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Artículo de método

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

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DOI:

10.3791/54349

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24 de agosto de 2016

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1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

En este artículo

Resumen

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

Resumen

En el proceso omnipresente de fusión de la membrana de la apertura de un poro de fusión establece la primera conexión entre dos compartimentos separados anteriormente. Durante neurotransmisor o la liberación de hormonas a través de la exocitosis, el poro de fusión puede abrir y cerrar transitoriamente en varias ocasiones, la regulación de la cinética de liberación de carga. la dinámica de los poros también determinan el modo de reciclaje de vesículas; resellado resultados irreversibles en la fusión transitoria, "kiss-and-run", mientras que la dilatación conduce a la fusión completa. Para entender mejor los factores que gobiernan la dinámica de los poros, hemos desarrollado un ensayo para monitorizar la fusión de membranas mediante microscopía de fluorescencia polarizada de reflexión interna total (TIRF) con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución en un bioquímicamente bien definidas sistema in vitro. La fusión etiquetada de manera fluorescente pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas v-SNARE (V-SUV) con una doble capa de apoyo plana t-SNARE, apoyado en un cojín de polímero blando (t-SBL, bicapa t-apoyado), Se controla. El ensayo utiliza canales de flujo de microfluidos que garantizan un mínimo consumo de muestra, mientras que el suministro de una densidad constante de los SUV. La explotación de la mejora rápida de la señal después de la transferencia de las etiquetas de lípidos de la SUV de la LPS durante la fusión, la cinética de la transferencia de colorantes de lípidos se controla. La sensibilidad de la microscopía TIRF permite el seguimiento de las etiquetas de lípidos fluorescentes individuales, de los cuales difusividad de lípidos y tamaño SUV se puede deducir por cada evento de fusión. Los tiempos de liberación de colorante de lípidos pueden ser mucho más de lo esperado para el paso sin obstáculos a través de los poros abiertos de forma permanente. El uso de un modelo que asume el retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un poro "apertura", la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión, puede ser estimado. Un marcador soluble puede ser encapsulada en los terrenos para el seguimiento simultáneo de los lípidos y la liberación de la carga soluble. Estas mediciones indican algunos poros pueden volver a cerrar después de perder una fracción de la carga soluble.

Introducción

La fusión de membranas es un proceso biológico universal, necesaria para el tráfico intracelular de lípidos y proteínas, la secreción, la fertilización, el desarrollo y la envolvió entrada del virus en organismos huésped 1-3. Para la mayoría de las reacciones de fusión intracelular, incluida la liberación de las hormonas y los neurotransmisores a través de la exocitosis, la energía para fusionar dos bicapas lipídicas se proporciona por formación de un haz de cuatro hélices entre las proteínas N-etilmaleimida sensible receptor de la proteína factor de unión soluble cognado (SNARE), anclada en la vesícula (v-SNARE) y la membrana diana (t-SNARE) 4, respectivamente. Sináptica exocitosis de vesículas es la reacción de fusión más estrechamente regulado y se produce dentro de una milésima de segundo después de la llegada de un potencial de acción 1,4,5. El poro de fusión, la conexión inicial entre los dos compartimientos de fusión, puede parpadear abierto y cerrado varias veces antes de volver a sellar o expansión irreversible 5-7. Los resultados anterioresen transitoria, "Kiss & run" de fusión, mientras que la segunda conduce a la fusión completa. Los factores que regulan el equilibrio entre estos dos modos de fusión y mecanismos que regulan el parpadeo de los poros no son bien entendidos 5,8.

Se requieren proteínas SNARE de exocitosis; la fusión de vesículas sinápticas se suprimirán a partir de la escisión de trampas por neurotoxinas 9. Los experimentos de fusión a granel mediante pequeñas vesículas unilaminares (SUV) mostraron que SNAREs no sólo son necesarios, sino también suficiente para impulsar la fusión de membranas 10. En este ensayo mayor, SUVs reconstituyeron con v-SNARE (v-SUV) fueron dopados con fosfolípidos fluorescentes (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) y ( N -. (lisamina rodamina B sulfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) y se mezcló con vesículas que contienen no marcados t-SNARE (t-SUV) Inicialmente la fluorescencia de NBD-PE en v-SUV se extinguió mediante la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET ) a LR-PE. Como laboratorioELED v-SUVs se fusionan con no marcados camisetas SUVs, la densidad superficial fluoróforo en la membrana ahora combinada se reduce y el incremento resultante en la fluorescencia NBD-PE informa de la extensión de los lípidos de mezcla 10. A medida que el ensayo mayor es fácil de configurar y analizar, se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de fusión SNARE mediada 10-14. Sin embargo, tiene varias limitaciones, tales como una baja sensibilidad y una pobre resolución de tiempo. Lo más importante, como una medición de conjunto, el promedio es los resultados de todos los acontecimientos que hacen discriminación entre acoplamiento y de fusión, así como la detección de intermedios hemifusion difíciles.

La última década varios grupos, incluido el nuestro, se han desarrollado nuevos ensayos para monitorizar los eventos de fusión a nivel de la vesícula única 15-27. Ha y sus colegas utilizaron en V SUV atados sobre una superficie y un seguimiento de su fusión con T-SUV gratuitas 18,19. la mezcla de lípidos se controló utilizando FRET entre un par de fluoróforos unidos a lípidos emcamas en el V y T-SUV, respectivamente, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) 18. Más tarde, el laboratorio de Brunger utiliza una sola especie de lípidos de la etiqueta junto con un marcador de contenidos para la detección simultánea de lípidos y mezclando 20,28. Tanto el lipídica y los marcadores de contenidos se incluyeron en altas concentraciones, auto-enfriamiento rápido; fusión con SUVs no marcados como resultado de la fluorescencia desatenuación 20,28.

Otros han fusionado en V SUV de bicapas planas reconstituidos con t-SNARE 15-17,21-27,29. La geometría planar del objetivo (t-SNARE que contiene) bicapa imita mejor el proceso de fusión fisiológica de vesículas pequeñas, muy curvadas con una membrana de plasma plana. El grupo Steinem emplea membranas de poros que abarca reconstituidos con t-SNARE, suspendidos sobre un sustrato de nitruro de silicio poroso y detecta la fusión con la V-SUV individuales mediante microscopia láser confocal de barrido 23. otros fusadas en V SUV a bicapas planas reconstituidos con t-SNARE, soportados sobre un sustrato de vidrio 15-17,21,22,24-27,29. La gran ventaja de utilizar bicapas soportadas (SBLS) es que la microscopía TIRF se puede utilizar para detectar eventos de conexión y de fusión con una excelente relación señal-ruido y sin interferencia de envío V-SUV, aunque el uso de microfluidos también proporciona una resolución de un solo evento usando -campo lejano estándar microscopía de epifluorescencia 24.

Una preocupación importante es si y cómo las interacciones sustrato bicapa afectar a la calidad apoyados bicapa y el proceso de fusión. Los primeros trabajos hizo uso de SBLS planas que fueron apoyados directamente sobre un sustrato de vidrio o cuarzo 15-17. Estos SBLS se hicieron por adsorción, el estallar, la difusión y la fusión de las membranas t-SUV en el sustrato. Pronto se advirtió, sin embargo, que la omisión de un componente clave t-SNARE, SNAP25, desde SBLS preparados de esta manera resultó en v-SUV de atraque y fusión de cinética indistinguisHable de los obtenidos utilizando la completa t-SNARE 17. Debido SNAP25 es absolutamente necesaria para la fusión in vivo 30,31, la relevancia fisiológica de estos primeros intentos se puso en tela de juicio. El grupo de Tamm superó este desafío mediante la formación de bicapa controla mejor el apoyo 21. Se utiliza la deposición de Langmuir-Blodgett por primera valva libre de proteínas de la SBL, seguido de la fusión de esa monocapa con t-SUVs 21. Esto dio lugar a la fusión SNAP25-dependiente.

