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Artículo de método

Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica

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DOI:

10.3791/54371

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20 de septiembre de 2016

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1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

En este artículo

Resumen

En este trabajo informamos sobre métodos sobre la manipulación genética molecular de la cepa Po1g de Yarrowia lipolytica para mejorar la eficiencia de la deleción de genes. Las cepas de Y. lipolytica modificadas resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.

Resumen

Yarrowia lipolytica es una especie de levadura no patógena, dimórficos y estrictamente aerobios. Debido a sus características fisiológicas distintivas y características metabólicas, esta levadura no convencional no sólo es un buen modelo para el estudio de la naturaleza fundamental de la diferenciación de hongos pero es también una plataforma microbiana prometedor para la producción bioquímica y diversas aplicaciones biotecnológicas, que requieren extensas manipulaciones genéticas. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de Y. lipolytica han sido limitados debido a la falta de un sistema de transformación genética eficiente y estable, así como tasas muy altas de recombinación no homóloga que se puede atribuir principalmente al gen KU70. Aquí, se presenta un protocolo de fácil y rápido para la transformación genética eficiente y para la deleción del gen de Y. lipolytica Po1g. En primer lugar, un protocolo para la transformación eficiente de ADN exógeno en Y. lipolytica Po1g se estableció. Second, para lograr la tasa de recombinación homóloga de doble cruce mejorado para una mayor eliminación de los genes diana, el gen KU70 se eliminó mediante la transformación de una casete de interrupción que lleva 1 brazos kb de homología. En tercer lugar, para demostrar la mayor eficiencia de la supresión de genes después de la supresión del gen KU70, hemos suprimido de forma individual 11 genes diana que codifican la alcohol deshidrogenasa y alcohol oxidasa utilizando los mismos procedimientos en la cepa plataforma nocaut KU70. Se observó que la tasa de recombinación homóloga precisa aumentó sustancialmente de menos de 0,5% para su eliminación del gen KU70 en Po1g al 33% -71% para la sola supresión de genes de los 11 genes diana en Po1g KU70 Δ. Un plásmido de replicación que lleva el marcador de resistencia a higromicina B y el sistema Cre / loxP se construyó, y el gen marcador de selección en las cepas de levadura knockout se eliminó finalmente mediante la expresión de la recombinasa Cre para facilitar múltiples rondas de TargeTED manipulaciones genéticas. Los mutantes de deleción de un solo gen resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.

Introducción

A diferencia de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, una levadura convencional, puede crecer en forma de levadura o micelio en respuesta a cambios en las condiciones del medio ambiente 1,2. Por lo tanto, esta levadura dimórfica se puede utilizar como un buen modelo para el estudio de la diferenciación de hongos, la morfogénesis y la 3,4,5 taxonomía. Generalmente se considera como una caja fuerte especies de levadura (GRAS), que se utiliza ampliamente para producir una variedad de aditivos de alimentos tales como ácidos orgánicos, polialcoholes, compuestos de aroma, emulsionantes y agentes tensioactivos 6,7,8,9. Es un aerobio obligado y una levadura oleaginosa conocido capaz de acumular naturalmente lípidos en altas cantidades, es decir, hasta el 70% del peso seco de células 10. También se puede utilizar un amplio espectro de fuentes de carbono para el crecimiento, incluyendo diferentes tipos de residuos en los recursos de los residuos como nutrientes 11,12,13. Todas estas características únicas hacen Y. lipolytica muy atractivo paradiversas aplicaciones biotecnológicas.

Aunque toda la secuencia del genoma de la Y. lipolytica ha sido publicada 14,15, la manipulación genética de esta levadura no convencional es más compleja que otras especies de levadura. En primer lugar, la transformación de esta especie de levadura es mucho menos eficiente debido a la ausencia de un sistema de 16,17 transformación genética estable y eficiente. En segundo lugar, la integración genómica laborioso de casetes de expresión lineales se utiliza comúnmente para la expresión de genes de interés ya que ningún sistema plásmido episomal natural se ha encontrado en esta levadura 18. En tercer lugar, la generación de genéticos knock-outs y knock-ins están limitados debido a que el gen de la eficiencia de la focalización mediante recombinación homóloga precisa en esta levadura es baja y la mayoría de los eventos de integración se produce a través de extremos no homólogos (NHEJ) 19.

