Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

Resumen

En organismos multicelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Los sistemas de cocultivo de insertos ofrecen una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por los factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula.

Resumen

El papel de los factores solubles secretados en la modificación de las respuestas celulares es un tema recurrente en el estudio de todos los tejidos y sistemas. En un intento de hacer sencillas las relaciones muy complejas entre los diversos subtipos celulares que componen los organismos multicelulares, se han desarrollado técnicas in vitro para ayudar a los investigadores a adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Una de estas técnicas utiliza insertos con una membrana permeable que permite que los factores solubles secretados se difundan. Por lo tanto, una población de células cultivadas en insertos puede ser co-cultivada en un pocillo o placa que contenga un tipo de célula diferente para evaluar los cambios celulares después de la señalización paracrina en ausencia de contacto célula-célula. Estos sistemas de cocultivo con insertos ofrecen varias ventajas sobre otras técnicas de cocultivo, a saber, la señalización bidireccional, la polaridad celular conservada y la detección de cambios celulares específicos de la población. Además de ser utilizados en el campo de la inflamación, el cáncer, la angiogénesis y la diferenciación, estos sistemas de cocultivo son de primordial importancia en el estudio de las intrincadas relaciones que existen entre los diferentes subtipos celulares presentes en el sistema nervioso central, particularmente en el contexto de la neuroinflamación. En este artículo se ofrecen pautas metodológicas generales para la realización de un experimento con el fin de evaluar los cambios celulares mediados por factores solubles secretados utilizando un sistema de cocultivo de insertos. Además, se detallará un protocolo específico para medir los efectos neuroinflamatorios de las citocinas secretadas por la microglía N9 activada por lipopolisacáridos en las células neuronales PC12, ofreciendo una comprensión concreta de la metodología de cocultivo de insertos.

Introducción

El estudio de los tejidos, órganos o sistemas in vitro es un intento de simplificar las muy complejas relaciones existentes entre los varios subtipos celulares que comprenden organismos multicelulares. De hecho, los estudios in vitro hacen posible adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Hay dos ventajas principales de la realización de los experimentos in vitro: 1) la reducción de las interacciones celulares, y 2) la capacidad de manipular fácilmente el entorno celular. Científicos Por lo tanto, estas dos ventajas han permitido a predecir el comportamiento de determinados tipos de cél....

Protocolo

Nota: Cada uno de los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar como se requiere para el cultivo de células de mamíferos. Además, las directrices generales para el cultivo celular estéril óptima se aplican, por ejemplo., Descartando consejos en cualquier momento que pueden dar lugar a la contaminación cruzada, lo que reduce la cantidad de células momento en que se expone al aire cuando se realizan cambios en los medios enteros, adecuadamente, pero con cuidado sin dejar de remover Las suspensiones de células para asegurar su pipeteo homogénea, etc. Por otra parte, las inserciones son un tipo de material de plás....

Resultados

El uso de sistemas de co-cultivo de inserción es particularmente pertinente en el estudio de los procesos neuroinflammatory que muestran las relaciones entre los diferentes actores paracrinos celulares del sistema nervioso central. Inmunidad en el SNC se logra principalmente por células residentes microgliales, que supervisan su entorno en su estado de reposo ramificada (Figura 2A) y son capaces de alteraciones de percepción que pudiera molestar al homeostasis muy valios.......

Discusión

El paso más crítico de cualquier sistema de inserción experimento de co-cultivo realidad habita en la elección de la inserción correcta de usar. El tamaño de poro y material de la membrana se deben tener en cuenta a fondo, sin olvidar a considerar el tipo de células que se sembraron y el propósito del experimento. Por ejemplo, los ensayos de quimiotácticas pueden utilizar el mismo tipo de membrana de células que co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI-1640 medio	Sigma	R8755	Cálido en 37 ° C baño de agua antes
de usar Dulbecco' s Águila Modificada' s Mezcla Medio/Nutriente F-12 Jamón	Sigma	D6421	Caliente en 37 ° C baño de agua antes de su uso, debe complementarse con 0,365 gm/L L-glutamina
Suero para caballos	ATCC	30-2040	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Suero fetal bovino	MultiCell	80350	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Factor de crecimiento nervioso-7S de la glándula submaxilar murina	Sigma	N0513	Reconstituya el polvo liofilizado en una solución salina tamponada o medio de cultivo de tejidos que contenga 0.1– 1,0% albúmina sérica bovina o 1-10% solución sérica
de tripsina-EDTA	Sigma	T3924	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar lipopolisacáridos de  Escherichia coli  055:B5	Sigma	L2880	Insertos
tóxicos de cultivo celular para uso con placas de 24 pocillos	BD Falcon	353095	0.4 μ m poros placas
de 24 pocillos	TrueLine	TR5002	Recubrimiento con colágeno antes de usar
		cultivo celular PC12	de rutina Medio de cultivo celular N9 de rutina
-            85% RPMI medio			-            90% DMEM-F12 medio
-            10% de suero			-            10% de suero de caballo inactivado por calor
-            Suero fetal bovino inactivado por calor al 5%
99% RPMI medio			-            99% DMEM-F12 medio
-              Suero fetal bovino inactivado por calor al 1			Suero fetal bovino inactivado por calor
al 1%-              50 ng/mL
PC12 medio
de tratamiento-              99% RPMI medio
-              1% de suero