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Artículo de método

Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas

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DOI:

10.3791/54355

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6 de agosto de 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados ​​para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.

Resumen

Procede la selección tímica en un microambiente tímico único y altamente organizada que resulta en la generación de un repertorio de células T auto-tolerancia funcional. Modelos in vitro para estudiar el compromiso de linaje T y el desarrollo han proporcionado información valiosa sobre este proceso. Sin embargo, estos sistemas carecen del medio tímico tridimensional completa necesaria para el desarrollo de células T y, por lo tanto, son aproximaciones incompletas de la selección tímica in vivo. Algunos de los desafíos relacionados con el desarrollo de las células T de modelado se pueden superar mediante el uso de modelos in situ que proporcionan un microambiente tímico intacta que es totalmente compatible con la selección tímica de células T en desarrollo. Cultivos de cortes organotípicos del timo de complemento a las técnicas in situ. rebanadas del timo preservar la integridad de las regiones corticales y medulares del timo y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo de los timocitos superpuestas de una etapa de desarrollo definido o endógena de Tcells dentro de un microambiente tímico madura. Dada la capacidad de generar ~ 20 rebanadas por ratón, rebanadas tímicos presentan una ventaja única en términos de escalabilidad para los experimentos de alto rendimiento. Además, la relativa facilidad en la generación de las rebanadas del timo y el potencial para superponer diferentes subconjuntos del timo u otras poblaciones de células de diversos orígenes genéticos aumenta la versatilidad de este método. Aquí se describe un protocolo para la preparación de las rebanadas del timo, el aislamiento y la superposición de los timocitos, y la disociación de las rebanadas del timo para análisis de citometría de flujo. Este sistema también puede adaptarse para estudiar el desarrollo de las células T no convencional, así como visualizar la migración de timocitos, las interacciones de células de timocitos-estromal, y las señales de TCR asociados con la selección tímica por microscopía de dos fotones.

Introducción

Las células T se diferencian a través de una serie de intermedios de desarrollo en el timo durante el cual se encuentran con varios puntos de control que aseguran la generación de un repertorio de células T auto-tolerante funcional 1-3. La selección positiva promueve la supervivencia de los timocitos con receptores de células T (TCR) capaces de reconocer, con baja a moderada afinidad, péptido presentados por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células corticales tímicos epiteliales (CTEC) 2,3. La selección negativa y el desarrollo de células T reguladoras (Treg) contribuyen a la creación de auto-tolerancia a través de la eliminación o la desviación de los timocitos que responden fuertemente a la auto-péptido presentado por MHC de 2,4. Inmaduros CD4 + CD8 + doble positivo (DP) timocitos que expresan TCR que pasan el proceso de selección se diferencian en subpoblaciones de células T maduras, la mayoría de los cuales son MHC de clase I restringidos citotóxicos CD8 +o MHC de clase II restringido células CD4 + helper individuales positivos (SP) T, antes de salir del timo para realizar funciones efectoras en los órganos linfoides secundarios 1-3.

Además de la complejidad de desarrollo de las células T es la migración dinámica y encuentros celulares de desarrollo de los timocitos en toda la red de células estromales 5-9. Estas células estromales desempeñan papeles distintos en el desarrollo de los timocitos y se distribuyen diferencialmente entre las regiones corticales y medulares del timo, donde positiva y selección negativa ocurren 10. Aunque la selección positiva se lleva a cabo principalmente en la corteza, no hay pruebas de que los timocitos DP migran a la médula y siguen requiriendo señales TCR antes de que se diferencian en células T maduras que sugieren que la médula puede proporcionar señales adicionales necesarias para la finalización de la selección positiva y el linaje 11,12 diferenciación. Promover,a pesar de la presencia de células especializadas medulares del timo epiteliales (Mtec) que expresan los antígenos y restringido de tejidos presentes facilitan la eliminación de los timocitos autorreactivos 13,14, una gran proporción de la selección negativa se produce en la corteza en respuesta a la expresión ubicua de auto-péptido presentado por dendríticas células 15,16. Por lo tanto, modelos precisos de desarrollo de las células T deben proporcionar un microambiente tímico altamente organizada, con cortical intacta y las regiones medulares, que facilita la interacción entre timocitos y células del estroma, y ​​admite la migración de timocitos ya que estas células se someten a selección positiva y negativa.