En este estudio, se presenta un protocolo de transformación optimizada para la Y. lipolytica Po1g cepa, que es fácil, rápido, eficiente y reproducible. Para mejorar la frecuencia de recombinación homóloga precisa, hemos suprimido el gen KU70, que codifica una enzima clave en la vía NHEJ. Al utilizar el protocolo de transformación optimizada y la transformación de un casete nocaut lineal que contiene regiones de homología flanqueantes de 1 kb, el gen de la KU70 Y. lipolytica Po1g se ha eliminado correctamente. La robustez de esta metodología de supresión de genes se demostró posteriormente por la orientación de la alcohol deshidrogenasa y los genes de alcohol oxidasa en la cepa Po1g KU70 Δ. Se observó que la supresión cepa KU70 exhibió una considerablemente mayor eficiencia de la recombinación de genes mediada homóloga de orientación que la de la cepa de tipo salvaje Po1g. Además, un plásmido replicativo expresión Cre que lleva el marcador de resistencia a higromicina B fue construido para llevar a cabo rescate de marcador. El rescate de marcador facilita múltiples rondas de mutagénesis dirigida en THe obtuvo supresión de genes mutantes. Además de la supresión de genes, nuestro protocolo para la transformación genética y la deleción del gen descrito aquí se puede aplicar para insertar genes a loci específicos, y para introducir mutaciones específicas de sitio en el Y. lipolytica genoma.

