de proporcionar los estímulos mecánicos necesarios por las células. Ha habido un creciente interés en el andamio invertida cristal coloidal (ICC), un desarrollo reciente, que permite a la organización espacial alta, homotipica e interacción celular heterotıpica, así como la matriz de interacción célula extracelular (ECM). En este documento, se describe un protocolo para fabricar el andamio ICC utilizando poli diacrilato (etilenglicol) (PEGDA) y el método de lixiviación de partículas. En pocas palabras, una celosía está hecho de partículas de microesferas, después de lo cual un pre-de poSe añade solución r, adecuadamente polimeriza, y las partículas se retiran, o lixiviado, usando un disolvente orgánico (por ejemplo, tetrahidrofurano). La disolución de los resultados de celosía en un andamio altamente poroso con tamaños y interconectividades que permiten los medios de comunicación para llegar a las células más fácilmente de poros controlados. Esta estructura única permite a área de superficie alta para que las células se adhieren a, así como fácil la comunicación entre los poros, y la capacidad de recubrir el andamio ICC PEGDA con proteínas también muestra un efecto marcado en el rendimiento de la célula. Se analiza la morfología del esqueleto, así como el hepatocarcinoma celular (Huh-7.5) el comportamiento en términos de viabilidad y la función de explorar el efecto de la estructura de la CPI y revestimientos de ECM. En general, este documento proporciona un protocolo detallado de un andamio emergente que tiene amplias aplicaciones en la ingeniería de tejidos, especialmente la ingeniería de tejidos del hígado.
Introducción
El hígado es un órgano altamente vascularizado con una multitud de funciones, incluyendo la desintoxicación de la sangre, el metabolismo de xenobióticos, y la producción de proteínas séricas. El tejido del hígado tiene una microestructura tridimensional compleja (3D), que consta de múltiples tipos de células, canalículos biliares, sinusoides, y zonas de diferente composición biomatriz y diferentes concentraciones de oxígeno. Dada esta estructura elaborada, ha sido difícil crear un modelo de hígado adecuado in vitro 1. Sin embargo, hay una creciente demanda de funcional en modelos in vitro de alojamiento hepatocitos humanos como p....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. CPI Andamios Fabricación (Figura 1)
- Preparar el poliestireno (PS), cercados (diámetro = 6 mm; 8-13 capas de perlas).
- Para preparar el molde, cortar las puntas fuera de 0,2 ml tubos de microcentrífuga hervir a prueba al nivel de 40 l. Adherir la parte superior de los tubos de corte de 24 x 60 mm 2 de microscopio de vidrio se desliza la cubierta con pegamento a prueba de agua.
- Poner las esferas de PS (diámetro = 140 mM) contenidos dentro de una suspensión de agua en un vial de 20 ml, pipetear cuidadosamente la suspensión de agua, y añadir 18 ml de 70% de solución de etanol en el vial. Ponga la solución esfera en un baño de ul....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los resultados representativos para la caracterización estructural del andamio CPI y la comparación de la eficacia de cada condición del andamio de la CPI en el cultivo de hepatocitos se muestran y explican a continuación. Las condiciones de andamio ICC utilizados en estos resultados son recubrimientos de colágeno de 0 g / ml (desnudo), 20 mg / ml (de colágeno 20), 200 mg / ml (de colágeno 200), y 400 mg / ml (de colágeno 400) y la inicial número de células de siembra-7,5 eh es 1x10
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Andamios de ingeniería de tejidos están evolucionando rápidamente para proporcionar todas las señales físicas y bioquímicas necesarias para regenerar, mantener o reparar los tejidos para la aplicación de la sustitución de órganos, el estudio de la enfermedad, el desarrollo de fármacos, y muchos otros 57. En la ingeniería de tejidos de hígado, los hepatocitos primarios humanos pierden rápidamente sus funciones metabólicas una vez aislados del cuerpo, creando una gran necesidad de andamios de ingeniería y el de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el apoyo de una beca de la Fundación de Investigación Nacional (NRF -NRFF2011-01) y el Programa de Investigación Competitiva (NRF-CRP10-2012-07).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de PCR de 0,2 ml | Axygen Scientific | PCR-02D-C | prueba de ebullición |
| Gorilla Glue, Inc. | Depende del proveedor. Esto se compró en una tienda local. | ||
| Correderas de vidrio | VWR | 631-1575 | Dimensiones: 24 veces; 60 mm2 |
| Esferas de poliestireno | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diámetro = 140 µ m; 3x104 partículas por mililitro y distribución de tamaño del 1,4% |
| Etanol | Merck | 1.00983.1011 | absoluto para análisis EMSURE; Diluir al 70% con agua Milli-Q |
| Baño ultrasónico | Elma | S10H | Horno de equipo |
| Nabertherm | N7/H | Equipo | |
| 200 µ l punta de pipeta | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Agitador oscilante | VWR | 444-0142 | |
| Polietilenglicol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; la acrilación de monómeros PEG y la purificación del precipitado resultante producen un macrómero PEGDA con Mw = 4,6 |
| Centrífuga | Beckman Coulter | 392932 | equipo |
| Acrilato-poli(etilenglicol) - Valerato de succinimidilo | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3,4 kDa |
| 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vórtice | VWR | 58816-123 | Equipo |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Película de parafina | Parafilm M | #PM996 | Se mantiene a 9" con una intensidad permitida de 10.84 mW/cm2 |
| Foco UV Bluewave 200 | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahidrofurano (THF) | Merck | 107025 | |
| Agitador orbital | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Colágeno Tipo I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | De rata 1x, sin CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2 |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10 x 10 ml |
| Paraformaldehído | VWR | 43368.9M | Equipo |
| Freezone 4.5 liofilizador | Labconco | 7750020 Equipo Recubrimiento | |
| pulverización catódica | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipo |
| Microscopio Electrónico de Barrido | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anticuerpos primarios anti-ratón contra el colágeno tipo I | Abcam | ab6308 | |
| Anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Placa, cultivo de tejidos 24 pocillos, fondo plano (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) 2,5 g/L de glucosa con L-Gln | Lonza | 12-604F | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicilina-estreptomicina (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Placas de cultivo sin tratar Corning | Sigma Aldrich CLS430591 | ||
| 0.25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipo; 37 ° C, 5% de humedad |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadoras | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Hemacitómetro | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Kit de Viabilidad/Citotoxicidad Vivo/Muerto para células de mamíferos | Life Technologies | L3224 | |
| Ensayo CCK-8 | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Reactivo de sal de monosodio (MSR) |
| Lector de microplacas Infinite 200 PRO | Tecan | ||
| Albúmina Kit ELISA Humano | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anticuerpos primarios anti-ratón (contra CYP3A4, albúmina) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 etiquetado como Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Cloroformo | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC | agua Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Espectrofotómetro | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Transcripción inversa Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR seleccionan Master Mix para CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (a elegir) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
Referencias
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