Para complementar ex vivo análisis de los timocitos como medio de estudio de selección positiva y negativa, una serie de in vitro, in situ, y en modelos in vivo de desarrollo de las células T se han desarrollado 17-22. Ha sido muy difícil de recapitularLa selección positiva in vitro, pero de cocultivo de poblaciones de células madre o precursores de células T con las células del estroma que expresan ligando de Notch, en particular OP9-DL1 / 4 células, tiene la capacidad de soportar el compromiso de linaje T y la selección positiva limitada por lo que es un valor incalculable en el modelo in vitro para estudio de desarrollo de las células T 23-25. Las limitaciones de este sistema, sin embargo, incluyen el hecho de que estas células carecen de la maquinaria de procesamiento de péptido único que se encuentra en las células del estroma tímico y el microambiente tímico tridimensional.

Aunque técnicamente más engorroso, in situ y en modelos in vivo de la selección tímica puede superar algunas de las barreras relacionadas con los sistemas in vitro. Cultivos de órganos de timo Reaggregate (RTOC) contienen mezclas de timocitos y células del estroma tímico 18,26,27 definidos. Estos reaggregates de células epiteliales del timo mantienen clase I y II expresión de MHC y pueden soportar development de los dos subconjuntos de células T convencionales, sin embargo, todavía carecen de estructuras definidas cortical y medular. Fetal de cultivo de órganos del timo (FTOC) es un modelo popular de desarrollo de las células T que pueden ser sembró con timocitos a través de la cultura gota colgante de lóbulos tímicos lymphodepleted o por medio de inyección de timocitos en lymphoreplete lóbulos tímicos y apoyar el desarrollo eficiente de CD4 + y CD8 + T las células a través del tiempo en la cultura 18,28-31. Al inicio del cultivo de los lóbulos del timo fetales hay una escasez de mTECs, pero las estructuras corticales y medulares definidos puede desarrollar con el tiempo dependiendo de las condiciones. Una consideración importante es que este modelo puede apoyar preferentemente fetal frente el desarrollo de células T del adulto. Por último, la inyección intratímica de precursores tímicos definidos en ratones adultos es técnicamente difícil pero es evidente que proporciona un entorno para apoyar El desarrollo de células T in vivo. Estos in situ y en modelos in vivo son excelentes hero el desarrollo de células T de estudio y su uso debe considerarse con carácter experimental, por experimento.

Rebanadas del timo, sin embargo, han surgido recientemente como un modelo versátil, complementaria a estudiar la selección tímica in situ con la posibilidad de alojar única, compleja, y los experimentos de rendimiento general más elevados. Rebanadas del timo mantener la integridad de las regiones corticales y medulares y proporcionan un marco de células del estroma que soporta la migración de timocitos durante el desarrollo, así como la selección positiva y negativa eficiente 11,32-39. Subconjuntos de timocitos añadido encima de las rebanadas del timo migran en el tejido y a su nicho microambientales apropiado 34,37. Los timocitos superpuestos se pueden distinguir de células endógenas rebanada del timo a través de marcadores congenic o marcadores fluorescentes y se pueden mantener en cultivo durante varios días. culturas tímico rebanada organotípicos se pueden utilizar para estudiar diversos aspectosde desarrollo de células T, incluyendo la selección tímica, el comportamiento de timocitos (migración y las interacciones celulares), y la localización de timocitos, entre otros. Teniendo en cuenta la capacidad de generar ~ 20 rebanadas del timo por ratón, la escalabilidad de experimentos es generalmente mayor que la otra en modelos in situ de la selección tímica. Aunque la preparación de las rebanadas del timo requiere un equipo especializado, tal como el vibratome, y el tiempo de vida de las rebanadas del timo en cultivo se limita debido a la pérdida de células en el tiempo a través de la muerte celular y la falta de una membrana de encapsulación, rebanadas tímicos proporcionan un excelente modelo para el análisis de la selección tímica de las poblaciones sincronizadas de los timocitos dentro de un microambiente tímico maduro. Aquí se describe la preparación de las rebanadas del timo (inclusión de la cosecha el timo, la incrustación de agarosa de los lóbulos del timo y vibratome seccionamiento del tejido incrustado), el aislamiento y la superposición de los timocitos, y la disociación de las rebanadas del timo para análisis de citometría de flujo.