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Protocolo

1. Generación de la Y. La cepa lipolytica KU70 Supresión

  1. Construcción de la casete de interrupción
    Nota: Véase la Tabla 1 para todos los cebadores utilizados en las amplificaciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
    1. Cebadores de diseño 20 para amplificar por PCR el casete de expresión LEU2 (véase la Tabla 1) a partir de una Y. vector de expresión lipolytica y introducir sitios LoxP en el 5 'y 3' de la casete LEU2 con un cebador hacia adelante largo (# 1, Tabla 1) y un cebador inverso de largo (# 2, Tabla 1), respectivamente. Para introducir un sitio de restricción adicional para las etapas posteriores del proceso de clonación, añadir un sitio de restricción BamHI en el cebador # 1.
    2. Realizar PCR utilizando un ADN polimerasa de alta fidelidad como se detalla en la Tabla 2.
    3. Se purifica el producto de PCR LoxP-promotor-LEU2-terminador-LoxP casete utilizando un Purificatio PCRn kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir voladizos 3'-A para el producto de PCR purificado de acuerdo con las instrucciones del fabricante 21. El uso de ADN ligasa de T4 para ligar el producto de PCR A-cola en un vector de clonación TA para dar el plásmido T-LEU2 según la Tabla 3.
    4. Amplificar por PCR el 1 kb 5 'secuencia arriba del gen KU70 usando los cebadores # 3 / # 4 de la Y. lipolytica Po1g ADN genómico 22 según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Doble digerir tanto el producto de PCR purificado y el plásmido T-LEU2 con enzimas Sac II y Bam HI según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Utilice ADN T4 ligasa para ligar el purificado y digerido producto de la PCR a la Sac II / sitios Bam HI de T-LEU2 para dar elplásmido T-LEU2-5E según la Tabla 3.
    5. Amplificar por PCR el 1 kb 3 'secuencia abajo del gen KU70 utilizando los cebadores # 5 / # 6 de la Y. lipolytica Po1g ADN genómico 22 según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Doble digerir tanto el producto purificado de PCR y el plásmido T-LEU2-5E con Not I y Nde I enzimas según la Tabla 4.
      1. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el digerido y purificado producto de PCR con el Not I / Nde I sitios de T-LEU2-5E para dar lugar al plásmido T-KO usando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
    6. Digerir el plásmido T-KO con Sac II y Nde I enzimas según la Tabla 4 para producir el módulo de fragmentación (Figura 1 ). Se purifica los fragmentos de ADN digerido usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante.
  2. Preparación de células competentes y la transformación de Y. cepa lipolytica Po1g
    1. preparación de células competentes
      1. Se inocula una colonia de Y. cepa lipolytica Po1g de una placa de levadura fresca extracto-peptona-dextrosa (YPD) en 10 ml de medio YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de dextrosa y 50 mM de tampón de citrato de pH 4,0) en un matraz de 100 ml. Incubar en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm durante 20 h hasta saturación (un OD 600 de aproximadamente 15, medido utilizando un espectrofotómetro).
      2. Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 5000 xg a temperatura ambiente. Se lavan las células con 20 ml de Tris-EDTA (TE) tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), y sedimentar las células como se describe en el paso 1.2.1.2. Resuspender las células en 1 ml de acetato de 0,1 M de litio (pH 6,0, ajustado con ácido acético), y se incuba durante 10 min a tempe habitaciónratura.
      3. Alícuota de las células competentes (100 mu l) en tubos de 1,5 ml estériles. Continúe con los pasos de transformación por debajo de inmediato, o añadir glicerol a una concentración final de 25% (v / v) y se almacena a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
    2. Transformación
      1. Mezclar suavemente 10 l de ADN desnaturalizado de esperma de salmón (10 mg / ml) y 1 a 5 g de la casete de interrupción purificada junto con 100 l de células competentes, y se incuba a 30 ° C durante 15 min.
      2. Añadir 700 l de glicol 40% de polietileno (PEG) -4000 (disuelto en 0,1 M de litio de acetato de pH 6,0), se mezcla bien y se incuba en un incubador con agitación a 30 ° C a 225 rpm durante 60 min.
        Nota: Es importante utilizar PEG con peso molecular medio de 4000, en lugar de PEG-3350 (utilizado normalmente en la transformación de la levadura convencional).
      3. Choque térmico de la mezcla de transformación colocando el tubo en un baño de agua a 39 ° durante 60 minutos.
      4. Añadir 1 ml de medio YPD yrecuperar durante 2 horas a 30 ° C y 225 rpm. Centrifugar a 9000 xg durante 1 min a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de tampón TE.
      5. Repellet las células por centrifugación a 9000 xg durante 1 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 100 l de tampón TE y la placa en placas selectivas (por ejemplo, placas de leucina deficientes), y se incuba a 30 ° C durante 2-3 días.
      6. Pick 4 a 10 colonias individuales y inocular por separado en 2 ml de medio YPD. Incubar toda la noche en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm. Identificar las colonias positivas por análisis de PCR de ADN genómico de los transformantes 22 según la Tabla 5 usando dos conjuntos de cebadores # 55 / # 56, y # 56 / # 57, respectivamente.
        Nota: El no me linealizado pYLEX1 vector se transforma en Y. lipolytica Po1g células competentes con el fin de determinar la eficiencia de transformación contando el númerode unidades formadoras de colonias (UFC) por g de ADN plásmido utilizado 23.

