Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Resumen

Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.

Resumen

A continuación, se describe un protocolo para llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de múltiples especies microbioma intestinal humano con vellosidades intestinales microconstruidos en un dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nosotros recapitular la interfaz de tejido lumen capilar intestinal en un dispositivo de microfluidos, donde las deformaciones mecánicas y fisiológicas flujo de cizallamiento del fluido se aplican constantemente para imitar el peristaltismo. En el microcanal lumen, células epiteliales intestinales Caco-2 humanas se cultivan para formar un epitelio de las vellosidades 'libre de gérmenes' y regenerar pequeñas vellosidades intestinales. células microbianas Pre-cultivadas se inoculan en el lado del lumen para establecer un ecosistema huésped-microbio. Después de células microbianas se adhieren a la superficie apical de las vellosidades, flujo de fluido y deformaciones mecánicas se reanudan a producir un microambiente de estado estacionario en el que se suministra constantemente medio de cultivo fresco y las bacterias no unidas (así como los residuos bacterianos) se eliminan de forma continua. Después de co-cultivo prolongado fdía ROM a semanas, se encuentran varios microcolonias que se encuentra de forma aleatoria entre las vellosidades, y ambos microbiana y células epiteliales permanecen viables y funcional para al menos una semana en cultivo. Nuestro protocolo de co-cultivo se puede adaptar para proporcionar una plataforma versátil para otros ecosistemas huésped-microbioma que se pueden encontrar en diversos órganos humanos, que pueden facilitar el estudio in vitro de la función del microbioma humano en la organización de la salud y la enfermedad.

Introducción

El intestino humano alberga una matriz sorprendentemente diversa de especies microbianas (<1.000 especies) y un enorme número de células microbianas (10 veces más que las células huésped humanos) y genes (100 veces más que el genoma humano) ^1. Estos microbiomas humanos juegan un papel clave en el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, la regulación de la respuesta inmune, y el mantenimiento de la homeostasis intestinal ^2. No es sorprendente, teniendo en cuenta estas diversas funciones, el microbioma intestinal comensal modula ampliamente la salud y la enfermedad ^3. Por lo tanto, la comprensión del papel de microbioma intestinal y h....

Protocolo

1. La microfabricación de un dispositivo Gut-on-a-chip

Nota: El a-chip gut-en-es un dispositivo de microfluidos hecho por, polímero de silicona permeable al gas transparente (polidimetilsiloxano, PDMS), que contiene dos microcanales paralelos (1 mm de ancho x 150 m de altura x 1 cm de longitud) separados por una flexibilidad porosa (10 micras de diámetro de poro, de 25 micras de poro de separación de poro) PDMS membrana de ^5,9. Fabricar el (Figura 1A, izquierda) gut-on-a-chip siguiendo los pasos que se indican.

1. Microfabricación Procedimiento del ^5,9 Gut-on-a-chip.
   1. Preparar PDMS, d....

Resultados

Para emular el ecosistema anfitrión-microbioma intestinal humano in vitro, es necesario desarrollar un protocolo experimental para reconstituir el estable a largo plazo co-cultivo de las bacterias intestinales y células epiteliales intestinales humanas en condiciones fisiológicas como la mecánica peristaltismo similar y el flujo de fluido. Aquí, utilizamos un microdispositivo biomimético gut-on-a-chip (Figura 1A) para co-cultivo de células .......

Discusión

La comprensión de las interacciones huésped-microbioma es fundamental para el avance de la medicina; Sin embargo, los modelos de cultivo celular tradicionales realizadas en un plato de plástico o una placa estática no apoyan la estable co-cultivo de células intestinales humanas con microbios intestinales vida de más de 1-2 días porque las células microbianas en su mayoría crecen en exceso las células de mamífero in vitro. La población microbiana overgrowing consume rápidamente oxígeno y nutrientes, produciendo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) que contiene 25 mM de glucosa y 25 mM HEPES	Gibco	10564-011	Caliéntalo a 37 ° C en un baño de agua.
Difco Lactobacilos MRS caldo	BD	288120	Funciona el autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Poly(dimetilsiloxano)	Dow Corning	3097358-1004	15:1 (w/w), PDMS : agente curativo
Caco-2BBE línea de carcinoma colorrectal humano Centro de	Enfermedades Digestivas		de Harvard Adenocarcinoma colorrectal humano
FBS inactivado por calor	Gibco	10082-147	20% (v/v) en DMEM
Penicilina-estreptomicina-glutamina	Gibco	10378-016	Dilución 1/100 en DMEM
4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato Sondas	moleculares	D1306	Tinción de núcleos
Conjugado con faloidina-CF647 (25 unidades/ml)	Biotium	00041	Tinción
Sistema de tensión Flexcell FX-5000	Flexcell International Corporation	FX5K	Movimiento de trenzado similar al peristaltismo (10% de deformación celular, frecuencia de 0,15 Hz)
Microscopio de epifluorescencia invertida	Zeiss	Axio Observer Z1	Imaging, DIC
Microscopio confocal de barrido	Leica	DMI6000	Imaging, fluorescencia
UVO Cleaner	Jelight Company Inc	342	Activación superficial del colágeno tipo I del chip intestinal
	Gibco	A10483-01 Componente de	matriz extracelular para cultivo celular en el chip
Matrigel	BD		354234 Componente de matriz extracelular para cultivo celular en chip
Jeringa desechable de 1 ml	BD	309628	Inyección de células y medios
25 G Aguja de 5/8	BD	329651	Inyección de células y medios
Bomba de jeringa Braintree	Scientific Inc.	BS-8000	Equipo de inyección en el chip
VSL#3	Sigma-Tau Pharmaceuticals	7-45749-01782-6	Una formulación de 8 microbios intestinales comensales diferentes
Medio Clostridial reforzado	BD	218081	Medio de cultivo de bacterias anaeróbicas
Sistema de contenedores anaerobios GasPak EZ con indicador	BD	260001	Sobre generador de gas anaeróbico
Paraformaldehído al 4%	microscopía electrónica	157-4-100	Fijación de las células para la tinción
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilización de las células
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7030	Agente bloqueante para la tinción de las células
Tratador de corona	Productos electrotécnicos	BD-20AC	Generador de plasma para la fabricación del chip
Steriflip	Millipore	SE1M003M00	Desgasificación de todo el medio de cultivo
Hemocitómetro desechable	iNCYTO	DHC-N01	Para el recuento manual de células

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