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Protocolo

Los protocolos para todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales en el Centre de recherche - Hospital Maisonneuve-Rosemont.

1. La recolección de timo de ratón para la preparación de suspensiones y tímicos Rebanadas sola célula

  1. La eutanasia del ratón con CO 2 seguido por dislocación cervical.
  2. En una campana de flujo laminar, el pin de la parte ventral del ratón hasta una tabla de disección. Pulverizar el ratón con un 70% de etanol. Eliminar cualquier exceso de alcohol frotando con una gasa para evitar etanol a partir de entrar en la cavidad torácica y dañar el tejido.
  3. Levante la piel en la base del esternón con un par de pinzas y haga un corte a través de la piel. Extender el corte de la piel hacia arriba para cada extremidad anterior.
  4. Hacer un recorte adicional en la base del esternón para separar el diafragma de la caja torácica. A continuación, corte cada lado de la caja torácica hacia la clavícula. Voltear la caja torácica hacia la cabeza sobre la exposición de la cavidad torácica. Los dos lóbulos delos timo se encuentran en la parte superior del corazón.
  5. Eliminar el tejido conectivo que rodea los lóbulos del timo utilizando pinzas, tijeras micro-disección, y / o tijeras curvas afiladas. Use un par de pinzas finas punta curvada para levantar los lóbulos individuales de debajo o por medio restante tejido conectivo.
    Nota: No agarre directamente el timo.
  6. Coloque los lóbulos tímicos en un tubo cónico de 15 ml que contiene PBS y dejar de lado en hielo hasta que se necesite.

2. Incorporación de agarosa y Vibratome rebanar de lóbulos tímicos

  1. Preparar la solución de agarosa al 4% para incrustar disolviendo 2 g de agarosa de bajo punto de fusión en 50 ml de PBS estéril y cocinar en el microondas a temperatura baja hasta que la agarosa se haya disuelto completamente. Tapar el matraz con papel de aluminio y colocar en un baño de agua a 55 ° C hasta que esté listo para su uso.
  2. En una campana de cultivo de tejidos, preparar completos medios RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), 4 mM L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina, y 10 mu M2-mercaptoetanol.
  3. Añadir 1,5 ml de medio RPMI-1640 completo por pocillo a una placa de cultivo de células de 6 pocillos y colocar un inserto de cultivo de células en cada pocillo. Ajuste el plato a un lado en una incubadora a 37 ° C hasta que se necesite.
  4. Preparar un baño de agua con hielo granizado con agua y hielo en un cubo de hielo.
  5. Retire cuidadosamente todos los restos de tejido conectivo que rodea cada lóbulo del timo con unas pinzas de punta fina. Para ello, mientras que el lóbulo del timo se sumerge en PBS en una placa de cultivo de tejido, después de la transferencia a un tejido trapo empapado con PBS, o bajo un microscopio de disección.
  6. Deje que la agarosa se enfríe por debajo de 40 ° C, cuando el frasco es caliente al tacto, para evitar el sobrecalentamiento del tejido. Verter el enfriado 4% de agarosa en un molde de tejido a una altura de ~ 1 cm.
  7. Use un par de pinzas para transferir cuidadosamente el lóbulo del timo a un tejido limpie y rodar suavemente para que se seque sin dañar el tejido. Asegúrese de que el tejido se seca por completo o se deslice fuera de la agarosa durante el rebanado.
  8. Introduzca con cuidado el lóbulo en la agarosa y la posición ya sea horizontal (para aumentar el área de superficie de cada rebanada) o verticalmente (para aumentar el número de rodajas) en la parte inferior del molde. Colocar el molde en agua helada durante 5 a 10 min para permitir que la agarosa solidifique.
  9. Durante este tiempo, preparar el vibratome para cortar en rodajas mediante el montaje de la bandeja de buffer, el montaje de la platina, y la inserción de la cuchilla de vibratome. Coloque un pedazo de cinta de laboratorio sobre la platina. Esterilizar el área de trabajo limpia, ensamblado con un 70% de etanol.
  10. Una vez que se solidifica la agarosa, invertir el molde y presione suavemente en su centro para liberar el lóbulo de agarosa incrustada.
  11. Utilice una cuchilla afilada para recortar el exceso de agarosa que rodea el lóbulo dejando ~ 2 mm de agarosa en cada lado y ~ 0,5 cm en la parte inferior.
  12. Asegure cada bloque de agarosa con una gota de pegamento de tejido para el trozo de cinta en la platina. Múltiples bloques se pueden pegar en la cinta.
  13. Alinear la hoja wi vibratometh la parte superior del bloque de agarosa. Llenar el baño tampón con PBS estéril hasta que el bloque (s) de la cuchilla y de agarosa se sumerge por completo.
  14. Sección del tejido de agarosa incorporado para obtener rodajas con un espesor de 400 a 500 micras. Ajuste el vibratome a 0.225 mm / seg de velocidad, frecuencia de 100 Hz y 5 ° de ángulo.
  15. Use una espátula se inclinó para recoger las rebanadas del timo en una placa de cultivo de tejido que contenía PBS estéril, ya que se cortan. Desechar la primera y la última rebanada.
  16. Examine las rebanadas con un microscopio óptico con un aumento de 4X. Elija las rebanadas con tejido tímico intacto y que rodea de agarosa (Figura 1A).
  17. Transferir las rebanadas a la placa preparada en el paso 2.3 mediante el uso de una punta de pipeta para deslizar suavemente la rebanada del timo de la espátula se inclinó sobre el inserto de cultivo celular. Cada inserto puede acomodar ~ 3 rebanadas. Asegúrese de que las lonchas no se toquen entre sí o con las paredes de inserción de cultivo de células.
  18. Mantener la placa a 37 ° C hasta que se necesite.
3. Preparación de los timocitos para superponer

