Se necesitan técnicas fiables y eficientes para el aislamiento de las células inmunitarias renales para aplicaciones posteriores. Esto requiere el marcaje de anticuerpos de superficie de una pequeña cantidad de células inmunitarias renales. En este artículo, describimos un método conciso para el aislamiento de células inmunitarias renales que aparentemente logra este objetivo.
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Artículo de método
Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes
En este artículo
Resumen
Resumen
La activación del sistema inmunológico ocurre en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos. El sistema inmunitario consta de componentes adaptativos e innatos y de múltiples tipos de células. A veces, el tipo de célula de interés está presente en números muy bajos entre el gran número de células totales aisladas del riñón. Por lo tanto, el aislamiento confiable y eficiente de las poblaciones de células mononucleares renales es importante para estudiar los problemas inmunológicos asociados con las enfermedades renales. Tradicionalmente, el aislamiento tisular de las células mononucleares renales se ha realizado mediante digestiones enzimáticas utilizando diferentes variedades y concentraciones de colagenasas/ADNasas, lo que produce un número variable de células inmunitarias viables. Recientemente, con el desarrollo de los disruptores mecánicos de tejidos para el aislamiento de células individuales, se evita el paso de digestión de la colagenasa y se reemplaza por una simple interrupción mecánica de los riñones después de la extracción del ratón. Aquí, demostramos un método simple pero eficiente para el aislamiento de células mononucleares renales para las extracciones diarias de células inmunitarias. Además, demostramos un ejemplo de análisis de subconjuntos de células inmunitarias en el riñón. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar a otros tejidos blandos y no fibrosos como el hígado y el cerebro.
Introducción
Activación del sistema inmune se produce en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos 6,10,11,13. Las posibles áreas de investigación activa abarcan los diversos factores desencadenantes de la activación del sistema inmune, varios tipos de células implicadas, el patrón de citoquinas / quimioquinas en un entorno enfermedad en particular, la modulación de todos los procesos antes mencionados por un medicamento en particular etc. Para ejemplificar, en la isquemia-reperfusión lesión (un modelo para la lesión renal aguda), hay un aumento en las células inmunes o derivadas de médula ósea las células hematopoyéticas o células CD45 + en....
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Protocolo
Todos los pasos del protocolo realizadas fueron revisados y aprobados por la Universidad de Missouri Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC). Para este protocolo, se utilizaron ratones C57BL / 6 macho mayores de 15 semanas, aunque en teoría cualquier roedor a cualquier edad se puede utilizar para los experimentos. Puesto que, esta es una cirugía no la supervivencia, la eutanasia se consigue por desangrado y neumotórax bilateral.
1. La perfusión de los riñones
Nota: La perfusión de órganos tales como corazón, hígado y riñón elimina la sangre que pueden interferir con la interpretación de los datos. Por ....
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Resultados
El número de paneles que se pueden ejecutar depende del número de células inmunes que se pueden extraer de forma fiable de los riñones. En este documento, se demuestra la capacidad de ejecutar 2 paneles, uno para los linfocitos T y uno de los macrófagos / células dendríticas. En el panel de linfocitos T, lo primero que mira en la dispersión frontal (FSC) y patrón de dispersión lateral (SSC) y delinear la población de interés, como se muestra en la Figura 1 (diagrama de p.......
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Discusión
Hemos presentado aquí una metodología para obtener células inmunes desde el riñón de una manera fiable y eficiente. La principal modificación en la etapa de digestión de colagenasa ampliamente utilizado (disrupción mecánica de tejido) ahorra aproximadamente 30 min y el aislamiento de un gran número de células inmunes viables toma menos de dos horas para 4 muestras de riñón. Por otra parte, dependiendo de nuestra pregunta de investigación, que ahora sólo se utiliza un único riñón (el otro riñón se puede utilizar para el .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo está respaldado por una beca de investigación de Dialysis Clinics Inc. y de la beca de la Junta de Investigación de la Universidad de Missouri.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de laboratorio Stomacher 80 Biomaster | Seward | ||
| Stomacher 80 Bolsas clásicas | Seward | BA6040/STR | |
| Centrífuga Sorvall Legend XFR | Thermo Scientific | O equipo equivalente | |
| Hemocitómetro | Microscopía Electrónica Sciences | 63514-11 | |
| Citómetro de flujo analítico | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Tubos de polipropileno, sin tapa | Becton Dickinson | 352002 | |
| Tinción de viabilidad fijable BD | Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clon: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clon: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clon: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clon: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clon: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clon: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clon: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clon: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clon: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clon: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clon: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clon: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clon: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μ Filtro M | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubos 50 ml | Fisher | O equipo equivalente | |
| Tubos Fisherbrand 15 ml | Fisher | O equipo equivalente | |
| Sacarosa | Fisher chemical | S5-3 | |
| Pipeta de transferencia punta fina | Samco Scientific | 232 | O equipo equivalente |
| Solución tampón de tinción por citómetro de flujo | EBioscience | 00-4222-26 | O equipo equivalente |
| 1x Tampón de lisis RBC | EBioscience | 00-4333-57 | O equipo equivalente |
Referencias
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