Para evitar artefactos potenciales asociados con una bicapa soportada directamente sobre un sustrato de vidrio sin necesidad de utilizar métodos de Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. Introdujo un poli hidratado (etilenglicol) (PEG) amortiguador suave, entre la bicapa y el sustrato 24. Esta modificación también resultó en la fusión SNAP25 dependiente 24. Bicapas acolchados en una capa de polímero blando habían sido conocidos para conservar mejor transmembranala movilidad y función de proteínas de 32 años, y habían sido utilizados en estudios de fusión con virus 33. Además, bicapas PEGilados parecen conservar cierta capacidad de auto-sanar y son muy robustos 34,35. En primer lugar, una fracción de cadenas de PEG, de lípidos ligado disponibles comercialmente están incluidos en la membrana de t-SUV. Cuando estas camisetas SUVs se rompen y forman una bicapa planar sobre un sustrato de vidrio, un cepillo de PEG cubre ambas valvas de la bicapa planar. Debido a la formación de bicapa planar es impulsado por la adhesión de las cadenas de PEG que rodean camisetas SUVs sobre la superficie de cristal hidrófilo, estallido liposoma y formación de bicapa planar son relativamente insensibles a la composición lipídica utilizada. Sin embargo, cuando se incluyen grandes cantidades de colesterol, aumentando las propiedades de cohesión de los SUV, las SUVs no pueden estallar de forma espontánea. Si este es el caso, los iones de choque o divalentes osmóticos pueden ser empleados para ayudar a la formación de bicapa planar 25.

Como se mencionó anteriormente, en este apabordaje un cepillo de PEG cubre ambos lados de la planar, bicapa compatible. El cepillo de cara al canal de flujo de microfluidos ayuda a evitar la adhesión no específica de entrantes v-SUVs que también suelen estar cubiertas de una capa de PEG. La formación de complejos v-t-SNARE y comienza a partir de la membrana distal-N-terminales y procede por etapas hacia los dominios de la membrana proximal-36. Para el V-SUV para interactuar con el t-SBL, horizontal y vertical necesidad t-SNARE N-terminales para sobresalir por encima de los cepillos de PEG, que parece ser el caso en las condiciones del ensayo. Altura del cepillo puede adaptarse para estudiar las proteínas distintas de SNAREs variando la densidad de los lípidos PEGilados y la longitud de la cadena PEG 37,38. Otro de los beneficios de los cepillos de PEG que cubren las superficies proximales de las bicapas de fusión es que se mimetizan con el entorno lleno de las membranas biológicas que están llenas de 30.000-40.000 proteínas integrales de membrana por cuadrado micras 39. Al igual que las cadenas de PEG en este ensayo, la repucapa de proteína lsive que cubre las membranas biológicas necesita ser empujado a un lado para permitir el contacto entre las dos bicapas de fosfolípidos para la fusión que se produzca.

canales de flujo de microfluidos se utilizan en este ensayo, ya que ofrecen ventajas únicas. En primer lugar, el flujo de microfluidos permite una mayor deposición uniforme de t-SUV a extenderse y se fusionan para formar el t-SBL. En segundo lugar, el volumen del canal pequeña (<1 l), se reduce el consumo de muestra. En tercer lugar, los pequeños volúmenes requeridos permiten todo el experimento que se llevó a cabo bajo un flujo constante. Flujo elimina débilmente, presumiblemente de forma no específica, se adhirieron en V SUVs de la SBL 16. También mantiene una densidad constante de v-SUV por encima de la t-SBL, lo que simplifica el análisis cinético 17. Por último, vesículas se acopló se distinguen fácilmente de los libres llevadas por el flujo 25. En cuarto lugar, varios canales de microfluidos pueden ser utilizados en el mismo cubreobjetos, cada sondeo de una condición diferente. Esto permite la comparación de las condiciones Duriendo la misma corrida experimental. Un enfoque similar ha sido utilizado por el grupo van Oijen para estudiar la fusión entre el virus de la gripe y SBLS acolchados 33.

En la microscopía TIRF, el decaimiento exponencial del campo evanescente (con una constante de ~ 100 nm) descomposición confines de fluorescencia de excitación a aquellas moléculas que se encuentran en una proximidad muy cercana de la interfaz de la memoria intermedia de cristal. Esto minimiza la contribución de moléculas fluorescentes que están más lejos, aumenta la relación señal-ruido, y permite que la sensibilidad de una sola molécula con tiempos de exposición marco de 10 a 40 mseg. El campo evanescente también conduce a un aumento de la señal en fusión: como la transferencia de lípidos marcados desde el SUV en el SBL, se encuentran, en promedio, en un campo de excitación más fuerte. Este aumento de la fluorescencia es más fuerte para los liposomas más grandes.

Si la luz polarizada se usa para generar el campo evanescente, efectos adicionales contribuyen a los cambios en la fluorescencia tras la tRANSFERENCIA de las etiquetas de los SUV en el SBL. Algunos tintes de lípidos tienen un dipolo de transición orientada con un ángulo medio preferido con respecto a la bicapa en el que están inmersos. Esto crea una diferencia en la cantidad de fluorescencia emitida por los fluoróforos cuando están en la SUV frente a la SBL, ya que el haz polarizado excitará colorantes en las dos membranas de manera diferente. En el primer caso, el haz de excitación va a interactuar con dipolos de transición orientadas alrededor de la camioneta esférica, mientras que para este último, las orientaciones del dipolo se limitarán por la geometría plana SBL. Por ejemplo, cuando se utiliza luz polarizada s incidente (polarizado normal al plano de incidencia), la excitación es más eficiente cuando el colorante se encuentra en el SBL que en el SUV para un orientado paralelo colorante lípidos transición de dipolo a la membrana 29,40 (como la de Dil o DiD 41-43). Un SUV dopado con un fluoróforo tal está atenuada cuando se acopla sobre el SBL (Figura 7, representat ive Resultados). Como un poro de fusión se abre y conecta las membranas SUV y SBL, sondas fluorescentes se difunden en la SBL y se vuelven más probabilidades de ser excitada por el campo evanescente polarizada s 25,27,29. En consecuencia, la señal de fluorescencia integrado alrededor del sitio de fusión aumenta bruscamente durante la transferencia de colorantes de la SUV en el SBL 27 (Figura 3 y Figura 7). Un factor adicional que contribuye a indicar los cambios que acompañan a la fusión se desatenuación de marcadores fluorescentes a medida que se diluyen cuando se transfiere en el SBL. La contribución de desatenuación suele ser menor en comparación con deterioro del campo de polarización y efectos evanescentes en el ensayo descrito aquí, ya que sólo una pequeña fracción ( figure-introduction-1 ) De los lípidos están etiquetados.