2. Marcador de rescate

  1. Construcción del plásmido de expresión Cre
    1. Construcción de pYLEX1-CRE y pYLEX1-HPH
      1. Cebadores de diseño 20 para amplificar por PCR los marcos de lectura abierta de la CRE y HPH. Añadir un nucleótido de adenina extra de aguas arriba de los codones de inicio en los cebadores hacia adelante # 82 y # 84, e insertar sitios de restricción Kpn I aguas abajo de los codones de terminación en los cebadores inversos # 83 y # 85. amplificar por PCR los marcos de lectura abierta de la CRE y HPH de pSH69 (número de acceso HQ412578) 24, como se indica en la Tabla 2.
      2. Purificar tanto cre y fragmentos HPH utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Recopilación tanto los fragmentos cre y HPH purificadas con Kpn I enzima según Table 4. doble digestión del plásmido con las enzimas pYLEX1 Pml I y Kpn I según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante.
      3. Utilice ADN ligasa de T4 según la Tabla 3 para ligar los fragmentos de CRE y HPH purificados y digeridos a sitios Pml I / Kpn I de la Y. vector de expresión lipolytica, produciendo pYLEX1-CRE y pYLEX1-HPH, respectivamente.
    2. Construcción de pSL16-CRE-HPH
      1. Amplificar por PCR el casete de promotor-gen-terminador de cre de pYLEX1-CRE utilizando los cebadores # 86 / # 87 que flanquean los sitios de restricción Sal I / Pst I según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
        1. Doble digerir tanto el producto de PCR purificado y pSL16-CEN1-1 (227) plásmido 25 con Sal I yPst I enzimas según la Tabla 4. Purificar la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el producto de PCR purificado y digerido en pSL16-CEN1-1 (227) en los sitios correspondientes para crear pSL16-CRE utilizando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
      2. Amplificar por PCR el casete de promotor-gen-terminador de hph de pYLEX1-HPH utilizando los cebadores # 88 / # 89 que flanquean los sitios de restricción Xho I / Bgl II según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
        1. Doble digerir tanto el producto purificado de PCR y el plásmido pSL16-CRE con las enzimas Xho I y Bgl II según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el producto de PCR purificado y digerido en pSL16-CRE en el correspondientesitios para generar pSL16-CRE-HPH utilizando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
          Nota: El plásmido de expresión Cre resultante, pSL16-CRE-HPH, alberga un marcador de higromicina B seleccionable y es un vector episomal centromérica y replicación (Figura 2).
      3. Verificar todas las construcciones de la digestión con enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo, Sal I / Pst I, para cortar el inserto del vector) según la Tabla 4.
  2. Cre recombinasa mediada por rescate de marcador
    1. Transformar pSL16-CRE-HPH en células competentes de la cepa knockout KU70 siguiendo el protocolo de transformación descrito en el apartado 1.2 anterior. células de la placa transformado Onto YPD más higromicina B (YPDH) placas (que contiene 400 mg / ml de higromicina B), y se incuba a 30 ° C durante 2-3 días.
    2. Llevar a cabo la PCR de colonias según la Tabla 5 utilizando los cebadores # 84 / # 85 para identificar positivolas colonias que contienen el plásmido pSL16-CRE-HPH después de la transformación.
      Nota: El cebador directo # 84 y el cebador inverso # 85 están situados dentro de la región codificante del gen HPH (Tabla 1). Sólo clones positivos generan un producto de PCR específico en la reacción de PCR.
    3. Elija un clon positivo e inocular en 2 ml de medio YPDH, e incubar en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm durante la noche a la saturación. Medir la OD de células 600 con un espectrofotómetro. Recoger las células a una densidad óptica de 600 ~ 15. Centrifugar a 5000 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y se lava una vez con 2 ml de agua estéril.
    4. Células Re-inocular en 2 ml de medio YPD con una DO inicial 600 de 0,1 y permiten a las células crecer en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm durante la noche. Pasar la noche a la mañana el cultivo de células en placas de YPD para aislar colonias individuales 23. Colonias de placa Replica Onto YPD, YPDH, y placas de leucina deficientes 23 .
      Nota: Las colonias que han perdido tanto el marcador LEU2 y pSL16-CRE-HPH plásmido sólo puede crecer en placas de YPD (Figura 3).

3. Supresión de la alcohol deshidrogenasa y alcohol oxidasa Genes

  1. Realizar una búsqueda en la Y. la base de datos del genoma lipolytica utilizando la herramienta de alineación de búsqueda local Básica (BLAST) para identificar los genes candidatos para su eliminación 26. Introduzca la secuencia de la proteína de S. alcohol deshidrogenasa cerevisiae I en la herramienta de búsqueda BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Nota: La herramienta de búsqueda BLAST devuelve las secuencias de proteínas más similares en el Y. la base de datos del genoma lipolytica.
  2. Construir los casetes de deleción por PCR con los cebadores # 7 al # 56 (Tabla 1), y llevar a cabo la digestión con enzimas de restricción y reacciones de ligación utilizando los mismos métodos que se describe en el apartado 1.1 anterior.
  3. Deberesson células competentes de la cepa knockout KU70, llevar a cabo transformaciones y llevar a cabo la PCR para identificar las colonias positivas con los cebadores # 55, # 58 y # 81 (Tabla 1), siguiendo el protocolo descrito en el apartado 1.2 anterior.
    Nota: Como ejemplo, el procedimiento para la deleción del gen YALI0E17787g se describe en las figuras 4 y 5. Se informaron los efectos de 1 kb y 2 kb región homóloga larga en la tasa de recombinación homóloga.