  1. Aislar lóbulos tímicos como se describe en la sección 1. Disociar los lóbulos de forma manual para hacer una suspensión de células individuales usando una amoladora 15 ml de tejido esterilizado llena con 5 ml de PBS estéril que contiene 2% de SFB. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar las células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis 1x ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM de KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA) a temperatura ambiente durante 3 min para lisar las células rojas de la sangre.
  3. Llenar el tubo hasta 15 ml con PBS que contenía 2% de FBS. Centrifugar las células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Resuspender las células en 10 ml de PBS que contenía 2% de FBS y pasar las células a través de un filtro de malla de 255 micras.
  5. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar las células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C, y volver a suspender el sedimento celular en PBS que contenía 2% de FBS en una concentración de 1 x 10 7 células por ml.
  6. Marcar las células con tintes celulares, tales como éster carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) según los protocolos del fabricante si no está usando timocitos de ratones que expresan marcadores congénitas o reporteros fluorescentes genéticamente codificados de distinguir de las células endógenas rebanada.
  7. Después del lavado final de las células marcadas, resuspender el sedimento celular en medios completos RPMI-1640 a 1-3 x 10 6 células por 15 microlitros.

4. La superposición de timocitos en el tímico Rebanadas

  1. Utilizar una pipeta para aspirar cualquier líquido que rodea las rebanadas del timo en el inserto.
    Nota: Tenga cuidado de no dañar la agarosa. Si la agarosa se daña, los timocitos superpuestos no se adherirán a la superficie de la rebanada debido a la pérdida de la tensión superficial.
  2. Sin tocar el sector con la punta de la pipeta, superposición de 15 l de timocitos preparados en la sección 3 sobre cada rebanada del timo.
  3. Se incuban las plaTE a 37 ° C durante 2 horas para permitir que las células migren en las rodajas tímicas.
  4. Después de 2 horas, enjuague las rodajas tímicos 3 veces con 1 ml de PBS para eliminar el exceso de timocitos superpuestos que aún no han migrado en el tejido.
  5. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las rebanadas del timo están listas para ser cosechadas, típicamente 1-72 horas dependiendo del experimento.