El aumento de la señal en fusión puede ser explotado para deducir las propiedades de poro de fusión mediante la comparación del tiempo,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, requerido para un lípido escape a través de un poro que es completamente permeable a los lípidos al tiempo real de la liberación, figure-introduction-2 . Si las dos escalas de tiempo son comparables, sería concluir que el poro presenta poca resistencia al flujo de los lípidos. Sin embargo, si el tiempo de liberación real es significativamente más largo que el tiempo para la liberación de difusión limitada, esto indicaría un proceso, tales como el parpadeo de los poros, que retarda la liberación de los lípidos. El tiempo de liberación de difusión limitada, figure-introduction-3 , Depende del tamaño del liposoma de fusión y lípidos difusividad; su estimación requiere que estos dos parámetros que se deben cuantificar. La sensibilidad única molécula del ensayo permite la difusividad de lípidos que se mide mediante el seguimiento de varios fluoróforos única de lípidos después de su liberación en el SBL para cada evento de fusión 26. El tamaño de cada vesícula fusionandopuede estimarse a 27 mediante la combinación de (i) la intensidad de un solo colorante de los lípidos, (ii) el cambio en la fluorescencia total alrededor de un sitio de acoplamiento después de que todos los fluoróforos se transfieren a la SBL en fusión, (iii) el conocido densidad etiquetado de SUV lípidos, y (iv) la superficie por los lípidos. Para muchos eventos de fusión, se encontró que los tiempos reales de liberación de lípidos a ser mucho más lento de lo esperado por la liberación controlada por difusión 27, como se ha señalado anteriormente suponiendo tamaño SUV uniforme 44. Suponiendo retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un modelo cuantitativo permite la estimación de la "apertura de poros", la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión 27.

Siempre que sea posible, es importante para poner a prueba los mecanismos de fusión utilizando tanto los lípidos y las etiquetas de contenidos solubles. Por ejemplo, la liberación de lípidos podría retardarse por procedimientos distintos de parpadeo de poros, tales como la restricción de la difusión de lípidos por las proteínas SNARE que surround camisetasél poro. Si este fuera el caso, entonces la liberación del contenido precedería retira de las etiquetas de lípidos, siempre y cuando el poro es lo suficientemente grande como para permitir el paso de sondas solubles. Un defecto más fundamental en el enfoque podría ser en el supuesto de que la transferencia de lípidos marcados a la SBL se produce a través de un poro de fusión estrecho que conecta el SBL a una vesícula que se ha conservado en gran medida su forma pre-fusión. Transferencia de lípidos en el SBL también podría ser el resultado de una rápida dilatación del poro de fusión con una concomitante, extremadamente rápido colapso de la camioneta en la membrana SBL, como sugerido anteriormente sobre la base de datos de liberación de lípidos solo 29. Seguimiento tanto de lípidos y contenido liberar de forma simultánea, se encontró que muchos poros volvieron a sellar después de soltar todas sus etiquetas de lípidos, pero conserva algunos de su carga soluble 27. Esto indica que al menos algunos liposomas no se colapsan en el SBL después de la fusión, y que la transferencia de colorante de los lípidos en el SBL se produce a través de un poro de fusión. Además, lIPID y contenidos de liberación se produjo de forma simultánea 27, por lo que es poco probable que el retraso de la liberación de lípidos era debido al impedimento de la difusión de lípidos por las proteínas SNARE que rodean el poro 45.

Un protocolo de fusión SUV-SBL que no Liberar la monitorización de contenidos solubles se publicó anteriormente por Karatekin y Rothman 25. Aquí, los desarrollos más recientes se incluyen, seguimiento a saber simultánea de lípidos y liberan los contenidos y la estimación de las propiedades de SUV, lípidos, y poro de fusión 27. El protocolo comienza con instrucciones para la preparación de las células de microfluidos, hechos por la unión de un poli (dimetil siloxano) ranuras (PDMS) de elastómero de bloques que contienen con un cubreobjetos de vidrio 25. A continuación, se explica la preparación de V-SUVs tanto con lípidos y marcadores de contenido. Las secciones 4 y 5 proporcionan instrucciones para el montaje de las células de microfluidos, formando los SBLS in situ y la comprobación de defectos y la fluidez, la introducción de los Servicios VeterinariosUVS en las células de flujo y la detección de eventos de fusión. Sección 6 proporciona instrucciones para el análisis de datos.

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Protocolo

1. Preparación de un bloque de PDMS para formar el canal de microfluidos

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Figura 1. La microfabricación de la plantilla de celda de flujo y la preparación de bloques PDMS. (A) Diseño de una celda de flujo de cuatro canales que se ajusta sobre un cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm (parte inferior). Seis diseños idénticos están dispuestas para que quepan en una oblea de silicio de 10 cm (superior). (B) Cortar el bloque de PDMS espesor de aproximadamente 5-8 mm en una perforadora. (C) La inserción del tubo en el agujero perforado con un par de pinzas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Obtener una plantilla de celda de flujo como la de la Figura 1A. canales típicos son 0.3-1 mm de ancho, 70-100 m de altura, y 1-2 cm de largo. Fabricar una plantilla de nosotrosing técnicas estándar de fotolitografía en una sala limpia 25 o si el acceso para sala blanca no está disponible. Alternativamente, la máquina de una plantilla con las dimensiones más grandes de un material adecuado.
    Nota: El personal de sala limpia puede entrenar y guiar a los usuarios inexpertos (acceso a una instalación de salas blancas siempre está restringida a los usuarios con una formación adecuada) en el diseño y el orden de una máscara, la limpieza de la oblea, y la fotolitografía. Una vez que se obtiene una plantilla, que puede ser utilizado fuera de la sala limpia varias veces, siempre que se mantiene en un plato cerrado y se tiene cuidado de excluir polvo.
  2. Preparar una mezcla de ~ 100 ml PDMS (base de elastómero de silicona) y ~ 10 ml de agente de reticulación (agente de curado) en un vaso de plástico desechable. Rompa la punta de una pipeta desechable para manejar el PDMS viscosos con mayor facilidad. Pesar el PDMS en la taza plástica como pipeteo no es exacta.
  3. Se agita bien la mezcla. Retire las muchas burbujas de aire por desgasificación en un desecador de vacío (alrededor de 20min). A medida que la copa se coloca bajo vacío, las burbujas inicialmente crecer en tamaño, aumentando el volumen de la mezcla en gran medida. Controlar el vacío que se aplica y asegurarse de que la copa es lo suficientemente profundo para evitar un derrame.
  4. Vierta una gota grande de la mezcla de PDMS desgasificado en una placa de Petri de vidrio (150 mm x 20 mm) y presione la oblea en el PDMS con la plantilla hacia arriba. Esto evita las burbujas queden atrapados debajo de la oblea. burbujas atrapadas se expandirán y pueden inclinar la oblea cuando el plato se coloca en el horno. Ahora vierta PDMS desgasificados en la plantilla en la parte superior de la oblea hasta que está cubierto por aproximadamente 5-8 mm de PMDS. Si se produce una burbuja de aire retire suavemente con una punta de pipeta.
  5. Hornear los PMDS en un horno a 60 ° C durante 3 horas. Asegúrese de que el plato esté nivelada.
  6. Utilice una nueva hoja de bisturí para cortar un bloque de PDMS que contiene las estructuras de canales moldeados. El bloque de cortar necesita para que quepan en un cubreobjetos (véase el paso 4.1.9).
  7. Pelar el bloque cortado de la cápsula y plas sobre un pedazo de papel de aluminio limpio.
    Nota: Los PMDS bloques reticulados se pueden mantener durante unos meses. En una sola oblea, hay 6 conjuntos de canales de flujo (Figura 1A), por lo 6 PDMS bloques se pueden producir en un solo moldeo PDMS. Después de cortar todos los 6 de los bloques de PDMS, piezas sueltas limpias de PDMS, pero por lo demás no retire el PDMS restantes antes de verter y reticular el siguiente lote, lo que requerirá sólo la mitad de los PDMS utilizados para el primer lote. Una buena plantilla puede durar unos pocos años.
  8. Utilice una perforadora para perforar a través del bloque de PDMS en un movimiento recto (Figura 1B). Comience en el lado de las ranuras de canal. Asegúrese de retirar la pieza troquelada de PDMS. Repita este procedimiento para todos los ocho orificios del diseño de cuatro canales.
  9. Coloque el lado del canal de bloque PDMS abajo sobre un nuevo y sin arrugas trozo de papel de aluminio. Almacenar el bloque de hasta unos pocos meses en una caja seca, idealmente en un desecador.
  10. Empuje la tubería (0,25 mm ID, 0,76 mm OD) alrededor de un tercio en el agujero perforado usando un par de pinzas (Figura 1C). Corte el tubo inclinado para la inserción más fácil. Deja tubos de tiempo suficiente para alcanzar el depósito de SUV y la bomba de jeringa, respectivamente. Después de colocar el chip montado en el microscopio, cortar los tubos de nuevo si son demasiado largos.
  11. Para conectarse a las jeringas de la bomba, cortar un trozo de tubo de silicona más grande (0,51 mm de diámetro, 2,1 mm de diámetro exterior) e insertar el tubo de disolvente en un lado. Este bloque listo-a-uso de PDMS se puede mantener durante unos meses.

