Los trasplantes competitivos para Evaluar la aptitud de Células Madre Hematopoyéticas

La hematopoyesis es un proceso regenerativo que garantiza la reposición de las células de la sangre que se han perdido por lesión, la radiación y la muerte celular. Este proceso está garantizada por las células madre hematopoyéticas (HSC) que residen en gran parte en la médula ósea de adultos. Además, las células madre hematopoyéticas pueden usarse para fines terapéuticos en trastornos autoinmunes, neoplasias hematológicas e inmunodeficiencias ^1. Por tanto, existe una necesidad de comprender mejor los mecanismos que regulan la función HSC, incluyendo su expansión proliferativa y su capacidad para alcanzar y injertar hueso receptor después del trasplante de médula. Aunque estudios recientes han informado de varios marcadores de la superficie celular, incluyendo los miembros de la familia SLAM CD150 y CD48, para enriquecer de forma prospectiva las HSC adultas y células madre hematopoyéticas fetales a aproximadamente el 50% de pureza ^2-4, la medida estándar de oro para las CMH funcional sigue siendo un ensayo in vivo para repoblar determinar su capacidad para restablecer la sangre cell producción en un huésped irradiado ^5.

El ensayo de repoblación clonal in vivo fue desarrollado inicialmente por Till y McCulloch ⁶ y desde entonces ha sido refinado y ampliado. Como se definió originalmente, las CMH asegurar la producción de glóbulos permanente a través de la auto-renovación y diferenciación. La transferencia de células madre hematopoyéticas en un receptor irradiado por lo tanto nos permite evaluar: su capacidad de diferenciarse a través del análisis de los diferentes linajes de células sanguíneas (linfocitos T, linfocitos B, granulocitos, monocitos) y su capacidad de auto-renovación a través del trasplante de serie. El ensayo sería por lo general implican la comparación de la funcionalidad y / o la cantidad de dos poblaciones de HSCs, por ejemplo, células procedentes de dos ratones de diferentes genotipos o células que han sido tratadas o no tratadas con diferentes factores que podrían influir en el mantenimiento o expansión de HSCs en la cultura. quimerismo de donantes, o la aportación del donante transferido HSC to la producción de glóbulos entonces se puede determinar por análisis de citometría de flujo en la sangre periférica y la médula ósea usando marcadores de superficie celular u otros métodos que distinguen las células del donante del receptor, o host. Los marcadores más utilizados son sin duda los dos alelos para el gen del antígeno CD45 PTPRC o leucocitos ⁷ que hemos elegido para los ejemplos que se proporcionan a continuación.

El ensayo de repoblación clonal puede ser competitivo o no competitivo. En un entorno no competitivo, las CMH control y de ensayo se transfieren a los ratones receptores separados y los resultados para cada tipo de célula será independiente de la otra. En un entorno competitivo, la función tanto de ensayo y control HSC se mide contra un competidor población de células madre hematopoyéticas. El protocolo descrito aquí utiliza la configuración competitivo, pero también puede ser adaptado para situaciones no competitivas. Ambos enfoques tienen sus ventajas y limitaciones, y vamos a compararlos con detalle en eldiscusión. También describimos diferentes enfoques para asegurar la equidad en el número de células madre hematopoyéticas trasplantadas, explicamos cómo adaptar el ensayo para la cuantificación de las HSC por ensayo de dilución limitante (LDA), y proporcionar ejemplos de ambos trasplantes exitosos y no exitosos para la interpretación de los resultados.

Todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el comité de ética animal institucional y seguir el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales.

Nota: Para mantener condiciones estériles / libres de patógenos específicos de vivienda, llevar a cabo todos los procedimientos que implican la manipulación directa de ratones vivos dentro de una cabina de seguridad biológica o una campana de flujo laminar. Limpiar o esterilizar jaulas, dispositivos de retención, materiales de construcción, chow y el agua suministrada a los animales apropiadamente. Utilice solamente agujas estériles y desechables para las inyecciones y para el muestreo de sangre. La técnica aséptica es crucial durante la preparación del injerto.

1. Preparación de los ratones receptores

1. Identificar los ratones receptores con muescas en las orejas (u otro método aprobado por el comité local de ética animal ⁸⁾ para permitir seguimiento individual de la sangre y la médula ósea periférica de la reconstitución con el tiempo. Pesar los ratones para el post-trasplante de seguimiento. Nosratones receptores electrónicos que son entre 7 y 12 semanas de edad (menos de 25 g).
   Nota: En el ejemplo, los ratones receptores CD45.1 ⁺ CD45.2 ⁺ fueron criados en casa cruzando ratones C57BL / 6 con los ratones B6.SJL congénitas.
2. Irradiar ratones receptores con dos dosis de 450 rad para destruir la actividad hematopoyética. Dar la primera dosis el día antes del trasplante y la segunda 1-2 horas antes del trasplante.
   Nota: Los rayos de rayos X o gamma pueden ser utilizadas dependiendo de la disponibilidad de instalaciones adecuadas.