5. La disociación de tímicos Rebanadas de Citometría de Flujo

  1. Preparar un tubo de microcentrífuga para cada rebanada por la adición de 150 l de PBS que contenía 2% de FBS.
  2. Añadir 1 ml de PBS que contenía 2% de FBS a la inserción de cultivo de tejido con las rebanadas del timo y se agita suavemente con una espátula doblado para separar las rodajas de la superficie del inserto de cultivo celular.
  3. La transferencia de la rebanada de la pieza de inserción al tubo de microcentrífuga con una espátula de doblado.
  4. interrumpir manualmente el segmento usando una mano de mortero de muestras de tubo de microcentrífuga. Añadir 150 ml de PBS que contenía 2% de FBS a un volumen final 300l.
  5. Filtrar el tejido disociado a través de un filtro de 40 micras en un nuevo tubo de microcentrífuga. Las células filtradas están listas para ser teñidas para el análisis de citometría de flujo 40.
  6. Filtro células una segunda vez antes de pasarlos en un citómetro de flujo para asegurarse de que toda la agarosa se retira y no obstruye el citómetro de flujo.
  7. Adquirir las células en un citómetro de flujo y análisis de datos como se ha descrito previamente 40.

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Resultados

Análisis de apoyo rebanadas del timo de los diferentes aspectos del desarrollo de las células T, tales como la selección positiva y negativa. Para los experimentos exitosos, la calidad de la rebanada del timo es de suma importancia. Por lo tanto, las rebanadas tímicos deben ser examinados para asegurar la integridad del tejido tímico y que la agarosa que rodea la rebanada del timo está intacta (Figura 1A). La tensión superficial puede verse comprometid...

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Discusión

Aquí se describe un protocolo para la preparación de las rebanadas del timo y los resultados representativos de selección positiva y negativa eficiente de pre-selección superpuesto MHC de clase timocitos transgénicos TCR restringido-I por citometría de flujo. Este sistema ha sido utilizado con éxito similar para apoyar la selección positiva de las células T CD4 + clase II restringidas por MHC de pre-selección timocitos DP 32, y, en presencia de antígeno de agonista, la selección negativa y el desar...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Marilaine Fournier por sus comentarios sobre el manuscrito y a Josée Tessier por su asistencia técnica. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1 #4175 se obtuvieron a través del Programa de Intercambio del NIAID, NIH. El apoyo para esta investigación es proporcionado por una subvención de la Fundación SickKids y CIHR-IHDCYN (NI15-002), una subvención de funcionamiento del CIHR-III (MOP-142254), y fondos de puesta en marcha de FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) y la Fundación Hôpital Maisonneuve-Rosemont para HJM. HJM es un becario junior 1 del FRQS, un Nuevo Investigador del CIHR (MSH-141967) y un ganador del premio de Transición de Carrera Temprana de la Fundación Cole.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
VibratomeLeica BiosystemsVT1000S 
NuSieve GTG AgarosaLonza50080Agarosa a baja temperatura de fusión
Molde de incrustación (truncado - T12)Policiencias1898622 mm x 22 mm cuadrado, truncado a 12 mm x 12 mm
Cuchillas de preparación de doble filoPersonna74-0002
Adhesivo para tejidos3M 1469SB
0.4 y micro; m Insertos de cultivo celular BD Falcon353090De varias marcas probadas, estas mantuvieron las celdas encima de las rodajas de la mejor
manera Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoThermoFisher21600-010
RPMI-1640 con L-glutaminaWisent350-000-CL
Suero fetal bovinoWisent080-110inactivada por calor
, 200 mMWisent609-065-EL
Penicilina/Estreptomicina, 100xWisent450-201-EL
2-MercaptoetanolAlfaAesar A15890
15 ml Tenbroeck Molinos de TejidosWheaton357426
Nylon Suministro de componentes de filtro de mallaU-CMN-255
Tubo de microcentrífuga Muestra de morteroBel-ArtF19922-0000
40 y micro; m Filtro de celdas de nailonBD Falcon352340
Pinzas Punta de acero inoxidableDumont RS-5047Pinzas curvas de punta fina, tamaño .17 x .10 mm
Micro PinzasDumont RS-5090 
L-glutamina

Referencias

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