2. Limpieza Cubreobjetos

  1. Cubreobjetos limpias de acuerdo con el protocolo descrito en Karatekin y Rothman 25 utilizando una mezcla fuerte oxidante de ácido sulfúrico (H 2 SO 4) y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2). Realizar este procedimiento en una sala limpia, y observar las precauciones de seguridad apropiadas. Como alternativa, utilice una sala limpia limpiado coverslip que está disponible comercialmente (ver Lista de Materiales).

3. Preparación de las v-SUV que contienen tanto lípidos y etiquetas de contenido

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Figura 2. Esquema de la preparación de SUV. Los lípidos se mezclan en un tubo de vidrio (1) y el disolvente se evapora para formar una película lipídica mediante la rotación del tubo en un baño de agua (2). Que quedan trazas de disolvente se eliminaron bajo alto vacío (3). La película lipídica se hidrata en un tampón de reconstitución que contiene el detergente y la proteína mientras que se agita vorticialmente (4). Si el contenido de colorante se ha de encapsular, se incluye en este paso, así como en la etapa de dilución (5). La dilución de la concentración de detergente por debajo de su concentración micelar crítica conduce a la formación de liposomas. El detergente se dializa noche fuera de casa (6). Para t-SUV para la formación de SBL incluyendo NBD-PE (verde), las vesículas se hacen flotar en un gradiente de densidad y se recogen enla interfase entre dos capas (7a). Para separar las v-SUV con marcador contenido encapsulado del colorante libre la muestra se ejecuta sobre una columna de exclusión por tamaño y se recogió en fracciones de 0,5 ml (7b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparar 4 l de tampón de reconstitución, que contiene 25 mM HEPES-KOH, KCl 140 mM, 100 mM EGTA y DTT 1 mM, pH 7,4. Utilizar la mayor parte del tampón de diálisis y 100 ml para los otros pasos.
    Nota: Otros tampones pueden ser utilizados, pero es importante para mantener la osmolaridad tampón consistente en todo el experimento y elegir condiciones en las que las proteínas son funcionales. Para la preparación de las v-SUV que contienen sólo las etiquetas de lípidos y t-SUV, siga Karatekin y Rothman 25.
  2. Dado que las poblaciones de lípidos se almacenan a -20 ° C en cloroformo o cloroformo: metanol (2: 1, v / v), deje viales alcancen la temperatura ambiente antes de abrir paraevitar la condensación.
  3. Enjuague un tubo de vidrio con cloroformo para eliminar trazas de detergente y mezclar los lípidos en la relación deseada con una cantidad final de 1 mol de una mezcla de cloroformo y metanol (2: 1, v / v). Sólo use jeringas de vidrio / tubos de manejar disolventes / lípidos orgánicos disueltos.
    Nota: Los lípidos utilizados aquí son POPC: SAPE: DOPS: Colesterol: PEG2000-DOPE: hizo en una relación molar de 57,4: 15: 12: 10: 4,6: 1 para que contienen vesículas v-SNARE y POPC: SAPE: DOPS: Colesterol : PI cerebro (4,5) P2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54,9: 15: 12: 10: 3: 4,6: 0,5) para t-SNARE SUVs. Ver Material para más detalles. Otras composiciones lipídicas se pueden usar.
  4. Evaporar el disolvente bajo una corriente suave de nitrógeno, o en un evaporador rotatorio. Sumergir la punta del tubo en un baño de agua (37 ° C) se calienta por encima de la temperatura de fusión más elevado de los lípidos para producir una película de lípido homogénea y para evitar grandes cambios en la temperatura mientras se evapora el disolvente. Comience vacío a alrededor300 mbar hasta que se forma la película de lípido, y luego continúan por ~ 2 min a alta posible de vacío en el evaporador rotatorio.
  5. Retire el tubo de vidrio y se envuelve en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y eliminar las trazas restantes de disolvente colocando el tubo en un desecador a alto vacío durante al menos 2 horas. Este paso también se puede ejecutar durante la noche.
  6. Para rehidratar la película lipídica seca, preparar una mezcla de detergente (n-octil-β-D-glucopiranósido, OG), proteína (v-SNARE), y SRB en tampón de reconstitución (500 l de volumen final). Mantener la concentración de detergente final ~ 2 veces superior a la concentración micelar crítica (CMC, 20-25 mM durante OG) y ajustar el volumen final de tal manera que el detergente a la proporción de lípidos es> 10. Disolver sulforodamina B en polvo (SRB) en la solución de proteína-detergente para obtener una concentración final de SRB 10-50 mM agitando suavemente la solución. Ajustar la osmolaridad del tampón de reconstitución cuando se añade una alta concentración de SRB al reducir el concentration de cloruro de potasio en consecuencia.
    Nota: lípido-proteína-a (LP) para t-SNARE es alta (LP ~ 20.000, ~ 70 t-SNARE por metro micras 25.). Significativamente mayores densidades t-SNARE en el SBL pueden conducir a agregados de proteínas inactivas con redujo significativamente las tasas de fusión 17,24. LP para v-SNARE es mucho más bajo (LP ~ 200 ~ 7.000 v-SNARE por m 2), cerca de las densidades v-SNARE que se encuentran en las vesículas sinápticas 46,47. Para garantizar la función de la proteína después de la expresión recombinante y la purificación de la V y t-SNARE es útil para llevar a cabo un ensayo de fusión a granel sim 48 antes de pasar por todas las etapas del ensayo fusión de vesículas sola.
  7. Agitar suavemente el tubo de vidrio precalentada que contiene la película lipídica seca, mientras que la adición de la solución de proteína-detergente-SRB desde el paso 3.6. Trate de evitar la creación de burbujas. Continuarán sacudiendo durante 15 minutos a 37 ° C.
  8. Diluir el detergente cinco veces mediante la adición de reconstitucióntampón que contiene SRB (añadir 2 ml, 2,5 ml de volumen final de vórtex), mientras que rápidamente para evitar gradientes de concentración. Continuarán sacudiendo durante 15 minutos a 1 hora a 37 ° C.
    Nota: Longer eficacia de reconstitución de proteínas aumento de incubación. La dilución rápida disminuye la concentración de detergente por debajo de la CMC y conduce a la formación de pequeños liposomas.
  9. Se dializa la suspensión de vesículas primero contra ~ 1 L de tampón de reconstitución durante 1-2 horas a temperatura ambiente y luego contra 3 L de tampón de reconstitución durante la noche a 4 ° C con 4 g de adsorbente de poliestireno, usando un tubo de diálisis de MWCO de 20.000 o cassette. Utilizar diferentes vasos para la diálisis de vesículas con y sin SRB para evitar la contaminación cruzada.
  10. Equilibrar una columna de filtración de gel con tampón de reconstitución. Ejecutar la suspensión de vesículas a través de la columna para separar SRB libre de los v-SUV con SRB encapsulado. Utilice tampón de reconstitución sin SRB como eluyente una vez que toda la muestra tieneentrado en la columna. Recoger en V SUV en fracciones de 0,5 ml.
  11. Verificar éxito encapsulación SRB en concentraciones de auto-inactivó mediante la medición de la fluorescencia SRB antes y después de la adición de detergente a una alícuota de 16 vesículas. El uso de un espectrómetro de fluorescencia, excitar la muestra a 550 nm y escanear la emisión SRB entre 570 nm y 630 nm. Esperar un aumento en la fluorescencia pliegue 4-8 SRB dependiendo de la cantidad encapsulada después de la adición de detergente como la membrana se solubiliza y se diluye el SRB en libertad.
  12. Caracterizar la recuperación de lípidos y de proteínas utilizando la espectroscopia de fluorescencia 24 y electroforesis en gel de SDS-PAGE, respectivamente. Use un método de tinción sensible, especialmente para las muestras t-SUV alta LP (véase la Lista de Materiales). Normalmente alrededor del 50% de ambos de entrada de lípidos y proteína se pierde durante la preparación resultante en un LP cerca del valor nominal.
  13. Caracterizar tamaños SUV utilizando dispersión dinámica de la luz 24 o electrones microscopy 48. SRB tienda que contiene V-SUV a 4 ° C hasta ~ 3-4 días. No congele, como la congelación y descongelación se rompe la membrana y libera SRB encapsulado.