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Resultados

La Y. linealizado vector de expresión lipolytica se insertó en la plataforma de acoplamiento pBR en el genoma de Y. lipolytica Po1g cepa mediante la realización de una sola recombinación de cruce 27. Al utilizar el procedimiento de transformación química rápida establecido en este estudio, la Y. linealizado vector de expresión lipolytica se transformó con éxito en la cepa de tipo salvaje Po1g a una eficiencia de transformación de>...

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Discusión

Nuestro objetivo para este estudio es permitir la generación rápida y eficiente de los knockouts de genes dirigidos en el Y. lipolytica cepa Po1g. Varias consideraciones deben ser abordados para lograr esto. En primer lugar, se requiere una alta eficacia de transformación. Por lo tanto, un protocolo de transformación química eficiente y conveniente para el Y. cepa lipolytica Po1g se describió en este estudio. El uso de PEG-4000 es un factor crítico para la transformación exitosa de es...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero de la Agencia Nacional de Medio Ambiente de Singapur (ETRP 1.201.102), el Programa de Investigación Competitiva de la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (NRF-CRP5-2009-03), la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur ( 1324004108), Global I + D Programa de Proyectos, el Ministerio de Economía del conocimiento, la República de Corea (N0000677), la Agencia de Reducción de Amenazas a la Defensa (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) y la Iniciativa de la biología sintética de la Universidad Nacional de Singapur ( DPRT / 943/09/14).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte/material
oligonucleótidos integradosTecnologíasintegradas 25 nmoles de ADN oligos
Y. lipolytica cepa Po1gYeastern Biotechleucina auxotrófico derivado de la cepa de tipo salvaje W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica vector de expresión
E. coli TOP10InvitrogenPara la clonación y propagación de plásmidos
pGEM-T vector PromegaA3600TA vector de clonación
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Para el aislamiento de plásmidos
Wizard SV Gel y
sistema de limpieza de PCR		PromegaA9282Extraiga fragmentos de ADN de geles de agarosa
y purifique los productos de PCR de una reacción de amplificación
La ADN polimerasa de alta fidelidad
iProof Bio-Rad172-5302ADN polimerasa de alta fidelidad
BamHI New England BiolabsR0136SEnzima de restricción
BglII New England BiolabsR0144LEnzima de restricción
KpnINew England BiolabsR0142SEnzima de restricción
NdeI New England BiolabsR0111SEnzima de restricción
NotINew England BiolabsR0189LEnzima de restricción
PmlINew England BiolabsR0532SEnzima de restricción
PstI New England BiolabsR0140SEnzima de restricción
SacIINew England BiolabsR0157SEnzima de restricción
SalINew England BiolabsR0138SEnzima de restricción
XhoINew England BiolabsR0146LEnzima de restricción
T4 ADN ligasaNew England BiolabsM0202L
Taq ADN polimerasa& nbsp;Bio-RadM0267L
AmpicilinaGibco-Life Technologies11593-027Antibióticos
Higromicina BPAAP21-014Antibióticos
GeneRuler 1 kb escalera de ADNThermo ScientificSM03121 kb escalera de ADN
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Esperma de salmón ADNInvitrogen15-632-011
Acetato de litioSigma
Ácido acéticoSigma
Perlas de vidrio (425-600 y micro; m)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
Colorante de carga de ADNThermo ScientificR0611
Bacto Extracto de levaduraBD212750
Bacto PeptonaBD 211677
D-Glucosa1ª BaseBIO-1101
YNB sin aminoácidosSigmaY0626
DO Suplemento-LeuClontech630414
GlicerolSigmaG5516
Difco LB CaldoBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Equipo
Máquina de PCRBioradT100 Termociclador
Baño de aguaMemmertWNB 14
Incubadora estacionaria/agitadoraYihderLM-570RD
Termo-agitadorAllshengMS-100
Micro centrífugaEppendorf5424R
CentrífugaEppendorf5810R
EspectrofotómetroEppendorf BioFotómetro más
generador de imágenes en gelGEAmersham Imager 600
de ADN

Referencias

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