Aquí se presenta un protocolo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para estudiar las alteraciones moleculares en Fos-expresión de conjuntos neuronales a partir de tejido cerebral en fresco y congelados. El uso de tejido congelado permite el aislamiento FACS de muchas áreas del cerebro a través de múltiples sesiones para maximizar el uso de sujetos animales valiosos.
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Artículo de método
La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata
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En este artículo
Resumen
Resumen
El estudio de la neuroplasticidad y alteraciones moleculares en los comportamientos aprendidos está cambiando a partir del estudio de las regiones de todo el cerebro para el estudio de un conjunto específico de neuronas activadas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales que median las asociaciones aprendidas. La fluorescencia de células activadas (FACS) ha sido recientemente optimizado para el tejido de cerebro de rata adulta y se permitió el aislamiento de las neuronas activadas usando anticuerpos contra el marcador neuronal NeuN y proteínas Fos, un marcador de neuronas fuertemente activados. Hasta ahora, las neuronas que expresan Fos y otros tipos de células fueron aisladas de tejido fresco, lo que supuso el proceso de días largos y permiten un número muy limitado de muestras de cerebro para ser evaluados después de procedimientos largos y complejos de comportamiento. Aquí encontramos que los rendimientos de las neuronas y ARNm de Fos estriado dorsal Fos-expresión fueron similares entre el tejido y el tejido diseccionado recién congelado a -80 ºC durante 3 - 21 días. Además, se confirmó el fenotipode las células clasificadas NeuN-positivos y NeuN-negativas mediante la evaluación de la expresión de genes de neuronal (NeuN), astrocitos (GFAP), oligodendrocíticos (oligo2) y marcadores microgial (Iba1), lo que indica que el tejido congelado también se puede utilizar para el aislamiento FACS de tipos de células gliales. En general, es posible recoger, analizar y congelar el tejido cerebral para las sesiones múltiples de FACS. Esto maximiza la cantidad de datos obtenidos a partir de sujetos animales valiosos que a menudo han sido sometidos a procedimientos largos y complejos de comportamiento.
Introducción
Durante el aprendizaje, los animales forman asociaciones entre conjuntos complejos de estímulos muy específicos. Esta información de alta resolución se cree que está codificada por alteraciones en los patrones específicos de neuronas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales. Conjuntos neuronales han sido recientemente identificado por la inducción de genes inmediatamente tempranos (IEGs) como Fos, Arco, y Zif268 y sus productos proteicos en las neuronas que se activan durante el fuerte comportamiento o exposición a estímulos. Las neuronas que expresan Fos, en particular, se ha demostrado que desempeñan un papel causal en el co....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio 16.
Nota: Todos los pasos siguientes utilizan tubos de centrífuga de bajo vinculante que se mantuvieron en hielo a menos que se especifique lo contrario.
1. Preparación Antes de Recogida de tejido
- Establecer la centrífuga a 4 ° C
- esmalte de fuego un conjunto de tres pipetas Pasteur de vidrio con diámetros decrecientes de aproximadamente 1,3, 0,8, y 0,4 mm para cad....
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Resultados
Clasificación de las neuronas Fos-positivos y negativos de Fos-tejido estriado dorsal frescos y congelados de ratas individuales después de las inyecciones de metanfetamina agudas.
El protocolo descrito anteriormente se utiliza para ordenar las neuronas Fos-positivos y Fos-negativos de una sola rata dorsal estriado 90 min después de una inyección intraperitoneal de metanfetamina (5 mg / kg). ingenuo ratas en sus jaulas se util.......
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Discusión
FACS se pueden utilizar para clasificar las neuronas y otros tipos de células de cualquiera de los tejidos del cerebro adulto fresca o congelada. Como se mencionó en la introducción, la capacidad de utilizar tejido congelado permite la utilización óptima de muestras de animales que han sido sometidos a procedimientos conductuales complejas y prolongadas, tales como estudios de autoadministración y la recaída en la adicción a la investigación. Estos procedimientos conductuales suele tardar 1 - 2 horas o más, y requieren .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del NIDA (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. fue apoyado por un nombramiento en el Programa de Participación en Investigación del NIDA patrocinado por los Institutos Nacionales de Salud y administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación, y recibió apoyo financiero adicional de una beca Becas-Chile administrada por CONICYT y la Universidad de los Andes, Santiago de Chile. Las instalaciones centrales de Johns Hopkins FACS contaron con el apoyo de la P30AR053503 de Premios del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel del Instituto Nacional d....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matriz cerebral | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | para obtener cortes coronales de cerebro |
| Hibernación A de baja fluorescencia | Brain Bits | HA-lf | Buffer A en el protocolo se utiliza para procesar tejidos y células desde la disociación hasta las etapas de fijación |
| Accutase | Millipore | SCR005 | en el protocolo se utiliza para la digestión enzimática de tejidos antes de la trituración |
| Protein LoBind Tube 1,5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | para evitar la pérdida de células durante el protocolo |
| Cell Strainer, 40 µ m | BD Falcon | 352340 | para filtrar la suspensión de la célula |
| Cell Strainer, 100 µ m | BD Falcon | 352360 | para filtrar la suspensión celular |
| Falcon 5 ml tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión de filtro | celular BD Bioscience | 352235 | para filtrar la suspensión celular antes de pasar por el citómetro de flujo |
| Pasteur Pipet, vidrio | Suministro NIH | 6640-00-782-6008 | para hacer trituración de tejidos |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, clon A60 (monoclonal de ratón) anticuerpo | EMD Millipore | FCMAB317PE | anticuerpo para detectar neuronas |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Tecnología de señalización celular | Anticuerpo 8677 | para detectar células que expresan Fos, |
| DAPI | Sigma | D8417 | para marcar núcleos |
| Kit de aislamiento de ARN PicoPure de | Applied Biosystems. | KIT0204 | El kit incluye el tampón de extracción de ARN para el paso 6.14. Se utiliza para recolectar células clasificadas |
| Superscript III sistema de síntesis de ADNc de primera cadena | Invitrogen | 18080-051 | para sintetizar ADNc a partir de ARN |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | hacer la preamplificación dirigida de cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Biosistemas Aplicados. | 4444963 | hacer PCR usando sondas TaqMan |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | Sonda TaqMan/cebadores |
| NeuN Sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Secuencia de nucleótidos | CACTCCAACAGCGTGAC |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | para marcador de genes neuronales |
| NeuN Imprimación inversa | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGTCCTTCTGA | para marcador de genes neuronales |
| Gfap Sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | Sonda TaqMan/cebadores para el marcador genético astrocityc |
| iba-1 Sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | Sonda TaqMan/cebadores para marcador de genes microglya |
| Gapdh Sonda TaqMan | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | para referencia/mantenimiento de genes |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | secuencia de nucleótidos para gen |
| Gapdh Reverse cebador | Applied Biosystems. | Secuencia de nucleótidos de | CACAGTCTGGGGCAGTGA |
| Oligo2 Sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | Sonda TaqMan/cebadores para marcador de genes oligodendrocitos |
| Pipeta P1000 | Rainin 17014382 | Se denomina pipeta con un gran diámetro de punta en los pasos 3.1 y 3.3 para la trituración suave de tejidos y en el paso 6.7 para la resuspensión de células | |
| 7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real | de Applied Biosystems. | 446985 | para PCR cuantitativa |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | para la clasificación FACS |
Referencias
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell ne....
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Reimpresiones y permisos