2. Preparación de los donantes y de la competencia células de médula ósea

1. La eutanasia a los donantes (de prueba y de control; CD45.2 ⁺⁾ y competidor (CD45.1 ^+; B6.SJL) ratones mediante asfixia con _CO2, seguido por dislocación cervical o utilizando métodos aprobados por el comité local de ética animal.
2. Coloque los ratones en sus espalda, las piernas de par en par, en una placa de Petri vacía o sobre una gasa estéril (para mantener la superficie de trabajo limpia) iNside una cabina de seguridad biológica. Mojar la piel y el pelo con un 70% de etanol / 30% de _H2O (v / v).
3. Cortar el pie con una hoja de bisturí o tijeras afiladas. Corte y abra la piel a lo largo de la pierna y alejarse de la piel con unas pinzas dentadas. Cortar el exceso de músculo.
4. Dislocar fémur tirando del hueso de la pierna y el uso de hojas de tijera contra los huesos de la pelvis como una fuerza contraria. Separar tibia y el fémur de la rótula y eliminar bits restantes de los músculos y tendones. Coloque los huesos en solución salina tamponada con fosfato 2-3 ml estéril (PBS) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
5. Recoger células de la médula ósea por el lavado de los huesos con 5 ml de PBS estéril.
   1. Sostener el hueso suavemente con fórceps e insertar una aguja de 25 G unida a una jeringa llena de 1 ml a un extremo del hueso. Presione el émbolo y recoger las células en un tubo cónico de 15 ml. Repita según sea necesario hasta que el centro del hueso es de color blanco.
6. Disociar las células por las repetidas pasa a través de la aguja paraobtener una suspensión de células individuales. Evitar las burbujas y el exceso de fuerza. Nota: Utilice una aguja ligeramente más grande (22 G) para mejorar la viabilidad celular en este paso.
7. Pasar las células a través de un filtro de nylon de 70 micras para asegurar la suspensión celular uniforme y para eliminar los residuos y grumos.
8. Retirar una alícuota para el recuento de células usando un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión celular restante a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Volver a ajustar la densidad celular como se requiere en PBS estéril (10 ⁸ células / ml). Mantener las células en hielo.

3. El establecimiento de donante de células equivalentes de HSC

1. Transferir el equivalente a 3 x 10 ⁶ células (30 l) en un 5 ml redondas tubo de poliestireno de fondo para la tinción de citometría de flujo. Añadir un volumen igual de anticuerpo no marcado contra CD16 / CD32 para bloquear la tinción no específica (diluido en tampón de tinción (PBS suplementado con 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 1 mM) para una concentración final de 2,5 mg / ml). Incubar 5 min a RT.
2. Añadir 90 l fluorocromo conjugado anticuerpo mezcla maestra preparada en tampón de tinción: Linaje cóctel biotinilado (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Incubar en hielo durante 30 min, protegido de la luz.
   Nota: Las diluciones apropiadas deben determinarse para cada lote de anticuerpos. Véase la Tabla de Materiales para las diluciones utilizadas en este estudio.
3. Añadir tampón de tinción 2 ml a las células, de vórtice y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar el anticuerpo no unido. Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet con un movimiento rápido.
4. Añadir 10 l de estreptavidina conjugada con fluorocromo diluido en tampón de tinción (véase la Tabla de Materiales). Incubar en hielo durante 20 min, protegido de la luz. Lavar como en el paso 3.3 para eliminar la estreptavidina no unida.
5. Adquirir las muestras de células utilizando un citómetro de flujo con al menos seis detectores ^9. Determinar la frecuencia de Lin ^- Sca1 ⁺ CD117 ⁺ CD135 ^- CD150 ^{Figura 2 y como se informó anteriormente 10,11.
   Nota: La frecuencia de las CMH funcionales dentro de esa población puede estimarse entre 1/3 y 1/5 2,12.}
6. Establecer equivalentes estimados HSC para todas las muestras ^11, utilizando una muestra (típicamente, el competidor, B6.SJL CD45.1 ⁺ en este ejemplo) como línea de base, como se detalla a continuación y en la Figura 2.
   1. Calcular el número de células necesarias mediante las siguientes fórmulas:
      #transplanted HSC / receptor = 5 x 10 ⁵ células x estimado de frecuencia HSC (según lo determinado para la muestra de referencia; este número es por lo general entre 75 y 125 para los de tipo salvaje ratones C57BL / 6) ^10-12.
      Nota: En la Figura 2, para la muestra A, el resultado es de 139 HSCs.
      células # trasplantado totales (para otras muestras, por ejemplo de la muestra B en la Figura 2) = # transplantado frecuencia de las HSC / HSC.
      Nota: En la Figura 2, para la Muestra B, el resultado es 197 826 (o aproximadamente 2 x 10 ⁵⁾ total de células de médula ósea.
7. Calcular el número total de células requeridas por receptor del injerto para cada muestra utilizando los resultados obtenidos anteriormente.
   Nota: Este número debe ser de 5 x 10 ⁵ para la muestra de referencia (competidor).
   1. Multiplicar el número obtenido en la etapa 3.7 por el número de ratones receptores y añadir células suficiente para al menos dos ratones adicionales para compensar el volumen muerto en la jeringa.
8. Mezclar competidor (por ejemplo, CD45.1 ⁺⁾ y células de ensayo (CD45.2 ⁺⁾ en proporción 1: 1 equivalentes HSC según lo calculado en el paso 3.6 y ajustar el volumen final de 200 l por inyección utilizando PBS estéril.
   Nota: para un grupo de cinco ratones receptores del volumen sugerido tanto, sería al menos 1,4 ml, que contiene 3,5 x 10 ⁶ células de médula ósea de la competencia (o973 HSCs estimados para la muestra A en la Figura 2), y el número equivalente de células de ensayo (en la Figura 2, el equivalente para la Muestra B serían 197.826 x 7 = 1,384,782 células de médula ósea).

