De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

Resumen

Se describe un método de microarrays de alto rendimiento para la identificación de polímeros que reducen la unión de la superficie bacteriana en dispositivos médicos.

Resumen

Los dispositivos médicos a menudo se asocian con infecciones adquiridas en el hospital, lo que ejerce una enorme presión sobre los pacientes y el sistema de salud, además de contribuir a la resistencia a los antimicrobianos. Una posible vía para la reducción de las infecciones asociadas a los dispositivos es la identificación de recubrimientos poliméricos repelentes de bacterias para estos dispositivos, lo que evitaría la unión de bacterias en el paso inicial de fijación. Aquí se describe un método para la identificación de dichos polímeros repelentes, basado en el cribado paralelo de cientos de polímeros utilizando un microarray. Este método de alto rendimiento dio como resultado la identificación de una gama de polímeros prometedores que resistían la unión de varias especies bacterianas clínicamente relevantes individualmente y también como comunidades de múltiples especies. Un polímero, PA13 (poli(metilmetacrilato-co-dimetilacrilamida)), demostró una reducción significativa en la adhesión de varios aislados hospitalarios cuando se recubrió en dos catéteres venosos centrales disponibles en el mercado. El método descrito podría aplicarse para identificar polímeros para una amplia gama de aplicaciones en las que la modificación de la unión bacteriana es importante.

Introducción

Microarrays de polímero son miniaturizados plataformas de alto rendimiento en el que hasta 7.000 polímeros ¹ se imprimen en portaobjetos de vidrio para el análisis paralelo con células procariotas o eucariotas ^2. El método que aquí se presenta se basa en lo que hemos descrito por primera vez en 2010 ^3. Este sistema de selección se ha aplicado a numerosos tipos de células incluyendo los hepatocitos humanos ^4, las células madre ^5, células epiteliales tubulares renales ^2, bacterias y protozoos patógenos ^{3,6 7.} En cada caso, los polímeros que promueven o se resisten a la unión de las células bajo estudio se identificaron ^8. Los complejos de DNA con polímeros policatiónicos sintéticos también se han utilizado en el formato de microarray para cribado de alto rendimiento de los candidatos de genes de transfección ^9. Además de la detección de las interacciones célula-sustrato, microarrays de polímeros también se han utilizado para evaluar las propiedades del material ^10.

"> La capacidad de los polímeros sintéticos para modular la unión de las bacterias a una superficie está bien establecido ^3,6,11. Numerosos factores, incluyendo carga, hidrofobicidad y rugosidad de la superficie de la superficie del polímero se sabe que afectan. Los enfoques convencionales de unión bacteriana de biomateriales descubriendo que resisten la unión de las bacterias a través secuencial o empíricamente diseñar y probar un material a la vez son de trabajo intensivo, costoso y procesos que consume tiempo. microarrays de polímero ofrecen una alternativa atractiva para eludir tales limitaciones.

bacterias de superficie asociados crecen como una población compleja denomina un biofilm - tales biopelículas son altamente resistentes a muchas tensiones ambientales y antibióticos. Esto es en parte debido a su matriz extracelular densa (compuesto por proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos) ¹² y en parte debido a la mayor presencia de células robustas "persistor" en biofilms ^13. Althouf los mecanismos precisos de la asociación de la superficie y la posterior formación de biopelículas son difíciles de caracterizar, en general se cree que hay tres etapas diferentes de crecimiento de la superficie ^{14 - 16.} , Fijación reversible inicial es seguida por una adherencia más fuerte de las células, el establecimiento de una biopelícula por la producción de una proteína extracelular y la matriz de polisacárido y la proliferación celular. Por último, las emisiones de biopelículas maduras, las células planctónicas que pueden iniciar nuevas infecciones en otras partes de vida libre. polímeros que impiden la unión inicial de las bacterias, y por lo tanto impiden que las primeras etapas de la formación de biopelículas de bacterias repelente, potencialmente representar una solución excelente para minimizar infecciones. Dado el aumento de resistencia a los antibióticos (y también la intrínsecamente mayor resistencia de las bacterias asociadas a la superficie ^12), medios libres de antibióticos de la reducción de infecciones son de particular interés. En un entorno hospitalario, el polímero que repele bacteriasrevestimientos pueden tener una aplicación médica directa en la reducción de las infecciones nosocomiales, que comúnmente se forman dispositivos implantados alrededor de ^17.

