Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas

Resumen

Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados ​​para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.

Resumen

Procede la selección tímica en un microambiente tímico único y altamente organizada que resulta en la generación de un repertorio de células T auto-tolerancia funcional. Modelos in vitro para estudiar el compromiso de linaje T y el desarrollo han proporcionado información valiosa sobre este proceso. Sin embargo, estos sistemas carecen del medio tímico tridimensional completa necesaria para el desarrollo de células T y, por lo tanto, son aproximaciones incompletas de la selección tímica in vivo. Algunos de los desafíos relacionados con el desarrollo de las células T de modelado se pueden superar mediante el uso de modelos in situ que proporcionan un microambiente tímico intacta que es totalmente compatible con la selección tímica de células T en desarrollo. Cultivos de cortes organotípicos del timo de complemento a las técnicas in situ. rebanadas del timo preservar la integridad de las regiones corticales y medulares del timo y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo de los timocitos superpuestas de una etapa de desarrollo definido o endógena de Tcells dentro de un microambiente tímico madura. Dada la capacidad de generar ~ 20 rebanadas por ratón, rebanadas tímicos presentan una ventaja única en términos de escalabilidad para los experimentos de alto rendimiento. Además, la relativa facilidad en la generación de las rebanadas del timo y el potencial para superponer diferentes subconjuntos del timo u otras poblaciones de células de diversos orígenes genéticos aumenta la versatilidad de este método. Aquí se describe un protocolo para la preparación de las rebanadas del timo, el aislamiento y la superposición de los timocitos, y la disociación de las rebanadas del timo para análisis de citometría de flujo. Este sistema también puede adaptarse para estudiar el desarrollo de las células T no convencional, así como visualizar la migración de timocitos, las interacciones de células de timocitos-estromal, y las señales de TCR asociados con la selección tímica por microscopía de dos fotones.

Introducción

Las células T se diferencian a través de una serie de intermedios de desarrollo en el timo durante el cual se encuentran con varios puntos de control que aseguran la generación de un repertorio de células T auto-tolerante funcional ^1-3. La selección positiva promueve la supervivencia de los timocitos con receptores de células T (TCR) capaces de reconocer, con baja a moderada afinidad, péptido presentados por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células corticales tímicos epiteliales (CTEC) ^2,3. La selección negativa y el desarrollo de células T reguladoras _(Treg) contribuyen a la creación de auto-tol....

Protocolo

Los protocolos para todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales en el Centre de recherche - Hospital Maisonneuve-Rosemont.

1. La recolección de timo de ratón para la preparación de suspensiones y tímicos Rebanadas sola célula

1. La eutanasia del ratón con CO ₂ seguido por dislocación cervical.
2. En una campana de flujo laminar, el pin de la parte ventral del ratón hasta una tabla de disección. Pulverizar el ratón con un 70% de etanol. Eliminar cualquier exceso de alcohol frotando con una gasa para evitar etanol a partir de entrar en la cavidad torácica y dañar el tejido.
3. Levante la....

Resultados

Análisis de apoyo rebanadas del timo de los diferentes aspectos del desarrollo de las células T, tales como la selección positiva y negativa. Para los experimentos exitosos, la calidad de la rebanada del timo es de suma importancia. Por lo tanto, las rebanadas tímicos deben ser examinados para asegurar la integridad del tejido tímico y que la agarosa que rodea la rebanada del timo está intacta (Figura 1A). La tensión superficial puede verse comprometid.......

Discusión

Aquí se describe un protocolo para la preparación de las rebanadas del timo y los resultados representativos de selección positiva y negativa eficiente de pre-selección superpuesto MHC de clase timocitos transgénicos TCR restringido-I por citometría de flujo. Este sistema ha sido utilizado con éxito similar para apoyar la selección positiva de las células T CD4 ⁺ clase II restringidas por MHC de pre-selección timocitos DP ^32, y, en presencia de antígeno de agonista, la selección negativa y el desar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarosa	Lonza	50080	Agarosa a baja temperatura de fusión
Molde de incrustación (truncado - T12)	Policiencias	18986	22 mm x 22 mm cuadrado, truncado a 12 mm x 12 mm
Cuchillas de preparación de doble filo	Personna	74-0002
Adhesivo para tejidos	3M	1469SB
0.4 y micro; m Insertos de cultivo celular	BD Falcon	353090	De varias marcas probadas, estas mantuvieron las celdas encima de las rodajas de la mejor
manera Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 con L-glutamina	Wisent	350-000-CL
Suero fetal bovino	Wisent	080-110	inactivada por calor
, 200 mM	Wisent	609-065-EL
Penicilina/Estreptomicina, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoetanol	Alfa	Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Molinos de Tejidos	Wheaton	357426
Nylon Suministro de componentes de filtro de malla		U-CMN-255
Tubo de microcentrífuga Muestra de mortero	Bel-Art	F19922-0000
40 y micro; m Filtro de celdas de nailon	BD Falcon	352340
Pinzas Punta de acero inoxidable	Dumont	RS-5047	Pinzas curvas de punta fina, tamaño .17 x .10 mm
Micro Pinzas	Dumont	RS-5090

L-glutamina