4. Trasplantes de Médula Ósea

1. Calentar los ratones receptores irradiados en el paso 1.2 con una lámpara de calor rojo para asegurar la dilatación de los vasos sanguíneos y hacer que el lateral de la cola venas más visibles.
2. Preparar una jeringa de tuberculina de 1 ml equipada con una aguja de 27 G (o menor). Aspirar aproximadamente 750 l de la suspensión celular preparada (para los ratones receptores 3). Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa.
3. Inserte el ratón en un dispositivo de retención. Examine la cola y buscar las venas de la cola laterales que sean claramente visibles en ambos lados de la cola. Limpie la zona de inyección con etanol. Insertar la aguja bisel hacia arriba, paralela a la piel y presione suavemente el émbolo. La inyección debe ser fácil. Si la fuerza es rerido, la aguja no está en la vena.
   Nota: Los ratones más viejos tienen una piel más gruesa, lo que puede hacer la búsqueda de la vena más difícil. Si la aguja no está en la vena, vuelva a insertar la aguja proximal al sitio de inyección inicial.
4. Retire la aguja y presione el lugar de la inyección con una gasa estéril durante unos segundos para detener el sangrado. Transferir el ratón en una jaula limpia.
   Nota: Utilice la misma jeringa y la aguja de tres inyecciones, después de lo cual la aguja puede llegar a ser demasiado aburrido.
5. Para post-trasplante de seguimiento, se inyecta por vía subcutánea 1 ml de PBS estéril para rehidratar los ratones durante los primeros cinco días. Añadir antibióticos en el agua potable para prevenir infecciones (si es necesario; opcional). Pesar los ratones cada dos o tres días para las primeras tres semanas y la eutanasia a los ratones que han perdido más de un 15-20% de su peso corporal antes del trasplante (o según lo determinado por el comité local de ética animal).