4. SUV-SBL Fusión Ensayo de Seguimiento de los lípidos de estreno Sólo

  1. La formación de la bicapa soportada tethered dentro de los canales de flujo de microfluidos
    1. Coloque el bloque PDMS (paso 1,11) a alto vacío durante al menos 20 min antes del experimento para eliminar gases disueltos. Esto reduce enormemente el riesgo de burbujas de aire en los canales de microfluidos durante el experimento de fusión.
    2. Activar la configuración de microscopio y se calienta la fase y soporte de muestra (Figuras 3 y 4) a la temperatura deseada.
    3. Filtrar el tampón de reconstitución usado para diluir las vesículas a través de un filtro con 0,45 micras o menor tamaño de poro.
    4. Diluir ~ 30 l de la NBD-PE etiquetados camisetas SUVs o sin proteínas (PF-SUV) liposomas de control (accionessolución de lípidos 0,5-1 mM) con ~ 60 l de tampón. La concentración final no es crítica aquí.
    5. Degas esta mezcla usando una jeringa de 3 ml. Presione a cabo la mayor parte del aire por encima de la muestra, mientras que manteniendo la jeringa vertical. Sellar la punta (sin aguja) utilizando una película de parafina y crear un vacío tirando hacia abajo el émbolo. Toca el cilindro de la jeringa para acelerar la desgasificación de la solución. Repita este proceso varias veces hasta que no se produzcan más burbujas cuando se aplica vacío.
    6. Use una aguja hipodérmica con un diámetro ligeramente más grande que el tubo que está conectado al bloque de PDMS para perforar un agujero en la tapa de un tubo de microcentrífuga. Asegúrese de que la pieza troquelada de plástico no está dentro del tubo, ya que podría obstruir el tubo conectado a la entrada del canal de microfluidos más tarde.
    7. Llenar la solución SUV desgasificado en el tubo de microcentrífuga que tiene un agujero en la tapa y colocarla en el soporte de la platina del microscopio que se equilibre a la temperatura establecida.
    8. place un cubreobjetos previamente lavado (sección 2) en un limpiador de plasma y ejecutar plasma de aire durante unos 5 minutos. Ponga el cubreobjetos tratada con plasma (cara tratada hacia arriba) en la parte superior de unos pocos tejidos sin pelusa que actúa como un cojín.
    9. Retire el papel de aluminio del bloque PDMS desgasificado y colocar el bloque en la parte superior del cubreobjetos. Cuando se reutilice el bloque PDMS poner y separar un trozo de cinta adhesiva a un lado del canal para limpiarlo. Presione hacia abajo el PDMS bloquear en el cubreobjetos usando un par de pinzas para que se pegue, pero no presione demasiado duro como el vidrio podría romperse.
    10. Coloque la celda de flujo montado sobre la platina del microscopio y conectar el tubo al depósito SUV y la bomba de jeringa, respectivamente. Tape el cubreobjetos a la etapa (Figura 3B).
    11. Iniciar la aspiración de SUVs a 3 l / min hasta que la solución llena los canales por completo (~ 2,25 mm / seg para la sección transversal del canal x 300 micras 75 micras). Cuando las soluciones para todos los canales empiezan a moverse hasta THe tubería en el lado de salida, reducir el flujo de 0.5 l / min y se incuba durante 30 a 45 min.
      Nota: El tiempo entre el plasma el tratamiento de la lámina de vidrio y fluyendo los SUVs en el canal no debe exceder de 10 a 20 min como el efecto del tratamiento de plasma es transitorio.
    12. Compruebe los canales para cualquier fuga. Utilice un objetivo de aire 10-20x para observar la fluorescencia de NBD-PE de la NBD-PE que contiene T o PF-SUV. Excite NBD fluoróforos usando el láser de 488 nm. Las fugas son difíciles de detectar usando iluminación de campo brillante.
    13. Poner un tubo con tampón de reconstitución desgasificado en el soporte y dejar que la temperatura se equilibre cambios tan rápidos en la temperatura podría causar defectos en el SBL. Detener el flujo y esperar ~ 1 min para asegurarse de que el flujo se ha detenido por completo y ninguna burbuja de aire será aspirado en el tubo antes de cambiar los tubos de entrada para el tampón desgasificado.
    14. Enjuague todos los canales con tampón desgasificado para lavar todo terrenos no consolidados.
    15. Cambiar a un higher objetivo ampliación TIRF (60X, aceite, NA 1,45 a 1,49) y verifique que la bicapa parece homogénea y está libre de cualquier defecto evidente a gran escala, tales como manchas oscuras o túbulos de lípidos que se extienden hacia fuera de la LPS.
  2. Comprobar la fluidez de la bicapa
    1. Si una unidad dedicada FRAP no está disponible, o si una secuencia FRAP no se puede programar, a continuación, cualitativamente fluidez de la membrana de prueba de la siguiente manera.
      1. Cierre el diafragma de campo a un tamaño pequeño (~ 40 m de diámetro) y ajustar la intensidad de la luz de excitación de 488 nm a través del software (20-80 mW, o 15-60 NW / m 2) para blanquear la fluorescencia NBD-PE en los expuestos área de manera significativa, pero no completamente. Para una bicapa de líquidos, en estado estacionario, la intensidad de fluorescencia en el medio de la zona expuesta debe ser más bajo que en los bordes, como moléculas de NBD-PE intactos entran en el área expuesta y difunden una cierta distancia antes del blanqueo. Por el contrario, si el adherido a la superficie SUV no pudo estallar, o por alguna otra razón la bicapa soportado no es fluida, todos los fluoróforos en el área expuesta debe blanquear.
        Nota: Los valores de intensidad de láser en este y posteriores pasos se dan como punto de partida en bruto y deben ser optimizados para un conjunto dado de condiciones.
      2. Detener la iluminación y empezar de nuevo unos minutos más tarde para verificar los resultados de las mediciones de estado estacionario
    2. Programar una secuencia FRAP para una medición más cuantitativa, si es posible. Ver archivos suplementarios y la leyenda correspondiente para más detalles.
      Nota: A veces, todo terrenos se adherirán en el cubreobjetos de vidrio, pero no pueden romperse y formar una bicapa fluida. Si esto ocurre, enjuague los canales con tampón de reconstitución que contiene desgasificado mM Mg 2 + 10 para ayudar a la formación de bicapa soportada. Utilice blanqueo de fluorescencia para evaluar la fluidez bicapa como en 4.2. Una vez que se forma una doble capa de líquido, enjuague con Mg 2 + libre recoNSTITUCIÓN tampón.
  3. La introducción de las v-SUV en los canales de flujo de microfluidos
    1. Degas tampón de reconstitución y lo utilizan para diluir la solución madre de v-SUV por un factor de aproximadamente 3 10-05 10 dependiendo de la concentración de la v-SUV. Objetivo para una dilución que resulta en alrededor de 10 a 100 eventos de fusión dentro de 60 seg en el campo de visión.
      Nota: Demasiados fusiones aumentan la fluorescencia de fondo (ya que cada evento depósitos LR-PE o DiD etiquetas de lípidos en el SBL) y hacen que la detección y el análisis de los eventos de fusión difícil. Por el contrario, una tasa de fusión que es demasiado bajos resultados en las estadísticas pobres o requiere la adquisición de muchas más películas. Para una concentración v-SUV de lípidos 0,1 mM, empezar por dilución de 5 l SUV de valores en tampón de reconstitución 995 l y luego se diluye 5-50 l de esto en 950-995 l de tampón de reconstitución.
    2. Deje que la temperatura se equilibre antes de detener el flujo y la inserting el tubo de entrada en la solución v-SUV diluida.
    3. Ajuste el ángulo TIRF y la polarización de la siguiente manera.
      1. Después de ajustar la polarización deseada girando el haz de excitación, ajustar la inclinación del espejo al mando de la posición del haz a través de un motor paso a paso a través del software. Mueva lentamente la posición del haz de láser desde el centro del objetivo en el plano focal de nuevo a un lado fuera del centro. Observe la luz del objetivo en el lado frontal emergen con un ángulo cada vez mayor con respecto al eje objetivo que la posición se desplaza más fuera del centro.
      2. Tenga en cuenta la posición del motor cuando el haz que sale desaparece primero en el objetivo, es decir, cuando se logra la primera TIR.
      3. Lentamente mantener en movimiento la posición del haz más fuera del centro mientras se monitoriza la fluorescencia de la superficie. Tenga en cuenta la posición del motor cuando la superficie de fluorescencia desaparece cuando el haz se ha movido demasiado lejos fuera del centro.
      4. Elegir un haz de positio n entre los dos límites determinado anteriormente. Para obtener la mejor relación señal-ruido y más mejora de la señal en la fusión, elegir una profundidad de penetración poco profunda (posición del haz más cerca del borde del objetivo) que todavía proporciona una iluminación uniforme de la viewfield.
        Nota: Es mejor es mantener la misma posición del haz TIR (la misma profundidad de penetración) para todos los experimentos después que los ajustes están optimizados. Asegúrese de que la rotación de la polarización no da lugar a cambios en la posición del haz.
    4. De flujo V-SUVs en el canal a una velocidad de flujo de 2 l / min, que corresponde a una velocidad de flujo lineal promedio de ~ 1,5 mm / seg para una sección transversal de 75 micras x 300 micras. Cambiar a la configuración de excitación / emisión para supervisar la mezcla de lípidos (LR o sólo lo hizo).
  4. La observación de la fusión entre individuales v-terrenos y el SBL