Aquí, un método de alto rendimiento para el cribado de 381 polímeros para la actividad repelente contra una gama de bacterias patógenas asociadas con las infecciones nosocomiales, seguido de validación de golpe y posterior recubrimiento y dosificación de los materiales del catéter venoso central, se describe (Figura 1). En pocas palabras, los polímeros fueron vistos en portaobjetos de vidrio de agarosa recubiertas de por impresión por contacto y, después del secado y esterilización, las matrices miniaturizados se incubaron con cultivos bacterianos clínicamente importantes. Después de la incubación, los microarrays se lavaron suavemente y las células bacterianas adherentes se tiñeron y se visualizaron por fluorescencia. Posteriormente, polímeros que inhiben la unión bacteriana se investigaron en una escala más grande por recubrimiento sobre cubreobjetos de vidrio y se visualizaron mediante microscopía electrónica. repelen seleccionadopolímeros prestado se revistieron después en catéteres comerciales y se muestran para reducir la unión de bacterias por casi 100 veces.

Protocolo

1. Preparación de las placas recubiertas de agarosa

NOTA: Antes de la fabricación de los microarrays de polímero, portaobjetos de vidrio recubiertos con aminoalquilsilano se recubren con agarosa IB para minimizar la unión no específica de fondo y permitir la evaluación de los polímeros que se unen o repeler bacterias ^6. revestimiento de silano facilita la unión de agarosa para las diapositivas.

1. Hacer un 2% de solución de agarosa IB en agua destilada en una botella de 250 ml (v / w).
2. Después de cerrar la botella sin apretar, calentar la suspensión en un horno de microondas en 30 períodos seg hasta que se disuelva. Asegúrese de que la tapa no está bien cerrado para evitar cualquier posible acumulación de presión hacia arriba. Retire la botella regular y homogeneizar suavemente.
3. Asegúrese de que el sólido se haya disuelto y la solución es clara. Verter esta solución de agarosa en un vaso de 100 ml, y colocar en un baño de agua a 65 ° C para mantener una solución líquida.
4. Sumergir los portaobjetos recubiertos de silano en la solución de agarosa, asegurando un recubrimiento uniforme, y wipe la parte posterior de la corredera con un papel de seda.
5. Secar las diapositivas, con la cara recubierta hacia arriba, en un entorno libre de polvo (por ejemplo, dentro de un armario o campana extractora) durante un mínimo de 24 hr.
6. Confirmar un revestimiento uniforme mediante inspección visual. Revestimiento se puede evaluar fácilmente por la respiración en la diapositiva - condensación se formará en las regiones no recubiertas. Solamente los portaobjetos recubiertos por completo y de manera uniforme se deben utilizar para la impresión de microarrays.

2. Preparación de las soluciones de polímeros para su impresión

1. Preparar soluciones (1% w / v) de una selección de polímeros preformados consiste en poliacrilatos, poliacrilamidas y poliuretanos en N metilpirrolidona (NMP) en viales de vidrio. (Preparar 1 ml de cada polímero). Vortex hasta que el polímero se haya disuelto completamente. Síntesis de polímeros se describe en otro ^6.
2. El uso de un micro-pipeta, llenar cada pocillo de una placa de micropocillos 384 con una solución de polímero de 25 l, asegurándose de que no hay conta cruzminación y cada pocillo contiene un polímero único. Utilice NMP como control negativo en al menos 2 pocillos. Registro de la identidad de la solución de polímero en cada pocillo en un archivo de plantilla de la placa u hoja de cálculo también.

3. Las micromatrices de polímero se imprime utilizando una impresora de contacto

NOTA: La impresión de los microarrays se realizó utilizando una impresora de contacto. Las instrucciones específicas con respecto a la impresión de microarrays de polímero se dan a continuación. Para directrices generales sobre el uso de las recomendaciones de la impresora y de seguridad, siga las instrucciones del fabricante. Aunque se utiliza una impresora de contacto, un dispositivo de estampado manual de adecuado también podría ser utilizado.