5. Análisis de sangre periférica

1. Se recoge una gota de sangre (unaPprox. 50-100 l) en tubos de EDTA.
   1. Para recoger sangre de la vena mandibular, utilizar una lanceta o una aguja 22 G para perforar la piel de la cara cerca del lugar sin pelo situado debajo de la mandíbula y colocar el tubo de recogida para recibir la gota de sangre ^13. Recoger la sangre a las 4, 8, 12 y 16 semanas después del trasplante para seguir la reconstitución multi-linaje.
2. Añadir 1 ml recién preparada RT tampón de lisis de glóbulos rojos (9 partes de 0,16 M NH ₄ Cl + 1 parte M Tris-HCl 0,17 pH 7,65) a la gota de sangre recogida en el paso 5.1.1. Mezclar y muestra de transferir a un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo adecuado para citometría de flujo. Dejar reposar durante 4 minutos a temperatura ambiente.
3. Añadir 4 volúmenes de PBS helado. Mezclar girando de extremo a extremo y transferir inmediatamente en hielo. Centrifugar 10 minutos a 200 xg a 4 ° C.
4. Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet con un movimiento rápido. Sobrenadante debe ser claro y rojo. Añadir 2 ml de tampón de tinción y agitar brevemente. Centrifugar 5 min a 200 xgat 4 ° C.
5. Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet con un movimiento rápido.
6. Proceder con la tinción de citometría de flujo utilizando el protocolo general detallado en pasos de 3.1 a 3.3 y los siguientes anticuerpos para la mezcla maestra: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
7. Adquirir las muestras de células utilizando un citómetro de flujo con al menos seis detectores ^9. Determinar la frecuencia de células derivadas del donante para cada linaje (linfocitos B CD19 ^{+, los} linfocitos T CD3e, GR1 granulocitos ^brillantes) en cada muestra utilizando la plantilla de análisis proporcionado en la Figura 3 y como se publicó ^10,11.

6. Análisis de la médula ósea Reconstitución

1. Recoger células de la médula ósea, como se detalla en el apartado 2. teñir las células para el análisis de citometría de flujo utilizando el protocolo general se detalla en los pasos 3.1 a 3.3 y los siguientes anticuerpos para la mezcla maestra: cóctel de Linaje, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. detectar linanticuerpos cóctel EAGE utilizando estreptavidina conjugada con fluorocromo tal como se describe en el paso 3.4.
2. Adquirir muestras de células utilizando un citómetro de flujo con al menos ocho detectores ^9. Si sólo seis están disponibles, añadir CD135 para el mismo canal que el panel linaje que serán excluidos células CD135 ^+. Determinar la frecuencia de Lin derivadas del donante ^- Sca1 ⁺ CD117 ⁺ CD135 ^- CD150 ⁺ HSC en cada muestra utilizando la plantilla de análisis proporcionados en la figura 4 y como se publicó ^{el 10.}

Una descripción general de la configuración de trasplante competitivo, incluyendo los trasplantes secundarios (discutidos más adelante) se puede obtener información más detallada se encontró en la Figura 1. Un análisis representativo para el hueso pre-trasplante de médula HSCs se puede encontrar en la Figura 2. En la exclusión de dobletes y Las células muertas se pueden encontrar en otro lugar 9.

Las figuras 3 y 4 proporcionan ejemplos de citometría de flujo de plantillas de análisis de sangre periférica y médula ósea, respectivamente. Es normal para detectar algunos linfocitos T anfitrión (hasta 20% de todas las células T; Figura 3B), como células T son más resistentes a la radio. células de la competencia derivados deben estar presentes en los tres linajes. El límite de detección depende mucho del número de células totales adquiridos para el análisis, pero en nuestra experiencia con un total de 20 mil células dentro de lasola puerta de leucocitos es generalmente suficiente. El uso de un umbral arbitrario de 1% o 0,5%, si las células de los donantes representan una proporción menor que el punto de corte en cualquier linaje dado (linfoide B, T linfoide o mieloide, como se muestra en la Figura 3), el ratón no se considera positiva para la reconstitución multilinaje . Este concepto es importante cuando los trasplantes competitivos se combinan con un ensayo de dilución limitante para cuantificar las CMH donantes como se explica en la discusión. Sin duda, es posible tener, por ejemplo, linfocitos T y B derivadas del donante como pérdida gradual de las células mieloides, lo que suele sugerir la reconstitución solamente transitoria. Los linfocitos tienen vidas medias más prolongadas que las células mieloides (particularmente Gr1hi SSChi granulocitos / neutrófilos) y pueden persistir incluso en ausencia de células madre hematopoyéticas de la médula ósea 10.

La Figura 5 representa los resultados representativos de quimerismo sangre periférica bajo diferentes situciones. Cuando HSCs donantes son funcionalmente equivalentes a las células de la competencia, las proporciones de donante (CD45.2 +) y competidor (CD45.1 +) células -derivado son equivalentes (Figura 5A). Las células huésped residuales (CD45.1 + CD45.2 +) en la Figura 5A y 5B son casi exclusivamente los linfocitos T, ya que son más resistentes a la radio. Cuando las células del donante presentan una proporción mucho menor de leucocitos de sangre periférica (Figura 5B), algunos aspectos de la función HSC es probable defectuoso y se necesitan estudios adicionales como se describe en la discusión. La presencia de células de la competencia confirma que el ensayo funcionaba bien, pero médula ósea del donante era simplemente menos efectivos. Esto está en contraste con el resultado presentado en la Figura 5C, en donde tanto las células donantes y competidor están presentes en números y células huésped bajo representan la mayoría de las células de sangre periférica. En este caso, el trasplante no tuvo éxito y it no es posible sacar ninguna conclusión en cuanto a la funcionalidad relativa de los donantes frente a las células de la competencia. Diferentes soluciones se discuten más adelante.

