Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

Summary

Este protocolo describe el uso de tres métodos diferentes para analizar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama. Esto incluye el uso del recuento de células convencional, la viabilidad de las células basada en la luminiscencia y el recuento de células mediante el uso de un generador de imágenes de células. Cada uno de ellos ofrece ventajas para la medición reproducible de la proliferación celular.

Abstract

La medición de la proliferación celular se puede realizar mediante varios métodos diferentes, cada uno con diferentes niveles de sensibilidad, reproducibilidad y compatibilidad con el formateo de alto rendimiento. Este protocolo describe el uso de tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro, incluida la cámara de recuento de hemocitómetro convencional, un ensayo basado en luminiscencia que utiliza el cambio en la actividad metabólica de las células viables como medida del número relativo de células, y un generador de imágenes celulares multimodo que mide el número de células utilizando un algoritmo de conteo. Cada método presenta sus propias ventajas y desventajas para la medición de la proliferación celular, incluyendo el tiempo, el costo y la compatibilidad de alto rendimiento. Este protocolo demuestra que cada método podía medir con precisión la proliferación celular a lo largo del tiempo, y era sensible para detectar el crecimiento a diferentes densidades celulares. Además, la medición de la proliferación celular mediante un generador de imágenes celulares pudo proporcionar más información, como la morfología y la confluencia, y permitió un seguimiento continuo de la proliferación celular a lo largo del tiempo. En conclusión, cada método es capaz de medir la proliferación celular, pero el método elegido depende del usuario.

Introduction

El gen supresor de tumor, p53, es un regulador esencial de una serie de procesos celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis y senescencia ^1. Es responsable de mantener la estabilidad genómica, y por lo tanto es crucial para mantener el equilibrio de la muerte celular y el crecimiento celular. Las mutaciones en p53 son comunes en el cáncer y son la causa principal de la inactivación de p53 conduce a la proliferación de células de cáncer no controlado ^2. Curiosamente, las mutaciones en p53 sólo representan aproximadamente el 25% de los cánceres de mama ^3, lo que sugiere que otros mecanismos son responsables de la....

Protocol

1. Las células que se preparan para Ensayos de proliferación

Nota: Preparar las dos líneas celulares en la misma forma y semilla en el mismo formato para a analizar cada método.

1. Crecer MCF-7-Lego y MCF-7-Δ40p53 ⁷ células a 75-80% de confluencia en T 75 cm ² frascos de cultivo de tejidos usando fenol libre de rojo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) , 200 mM L-glutamina, 2 mg de insulina / ml y 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% de CO _2. Manejar las células en una cabina de bioseguridad de clase II estéril.
   Nota: La cantidad de tiempo ....

Results

Para estudiar diferentes métodos de medición de la proliferación de las células cultivadas, la proliferación celular de las células MCF-7-Δ40p53 células transducidas se comparó con la línea celular de cáncer de mama MCF-LEGO-7 no transducidas. Los tres métodos que se compararon - la formación de imágenes método hemocitómetro convencional, ensayo de luminiscencia viabilidad de las células, y las células análisis- se describen en el diagrama esquemático (Figura 1). Cada mé.......

Discussion

En este protocolo se examinaron tres métodos diferentes de medir la proliferación celular en células cultivadas. Cada método era capaz de mediciones reproducibles y precisos de la proliferación celular en 96 horas, y los resultados fueron comparables entre cada uno de los métodos de prueba (Figura 2 y 3). Tanto el ensayo basado en luminiscencia y el método de formación de imágenes de células producen los resultados más robustos, mostrando aumentos lineales en la proliferación celular después de 96 hr

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, sin rojo fenol	ThermoFisher Scientific	21063-045	Suplementado con 10% FBS, 200 mM L-glutamina, 2 & g/ml de insulina y 1 µ g/ml puromicina
L-glutamina solución (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Solución de insulina humana	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Suero fetal bovino (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Clorhidrato de puromicina	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
Solución de tripsina-EDTA al 0,5% (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Diluir a 2x en DPBS
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Matraz de cultivo de tejidos, 75 cm2 superficie de crecimiento	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Contador de células	Merck Millipore		Contador de células automatizado
96 pocillos de placa multipocillo, fondo plano	Nunc	167008
Mejorado Hemocitómetro Neubauer	BOECO Alemania	BOE 01
Microscopio invertido Olympus IX51	Olympus	IX51
Ensayo CellTiter-Glo 2.0	Promega	G9242	Ensayo basado en luminiscencia
Citación Lector multimodo de imágenes de 3 células BioTek			Lector de placas para luminiscencia, fluorescencia y de imágenes celulares de campo claro
Gen5 software de análisis de datos	BioTek	GEN5