1. Como estaba previsto en el manual del usuario de la impresora, crear una rutina (véase el paso 3.3) que permite la impresión de 384 líquidos (las soluciones poliméricas o NMP) por cuadruplicado, utilizando una cabeza microarraying de 32 pines (dispuestos como 8 filas y 4 columnas).
2. Imprimir 1.536 puntos dispuestos como 48 filas y 32 columnas. Programar la rutina para imprimir en la sección 12s, es decir., 32 soluciones a la vez, para que la impresora se puede detener después de imprimir cada sección para permitir la limpieza de los pines.
3. Para crear una rutina de impresión:
   1. Abra el programa y de las opciones disponibles eligen 'Crear una nueva rutina'. Seleccione la pestaña 'Descripción' para detalles de entrada del experimento. Seleccione la pestaña 'Cabeza' y elija '32 cabeza microarraying -pin '.
   2. Seleccione la pestaña 'Fuente' y elija soporte de la placa (soporte de la placa fuente (1x5)), tipo de placa (placa de 384 x 6.000), el total de las placas (1) y el orden de las fuentes (por columnas).
   3. En el 'Estilo de la diapositiva' ficha, seleccione '3x1' 'slide' y elija poner en orden por "Número de campo '. A continuación, seleccione 'patrón Arraying'. Entrada 'visión del punto "como" diseño "y" dimensiones Pattern' como 'Número de filas' (6), 'El número de columnas' (8), "paso de fila '(750) y' pitch Columna '(560). Elija una sección para imprimir abetost.
   4. En el 'Diseño de diapositiva' de entrada ficha el número de diapositivas utilizado para la impresión. Seleccione la pestaña "Imprimir" para introducir los parámetros de impresión (número de sellos por entintado: 1, número de sellos por punto: 5, sellado de tiempo: 200 ms, tiempo de entintado: 100 ms).
      NOTA: Una rutina ya está creado para la impresión de 384 líquidos (las soluciones poliméricas o NMP) por cuadruplicado, utilizando una cabeza microarraying de 32 pines (8 dispuestos como filas y 4 columnas). En total, la rutina debe imprimir 1.536 puntos dispuestos como 48 filas y 32 columnas, con un paso de fila de 750 micras y el tono de la columna de 560 micras.
4. Colocar los portaobjetos recubiertos de agarosa sobre la plataforma y asegurar un buen sellado al vacío para mantener las diapositivas en su posición.
5. Ajuste el cabezal de impresión de manera que todos los pasadores están a la misma altura. Marque esta bajando manualmente la cabeza a un portaobjetos de vidrio y la confirmación de que los pasadores se mueven hacia arriba al mismo tiempo. Si hay alguna discrepancia con la altura, ajuste mediante el uso de la sleeve en el pasador hacia arriba o hacia abajo.
6. Coloque la placa de bien en el soporte de la placa en la orientación correcta, es decir., Así A1 es la parte superior derecha de la titular y garantizar así la placa se fija con firmeza.
7. Usando el ajuste de la altura, asegúrese de que la altura del soporte de la placa es tal que al momento de retirar las soluciones de polímeros, los pasadores no tocan el fondo de los pocillos.
   NOTA: Esto es importante para la localización de polímero uniforme y también para evitar el derrame de soluciones de polímeros en los pozos adyacentes, causando con ello la contaminación cruzada.
8. Seleccione la pestaña "Inicio" y seleccione el "Tipo de funcionar con" como "Normal". Haga clic en "Ejecutar", y confirmar que la diapositiva, así plato, etc., son en su posición cuando se le solicite.
9. Impresión 1 de la sección a la vez (32 soluciones a la vez; 12 secciones), lo que permite la limpieza de los pines entre secciones. Limpiar los pasadores a fondo con toalla de papel humedecido en acetona, seguido de papel de seda seco para asegurar los pasadores son completamente seco.
10. Al término de la impresión de los microarrays, colocarlos en un soporte de diapositivas y secar durante la noche en una estufa de vacío ajustada a 45 ° C para eliminar el NMP en los puntos de polímero. Después de la esterilización con luz UV durante 30 min, los microarrays están listos para la inoculación de las bacterias.
11. Antes de la inoculación con bacterias diapositivas, realizar una medición de la fluorescencia de fondo (como se describe en la sección 5). Utilice esta medición en el cálculo de la unión bacteriana.