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Figura 3. La configuración experimental pTIRF. (A) Representación esquemática de un v-SUV y un t-SBL en un sustrato de vidrio. TIRFM imágenes en falso color de evento de fusión única SUV-SBL muestran acoplamiento de lípidos (1) y la liberación de colorante de lípidos en el SBL (2) seguido por el blanqueamiento y la disminución de la intensidad de fluorescencia (3). Se muestra la intensidad de fluorescencia total (suma de los valores de los píxeles en el cuadro 5.3 micras x 5,3 m) de la señal. (B) El cubreobjetos unido al bloque de PDMS se graba en el escenario climatizada. tubo de entrada para los canales de microfluidos tomen muestras de tubo en el soporte de la muestra de metal (derecha) aspirado por la bomba de jeringa (izquierda). Por debajo de la bomba es la unidad de emisión dual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Representación esquemática de la configuración experimental. La onda evanescente se crea en la interfaz de la memoria intermedia de vidrio en el canal microfluídico. El SBL se forma en el cristal y v-SUV se aspiran desde el soporte de la muestra de metal (parte superior derecha) a través del canal en la jeringa (parte superior izquierda). M, espejo; DM, espejo dicroico; L, la lente; F, filtro; P, polarizador. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Continuamente excitar la fluorescencia y supervisar v-SUV usando un 561 nm (para LR-PE) o 638 nm (para DID) de láser en función del fluoróforo incorporado en v-SUV. Como v-SUV llegan al canal de flujo y el muelle en y se fusionan con el SBL, la señal de fluorescencia de fondo empieza a acumularse.
  2. Ajustar la intensidad del láser de excitación a través del software para blanquear continuamente el fondofluorescencia de tal manera que al nuevos eventos de conexión y el estado de equilibrio de fusión puede ser fácilmente observado.
    Nota: Si blanqueo es demasiado lento, la fluorescencia de fondo será demasiado alta. Si blanqueo es demasiado rápido, las señales de los SUV atracados y de fluoróforos liberados en el SBL se desvanecen rápidamente, acortando la ventana durante la cual la fusión de los SUV atracados puede ser detectado o un fluoróforo puede ser rastreado. Para LR-PE excitado a 561 nm, 2.5 a 7.5 mW de potencia iluminando un círculo 190 micras de diámetro (100 a 250 nW / m 2) es un valor razonable para empezar. Por 638 nm de excitación de DiD, 0.8-1.6 mW de potencia sobre un círculo de 190 m de diámetro (30-60 NW / m 2) se puede utilizar para las pruebas iniciales.
  3. Adquirir varias películas en diferentes posiciones en un canal dado. Compruebe fluorescencia NBD-PE para verificar que la SBL no tiene defectos en estas posiciones. Adquirir películas de formato completo a la tasa máxima (~ 50 cuadros / seg) o una región recortada de interés a mayor velocidad de cuadro (hasta~ 100 Hz) durante 60 segundos.
  4. Mover a otro canal de microfluidos y repetir las grabaciones para otras condiciones. Incluir los controles negativos, tales como un SBL o SUVs libre de proteína, añadir el dominio citoplásmico soluble de la v-SNARE VAMP2 (CDV) como un inhibidor o tratar v-SUV con neurotoxina del tétanos (30 min a 37 ° C) en una o más de los canales en el mismo cubreobjetos.
  1. Limpiar y reciclar PDMS
    1. Con el fin de volver a utilizar el bloque de PDMS, enjuague los canales de microfluidos con ~ 200 l de etanol al 70% a un caudal de 5 l / min. Por último, aspirar aire a través de los tubos y canales.
    2. Separar los PDMS bloquean suavemente desde el cubreobjetos apretándolo ligeramente. Colocarlo en una hoja limpia de papel de aluminio. Almacenar en un desecador de vacío. Puede ser reutilizado varias veces.
    3. Para una limpieza más a fondo enjuagar los canales con una solución de hidróxido de detergente o de sodio antes de 70% de etanol. Alternativamente, quite todos los tubos lado a otro M El PDMS y sonicar el bloque durante 30 minutos en isopropanol, antes del secado y la inserción de un tubo nuevo.