. Figura 1. Diseño experimental (A) Para un trasplante competitiva, células de médula ósea de ratones donantes (+ CD45.2; C57BL6 fondo; control y de prueba) y un competidor ratones congenic (CD45.1 +; B6.SJL) se mezclan en una relación 1: 1 y se inyectó en la vena de la cola de ratones receptores irradiados (CD45.1 + CD45.2 +; progenie F1 de C57Bl6 x parejas reproductoras B6.SJL). La eficacia de la reconstitución de la médula ósea se determina en la sangre periférica (PB) a las 4, 8, 12 y 16 semanas después del trasplante y en la médula ósea a las 16 semanas después del trasplante o posterior. (B) A fin de evaluar la auto-renovación de las células trasplantadas, boncélulas de la médula e recuperados de los receptores de trasplante después de 16 semanas se pueden transferir en ratones receptores secundarios irradiados. HSC, de células madre hematopoyéticas; MPP, de células progenitoras multipotentes; LMPP, MPP linfoide-cebado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Pre-trasplante de HSC plantilla de análisis de médula ósea. Dentro de las células individuales, seleccione HSPCs acuerdo con cKit (CD117) y la expresión Linaje. Dentro del dim / Lin - población de células, seleccione la cKit Sca1 brillante + población (TSI). Dentro LSKs, seleccione CD150 + CD135 - CMH. Esta población contiene tanto a largo plazo como a corto plazo la repoblación de células madre hematopoyéticas (la frecuencia de una célula de repoblación dentro de esta población es serentre 1/3 y 1/5). La frecuencia estimada de la médula ósea células madre hematopoyéticas se calcula dividiendo el número de eventos en la puerta de HSC por el número de eventos en la puerta de una sola célula. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Post-transplante de plantilla de análisis de sangre periférica. (A) Dentro de las células individuales, seleccionar primeros granulocitos hi SSC GR1 brillantes. (B) A continuación, seleccione CD19 + CD3e - linfocitos B y CD3e + CD19 - linfocitos T. sangre periférica de ratón contiene una gran proporción de linfocitos, con linfocitos B de ser el principal tipo de células (aproximadamente 50% de todas las células de sangre periférica). CE) Dibuje flujo 2D citometría de parcelas para cada subconjunto con CD45,2 en un eje y CD45.1 en el otro. Identificar los donantes (CD45.2 +), anfitrión (CD45.1 + CD45.2 +) y células de la competencia (CD45.1 +) para cada linaje como se muestra. Es normal tener algunas células huésped restantes, particularmente en la población de linfocitos T como se ve en el panel E. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. post-trasplante de HSC plantilla de análisis de médula ósea. Dentro de las células individuales, seleccione HSPCs y LSKs como se muestra en la Figura 2. Dentro LSKs, seleccione CD150 + CD135- HSC, CD150- CD135- progenitoras multipotentes (o MPP) y CD135 + CD150- linfoide MPP -primed (o LMPPs). La proporción de LMPPs es más bajo después del trasplante que en los ratones no irradiados. Dibujar en 2D flujo cytometry parcelas para cada subconjunto con CD45.2 en un eje y CD45.1 en el otro. Identificar los donantes, células huésped y de la competencia para cada subpoblación como se muestra. Si la irradiación y trasplante tienen éxito, no debe haber muy pocos HSPCs anfitrionas restantes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Los resultados representativos de quimerismo en la sangre periférica. (A) trasplante exitoso donde donante HSCs son funcionalmente equivalentes a las células competidor. La gran mayoría de las células huésped restantes (CD45.1 + CD45.2 +) es generalmente de linfocitos T. (B) El éxito de trasplante de donante, donde las CMH función show disminuyó en comparación con las células de la competencia. Esta contribución puede ser disminuido debido aSe necesitarán varios factores diferentes y su posterior análisis (véase el debate). (C) trasplante de éxito con las frecuencias bajas tanto de las células del donante y competidor y una gran proporción de las células huésped restantes. Este tipo de resultado sugiere un menor que la dosis prevista de la irradiación, la inyección sin éxito (disminución de la viabilidad celular, disminución del volumen de la inyección, la inyección fuera de la vena de la cola), o una combinación de éstos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.