4. La inoculación de Microarrays polímero con bacterias

NOTA: Asegurar una buena técnica aséptica. Toda la manipulación de las culturas debe realizarse en un entorno estéril: o bien el uso de un quemador Bunsen o en una campana de flujo. Los cultivos deben ser cultivadas con la disponibilidad de oxígeno, medio de crecimiento, y la temperatura ajustada a los requerimientos de cada especie.

1. Preparar cultivos durante la noche mediante la inoculación de 5 ml de caldo Luria-Bertani (LB: 10 g ^L-1 Bacto-triptona, 5 g ^L-1 de NaCl y 10 g L ^{-1 extracto de levadura) con una colonia de una placa. Incubar toda la noche a 37 ° C, con agitación a 200 rpm.}
2. Preparar las existencias congelador de cultivos durante la noche mediante la adición de glicerol (10% de concentración global) y almacenar el archivo a -80 ° C.
3. Con el fin de determinar el número de células a partir de muestras de las poblaciones bacterianas descongeladas, realizar diluciones en serie de cada población y crecer las bacterias durante la noche en medios sólidos. La determinación precisa del número de células en las poblaciones asegura la inoculación apropiada de cada especie ^6.
4. Preparar inóculos para microarrays. solo cultivo de especies se cultivan como antes y se aplican directamente a los microarrays. BacMix-1 es una mezcla bacteriana de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) y Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 es una mezcla bacteriana que consiste en Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus , K. pneumoniae y Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Para producir ya sea un cultivo mixto, mezcla noches en volúmenes iguales (3 ml cada uno) y se diluye cuatro veces con LB fresco (alrededor de 50 ml de volumen final).
6. Coloque los microarrays de polímero esterilizada por UV en placas rectangulares de 4 pocillos e incubar con 6 ml de cultivos bacterianos mixtos a 37 ° C con agitación suave (30 rpm) durante 5 días.
7. Después de la incubación, lavar suavemente los microarrays dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO ₄₎ y se incuba con una solución de 1 mg ml ^-1 de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mancha en PBS durante 30 min.
8. Lavar los microarrays diapositivas manchadas en una placa fresca cubriendo con PBS y se agita suavemente, cambiando el PBS una vez. En seco bajo un flujo de aire. Aplicar una hoja de cubierta de vidrio para los microarrays de diapositivas y el sello en su lugar con pegamento. Una vez dry, esterilizar la superficie exterior con 70% (v / v) de etanol.
9. Disposición segura de los cultivos en función de su nivel de contención.

5. Análisis de microarrays de imagen y

1. Capturar imágenes individuales para cada punto de polímero en campo claro y DAPI (/ em = 358 nm / 361 nm) Ex canales. Realice esto manualmente con un microscopio de fluorescencia o el uso de un microscopio de fluorescencia automatizado (con una etapa de XYZ controlada por un software de adquisición de imágenes) equipado con un objetivo de 20X.
   NOTA: Consulte el manual de ¹⁸ para hacer funcionar el software y el ajuste del microscopio para obtener imágenes utilizando canales de campo claro y DAPI. Asegúrese de que el tiempo de la ganancia y la exposición para la captura de imágenes para todos los microarrays son los mismos.
2. Obtener la intensidad media de fluorescencia de cada punto en el canal de DAPI eligiendo el área de la mancha y la cuantificación de la fluorescencia con un software de procesamiento de imágenes.
3. Para el fondo de fluorescencia de cada mancha, obtaen las imágenes de los puntos de polímero en un microarray de duplicados se incubaron solamente con los medios de comunicación sin bacterias. Deducir la fluorescencia de fondo de la intensidad del punto de obtener la fluorescencia de las bacterias.
4. Calcular el valor medio normalizado de los cuatro puntos, lo que representa cada polímero, que se utiliza para comparar las bacterias unión de varios polímeros ^6.
5. Identificar los polímeros que exhiben la unión (fluorescencia más bajo) menos bacteriana como polímeros 'hit' ^6.

