Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica

Ai-Qun Yu; Nina Pratomo; Tee-Kheang Ng; Hua Ling; Han-Saem Cho; Susanna Su Jan Leong; Matthew Wook Chang

doi:10.3791/54371

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Artículo de método

Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica

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DOI:

10.3791/54371

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20 de septiembre de 2016

Ai-Qun Yu¹^,² , Nina Pratomo¹^,² , Tee-Kheang Ng¹^,² , Hua Ling¹^,² , Han-Saem Cho¹^,² , Susanna Su Jan Leong¹^,²^,³ , Matthew Wook Chang¹^,²

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

En este artículo

Resumen

En este trabajo informamos sobre métodos sobre la manipulación genética molecular de la cepa Po1g de Yarrowia lipolytica para mejorar la eficiencia de la deleción de genes. Las cepas de Y. lipolytica modificadas resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.

Resumen

Yarrowia lipolytica es una especie de levadura no patógena, dimórficos y estrictamente aerobios. Debido a sus características fisiológicas distintivas y características metabólicas, esta levadura no convencional no sólo es un buen modelo para el estudio de la naturaleza fundamental de la diferenciación de hongos pero es también una plataforma microbiana prometedor para la producción bioquímica y diversas aplicaciones biotecnológicas, que requieren extensas manipulaciones genéticas. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de Y. lipolytica han sido limitados debido a la falta de un sistema de transformación genética eficiente y estable, así como tasas muy altas de recombinación no homóloga que se puede atribuir principalmente al gen KU70. Aquí, se presenta un protocolo de fácil y rápido para la transformación genética eficiente y para la deleción del gen de Y. lipolytica Po1g. En primer lugar, un protocolo para la transformación eficiente de ADN exógeno en Y. lipolytica Po1g se estableció. Second, para lograr la tasa de recombinación homóloga de doble cruce mejorado para una mayor eliminación de los genes diana, el gen KU70 se eliminó mediante la transformación de una casete de interrupción que lleva 1 brazos kb de homología. En tercer lugar, para demostrar la mayor eficiencia de la supresión de genes después de la supresión del gen KU70, hemos suprimido de forma individual 11 genes diana que codifican la alcohol deshidrogenasa y alcohol oxidasa utilizando los mismos procedimientos en la cepa plataforma nocaut KU70. Se observó que la tasa de recombinación homóloga precisa aumentó sustancialmente de menos de 0,5% para su eliminación del gen KU70 en Po1g al 33% -71% para la sola supresión de genes de los 11 genes diana en Po1g KU70 Δ. Un plásmido de replicación que lleva el marcador de resistencia a higromicina B y el sistema Cre / loxP se construyó, y el gen marcador de selección en las cepas de levadura knockout se eliminó finalmente mediante la expresión de la recombinasa Cre para facilitar múltiples rondas de TargeTED manipulaciones genéticas. Los mutantes de deleción de un solo gen resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.

Introducción

A diferencia de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, una levadura convencional, puede crecer en forma de levadura o micelio en respuesta a cambios en las condiciones del medio ambiente ^1,2. Por lo tanto, esta levadura dimórfica se puede utilizar como un buen modelo para el estudio de la diferenciación de hongos, la morfogénesis y la ^3,4,5 taxonomía. Generalmente se considera como una caja fuerte especies de levadura (GRAS), que se utiliza ampliamente para producir una variedad de aditivos de alimentos tales como ácidos orgánicos, polialcoholes, compuestos de aroma, emulsionantes y agentes tensioactivos ^6,7,8,9.