5. SUV-SBL Fusión Ensayo de Seguimiento contenido en lípidos y de liberación simultáneamente

  1. Para el monitoreo de doble color de lípidos simultánea y contenidos solubles en libertad, sigue los mismos pasos que en el apartado 4, excepto liposomas uso rotuladas con tanto un lípido (DID) y un contenido de solubles (SRB) etiqueta, tal como se explica en la sección 3. SRB está encapsulado a 10 mM y es inicialmente muy auto-apagará.
  2. El uso de la configuración mostrada esquemáticamente en la Figura 4, excitar SRB y DiD fluorescencia simultáneamente usando 561 nm y 638 nm láser, respectivamente. Un espejo dicroico (640 nm) se divide la emisión en dos haces que se ejecutan a través de un corto (595/50 nm) y un filtro (700/75 nm) de longitud de onda larga para detectar la SRB y DiD emisiones, respectivamente. Los dos haces de emisión se proyectan de lado a lado en el chip EM-CCD.
"> 6. Análisis de Datos jove_title

  1. Análisis de los datos FRAP
    1. Utilice el programa MATLAB proporcionado en la información complementaria para estimar el coeficiente de difusión de lípidos, D. El programa lee una lista de archivos OME-TIFF 49, detecta el área de blanqueado, representa los valores medios de píxel en el área de blanqueado como una función del tiempo, y se ajusta a la curva de recuperación resultante a un modelo por Soumpasis 50 para extraer el tiempo de recuperación, figure-protocol-3 , Donde w es el radio del círculo blanqueada.
      Nota: Se proporcionó un programa MATLAB anterior 25 para el análisis de las películas FRAP utilizando archivos Nikon ND2. El actual programa lee los archivos TIFF OME-49, porque la mayoría de los formatos de archivo pueden ser fácilmente convertidos en OME-TIFF. Un análisis cuantitativo de los datos FRAP es más fácil y más precisa cuando se blanquea es instantánea, el bleacHED región es un círculo, y la decoloración durante la lectura de salida es insignificante. Aunque estos criterios no se cumplen estrictamente en las FRAP mediciones simples descritos aquí, se puede obtener una estimación razonable del coeficiente de difusión. Para una estimación más precisa, utilizar el seguimiento de los tintes de lípidos simples (sección 6.3).
  2. Análisis de la tasa de acoplamiento, la tasa de fusión y los tiempos de retardo-docking-a la fusión
    1. ImageJ utilizar para abrir una película para analizar y ajustar el brillo y el contraste para identificar claramente acoplamiento de vesículas y eventos de fusión. Iniciar el plugin SpeckleTrackerJ 26. Véase Smith et al. 26 y en línea documentación para SpeckleTrackerJ para obtener instrucciones para su uso.
    2. Identificar todos los SUV de nueva atracados en SpeckleTrackerJ. Para distinguir los SUV que se acoplan fuertemente de las que rebotan en el SBL, imponer una duración de conexión mínima de unos cuantos fotogramas. Guardar las pistas, y repetir para todas las películas.
      Nota: Para el doctasa de rey, lo único que importa es identificar cuando un SUV acoplado, por lo que sólo el primer fotograma en el que los SUVs atracado tiene que ser registrado en estas pistas. El resto de las pistas no se tendrá en cuenta en el análisis. Sin embargo, auto-seguimiento de cada SUV hasta que se blanquea o fusibles ayuda SUV marca que ya han sido realizados.
    3. Identificar todas las vesículas se fusionan. Para estos, las pistas deben incluir todos los fotogramas de la primera trama de un SUV acoplado hasta que la primera trama en la que la fusión es evidente por un aumento súbito en la fluorescencia del punto de seguimiento. La duración de estas pistas se utilizan para calcular los retrasos-docking-a fusión. Guardar todas las pistas. Repita este procedimiento para todas las películas.
    4. Para el análisis de los datos de conexión por lotes o de fusión, compilar una lista de los archivos de la trayectoria de las películas relevantes y ejecutar los programas de MATLAB provistos de Karatekin y Rothman 25. Siga las instrucciones que se proporcionan junto con los programas.
      Nota: Los programas de trazar el semeneventos de conexión y de fusión ulative como una función del tiempo, en base a información extraída de los archivos de trayectoria. las tasas de atraque y de fusión se estiman a partir de las pendientes de estas parcelas. Para los datos de fusión, los retrasos-docking-a de fusión también se calculan y su distribución representan como un gráfico de supervivencia, es decir, la probabilidad de que la fusión todavía no se ha producido por un retardo dado después de acoplamiento.
  3. difusividad de lípidos
    1. Para cada evento de fusión, realizar un seguimiento de los lípidos fluorescentes individuales a medida que se discernible cuando se han difundido suficientemente lejos del sitio de fusión (Figura 6). Utilice SpeckleTrackerJ para el seguimiento, y guardar las pistas para su posterior análisis utilizando MATLAB. Dependiendo del tamaño de la vesícula de fusión, típicamente 3-30 fluoróforos individuales pueden ser rastreados. Debido a que las pistas más largas son deseables para el cálculo de figure-protocol-4 , Trata de realizar un seguimiento de las moléculas individuales como a largocomo sea posible, utilizando la corrección manual de las trayectorias si es necesario.
    2. Calcular el cuadrado medio del desplazamiento (MSD) para el marcador trayectorias individuales de lípidos que duran> 40-50 marcos (alrededor de ~ 1,5 seg). Utilice el MSD para calcular el coeficiente de difusión de los lípidos, figure-protocol-5 . Ver Smith et al. 26 y Stratton et al. 27 para más detalles.
  4. Intensidad colorante único de lípidos, el factor de reducción de la intensidad de SUV-SBL, y el tamaño de las vesículas
    1. Medir la suma de valores de píxel de un marcador de lípidos en un píxel 3 x 3 en la zona (0,8 m x 0,8 m) alrededor del marcador de ~ 15 cuadros antes y después de los blanqueadores de marcadores en un solo paso. Restar la intensidad de fondo promedio de más de los marcos de post-blanqueador, de la intensidad pre-blanqueador promedio antes del blanqueo para obtener la intensidad del marcador de lípidos de seguimiento. Repita la medición para tantos marcadores como práctico para un dado película.
    2. Trazar la distribución de intensidades de etiqueta única de lípidos, figure-protocol-6 Y adaptarse a una gaussiana para estimar la media.
    3. Calcular el retardo entre cuando se produjo la fusión y cuando la trayectoria de un solo marcador de lípidos lanzado en ese evento terminó en un blanqueo de un solo paso. Obtener el tiempo de blanqueo para un fluoróforo en el SBL, figure-protocol-7 , Representando la función de supervivencia de los retrasos y la instalación de una exponencial.
      Nota: Debido a que las parejas polarizadas de campo de excitación más débilmente a los fluoróforos en un SUV, el tiempo de blanqueo de un SUV es por lo general mucho más lento 27.
    4. Estimar figure-protocol-8 , El factor de reducción de intensidad para un colorante de lípidos cuando en el SUV con respecto a cuando está en la SBL, siguiendo Stratton 27 (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> figure-protocol-9 es la intensidad de un solo tinte en el SUV).
      Nota: Si blanqueo eran insignificantes, figure-protocol-10 sería igual a la intensidad atracado figure-protocol-11 (punto (1) en la Figura 3A, panel derecho), dividido por la intensidad total alcanzado después de que todos los fluoróforos se depositan en la LPS sobre la fusión (línea discontinua etiquetado figure-protocol-12 en la Figura 3). Sin embargo, debido a la rápida de blanqueo en la SBL, figure-protocol-13 normalmente no se alcanza y una estimación precisa de figure-protocol-14 Requiere instalación la cinética de liberación a una expresión que incluye 27 udes tanto figure-protocol-15 (Véase 6.4.3) y figure-protocol-16 . Expresiones separados se proporcionan en Stratton et al 27 para los casos de la cinética de poros limitado y de liberación limitada de difusión.; el mejor de los casos en forma varía de un evento a otro (ver 6.5.1 para el caso de la cinética de poros limitada).
    5. Calcular el área de la vesícula para los eventos individuales de 27 figure-protocol-17 , dónde figure-protocol-18 es la intensidad SUV atracado, figure-protocol-19 es la intensidad de un solo colorante de lípidos significa en el SBL, figure-protocol-20 es el factor de reducción de la intensidad de un colorante de los lípidos cuando se encuentra en la SUV con respecto a cuando está en la SBL, yación 1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> es la densidad de área conocida de colorantes de lípidos.
  5. Propiedades de fusión de poro
    1. Suponiendo que la liberación es de poros limitado, cabe la cinética de liberación etiqueta de lípidos al 27 figure-protocol-21 , dónde figure-protocol-22 es la intensidad SUV atracado justo antes de la fusión y los otros parámetros son como se definen anteriormente. Utilice el valor de figure-protocol-23 obtenido en el punto 6.4.3 como un parámetro fijo, y extraer las mejores estimaciones aptos para la figure-protocol-24 y figure-protocol-25 .
    2. Estimar la fracción de tiempo que el poro está abierto, P 0, suponiendo que el retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo 27:60; figure-protocol-26 = figure-protocol-27 , Donde una ves es el área de la vesícula (sección 6.4.5), b es la altura de los poros (por lo general llevado a ser ~ 15 nm), r p ≈ 3 nm es el radio de poro efectivo como se ve por las etiquetas de lípidos que se difunden e incluye la mitad el espesor de dos capas (~ 2 nm), figure-protocol-28 es la difusividad de lípidos (calculado en 6.3), y figure-protocol-29 es el momento de que los lípidos para ser liberados de la camioneta en el SBL (desde 6.5.1).
    3. Para confirmar que un P nominal 0> 1 indica un poro completamente abierta, P 0 = 1, se ajusta a la evolución en el tiempo la intensidad a la ecuación 4 de Stratton et al. 27, la cinética predicho para un poro permanentemente abierta. Este ajuste debe ser mejor que fitting en la expresión 6.5.1 para un poro abierto permanentemente.