6. Revestimiento de cubreobjetos para la Validación 'Hit'

1. Para Cubreobjetos de capa con polímeros:
   1. Se preparan soluciones de polímeros 'hit' (~ 2% w / v) en tetrahidrofurano (THF), u otro disolvente apropiado.
   2. capa de la vuelta cubreobjetos de vidrio circular de tamaño adecuado con las soluciones de polímero utilizando una recubridora de rotación a 2000 rpm durante 10 s.
      NOTA: En ausencia de una recubridora de rotación, cubreobjetos u otros materiales puede ser recubierto por inmersión, a pesar de girorevestimiento produce una superficie más uniforme.
   3. Secar los cubreobjetos recubiertos en un horno de convección a 40 ° C durante la noche y esterilizar usando luz UV durante 30 min antes de la inoculación de las bacterias.
2. Para Cubreobjetos de capa con agarosa Para los controles negativos:
   1. cubreobjetos limpias, ya sea por tratamiento de plasma de 10 min o la inmersión en NaOH 1 M durante 4 horas.
   2. Sumergir los cubreobjetos en acetonitrilo que contiene 1% trietoxisilano (3-aminopropil) durante la noche. Limpiar los cubreobjetos con acetona 3 veces y puesto en un horno (100 ° C) durante 1 hr.
   3. escudo Dip los cubreobjetos secos con solución de agarosa acuosa al 1% mantenido en un baño de agua a 60 ° C. Coloque el cubreobjetos recubiertos de agarosa en la superficie plana en condiciones ambiente libre de polvo durante 24 horas y esterilizar usando luz UV durante 30 minutos antes de la inoculación de las bacterias.

7. El apego y el análisis de hoja de la cubierta Uso de microscopio electrónico de barrido (SEM)

1. Despuésla esterilización con luz UV durante 30 min, colocar la cubierta se desliza (vidrio de polímero / agarosa, recubierto o no) en una placa de 12 pocillos estándar o placa de 24 pocillos (dependiendo del tamaño de los cubreobjetos) y se incuba con las bacterias como se describe en la sección de 4.
2. Después de la incubación con bacterias, lavar los cubreobjetos no recubiertos y recubiertos dos veces con tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,4) y luego fijar con 2,5% glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M (w / v) (pH 7,4) durante 2 horas.
3. muestras post-fix con 1% (w / v) tetróxido de osmio durante 1 hora a temperatura ambiente y se deshidratan con lavados de etanol secuenciales a 50, 70, 90 y 100% (v / v) durante 30 min cada uno.
4. Las muestras secas en CO ₂ de acuerdo con los protocolos estándar de ^19. El tiempo de secado dependerá de la naturaleza de la muestra.
5. muestras de capa de una aleación de oro / paladio (60/40%) utilizando un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica con corriente a 30 mA y vacío a 0,75 Torr. Examinar bajo el microscopio electrónico como por protocolos estándar ^20.
   NOTA: Ensure adecuadas precauciones de seguridad para manejar los riesgos resultantes de almacenamiento, manipulación y eliminación de tetróxido de osmio, ya que es altamente tóxico.
6. comparar visualmente imágenes de los cubreobjetos no recubiertos y las revestidas con agarosa o los polímeros 'hit' para confirmar bacterianas capacidades de unión / repelen de los polímeros.
   NOTA: La resistencia de la unión debe ser fácilmente visible como una reducción de células presentes.
7. Elija el más prometedor 'hit' polímeros no vinculantes para los estudios de pintura, haciendo los productos sanitarios (por ejemplo, catéteres venosos centrales) ^6.

8. Selección de un disolvente para el recubrimiento de catéteres

1. Evaluar diversos disolventes para su compatibilidad con la parte permanente del catéter, así como su capacidad para disolver el polímero 'golpeado'. Cortar partes del cateterismo-1 y en piezas cilíndricas de 5 mm de longitud, y medir con un calibrador Vernier digital.
2. Evaluar diversos disolventes tales como ACETácido ic, amoníaco, acetona, acetonitrilo, éter dietílico, tetrahidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), etanol, metanol, etilenglicol, tolueno y xileno. Sumergir piezas de catéter en los disolventes durante 12 horas y evaluar visualmente la integridad del catéter y la claridad de disolvente.
   NOTA: Elija un disolvente que no hacen que los catéteres que se hinchan o se desintegran o resultan en un disolvente turbia. El disolvente debe disolver los polímeros 'hit'.