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Resultados

Calidad SBL

Es crucial para verificar la calidad y fluidez de la SBL antes del experimento de fusión. La fluorescencia en el lado inferior, de vidrio de un canal microfluídico debe ser uniforme, sin defectos evidentes. Si una burbuja de aire pasa a través del canal, se suele dejar cicatrices visibles en el SBL. Si hay tan grandes cicatrices escala / defectos, no use ese canal. A veces los SUV puede adherirse a...

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Discusión

La implementación exitosa del ensayo de fusión SUV-SBL descrito aquí depende críticamente de varios pasos clave, tales como la reconstitución funcional de las proteínas en liposomas, obteniendo SBLS de buena calidad, y la elección de los parámetros de imagen adecuados para detectar moléculas individuales. Aunque puede tomar algún tiempo y esfuerzo para tener éxito, una vez que el ensayo se lleva a cabo con éxito, proporciona una gran cantidad de información sobre el proceso de fusión no disponible en cualquier otro ensa...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) por el diseño y construcción del microscopio polarizado TIRF, a David Baddeley (Universidad de Yale) por su ayuda con la instrumentación de detección de dos colores, y a James E. Rothman (Universidad de Yale) y Ben O'Shaughnessy (Universidad de Columbia) y a los miembros de sus grupos por estimular las discusiones. EK cuenta con el apoyo de un premio Kavli Neuroscience Scholar Award de la Fundación Kavli y la subvención 1R01GM108954 de los NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
Milli-Q (MQ)agua Millipore
KOHJ.T. Baker3040-05
Etanol 190 ProofDecon
IsopropanolFisher ChemicalA416P4
HEPESAmericanBioAB00892
Cloruro de Sodio (KCl)AmericanBioAB01915
DithiothreitolAmericanBioAB00490
N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES)AmericanBioAB00892
EGTAAcros Organics409911000
Buffers
Tampón HEPES-KOH (pH 7,4)25 mM HEPES-KOH, 140  mM KCl, 100  μ M EGTA, 1  mM DTT
fuertes
nbsp;J.T. Baker9180-01en frasco de vidrio, PRECAUCIÓN, use EPI
MetanolJ.T. Baker9070-03en frasco de vidrio, PRECAUCIÓN, use PPE
Preparación de liposomas
Hermético al gas Jeringa HamiltonHamilton var. tamañossolo use aringa de vidrio con solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)
Tubos de vidrio Pyrex Vista 11 ml, tapón de rosca de 16x100 mm tubo de cultivoPyrex 70825-16limpiar a fondo, enjuagar con cloroformo
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 16:0-18:1 PC (POPC)Los lípidos polares Avanti850457Los lípidos vienen disueltos en CHCl3 o como polvo liofilizado en viales sellados. Alícuota en la apertura. Almacene el excedente en forma de películas lipídicas secas en atmósfera inerte a -20 °C. Mantenga las existencias en CHCl3/MeOH (2:1, v/v) a -20 °C. deje llegar a RT antes
de abrir 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sodio), 18:1 PS (DOPS)Avanti Polar Lipids840035igual que el anterior.
1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 18:0-20:4 PE (SAPE)Avanti Polar Lipids850804igual que el anterior.
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, cerdo) (sal de amonio), PI (4,5)P2Avanti Lípidos polares840046igual que los anteriores.
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio), 18:1 NBD PEAvanti Lípidos polares810145igual que el anterior.
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio), 18:1 PEG2000 PEAvanti Polar Lipids880130Igual que el anterior.
colesterol (lana ovina, >98%)Avanti Polar Lipids700000Igual que el anterior.
Aceite DiD'; Aceite DiIC18(5) (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina Perclorato)Sondas molecularesD-307
Rotavapor R-210BuchiR-210baño de calor por encima de Tm de lípidos usados
OG n-Octyl-β-D-GlucopiranosideAffymetrix0311tienda a -20 ° C, vamos a RT antes de abrir
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