9. Análisis de la adhesión bacteriana en catéteres por microscopía confocal

1. Preparar 2,5% (w / v) soluciones de polímeros en acetona u otro disolvente adecuado, según lo indicado en la sección 8. Colocar piezas 5 mm catéter en un pequeños frascos de vidrio (5 ml) y se sumerja en 1 ml de la solución de polímero durante 2 minutos . Retire el exceso de solución de polímero y secar las piezas del catéter durante la noche en un horno de vacío a 40 ° C.
2. Preparar el inóculo mediante la mezcla de descongelado st bacterianaocks para dar aproximadamente 10 ⁶ células de cada especie en 50 ml de LB ^6.
3. Esterilizar piezas de catéteres recubiertos y no recubiertos con luz UV durante 30 minutos y se incuba con 1 ml de LB inoculados en una placa de 24 pocillos, a 37 ° C durante 3 días, con agitación suave ^6.
4. Después de la incubación, lavar los catéteres con PBS (2x, 2 ml), fijar las bacterias con 10% de paraformaldehído en PBS durante 30 min, y se lava con PBS (1 ml). Tinción de las bacterias en piezas de catéter con DAPI (1 mg ml ^{- 1)} durante 20 min y se lava con PBS (1 ml).
5. Obtener imágenes confocales de las piezas de catéter utilizando la siguiente configuración: 405nm diodo láser azul, rango detector de 414-502 nm, agujero pin - Airy1, imagen Tamaño - 1.024 × 1.024 píxeles, el ancho del voxel - 105,2 nm, Z-pilas espaciamiento 0.5μ m , magnificación - 40X 1.25.
6. Completar la imagen confocal por apilamiento Z 50 imágenes a través de 100 micras de longitud del catéter.
7. Analizar las imágenes utilizando él apropiadosoftware de análisis le: aplanar las imágenes apiladas Z-en el plano Z, usando la función de extender la profundidad de campo, para crear una sola imagen de una pieza catéter.
   NOTA: Esta imagen debería analizarse entonces para obtener el área del catéter cubierto por bacterias, después de fondo de corrección mediante la función 'aplanar fondo'.

10. Análisis de la adhesión bacteriana en catéteres por SEM

1. Preparar 10% de solución de polímero (w / v) en acetona.
2. Presione una punta de pipeta (para 200 l micropipeta) en la parte media de la pieza cortada del catéter para sostenerlo y sumergir la pieza en la solución de polímero durante aproximadamente 30 segundos. Secar la pieza recubierta en condiciones ambientales durante 30 min. Aplicar un segundo recubrimiento por inmersión de nuevo en la solución polimérica y secar durante la noche en condiciones ambientales.
3. Después del tratamiento UV y la incubación con bacterias lavar las piezas (n = 3) con PBS (2x, 1 ml) y transferirlas en placas de 48 pocillos que contienen 10% de formaldehído en PBS durante 30 min. Después de la fijación, lavar las piezas con PBS (1 ml), secar durante la noche a temperatura ambiente, montar en trozos con discos de carbono conductoras, y una capa de oro usando un recubridor de pulverización catódica (véase el paso 7.5).
4. Obtener imágenes utilizando un microscopio electrónico de barrido ^6.

Resultados

La Figura 2 muestra la unión bacteriana (intensidad de fluorescencia normalizada) a un número de polímeros según lo determinado por análisis de microarrays. Manchas impresas sin polímero (NMP solamente) son el control negativo, como agarosa resiste fuertemente la unión bacteriana ⁶ - fluorescencia grabado es muy bajo. Los polímeros que se muestran son de baja unión a pesar de que en la mayoría de los casos, las propiedades repelentes de un polímero varía significativamente entre las especies bacterianas probadas. Esto refleja las grandes diferencias entre los mecanismos de fijación a través de diferentes especies. La selección de un polímero apropiado depende, por tanto, sobre la aplicación, pero los polímeros de unión a bajas son fácilmente identificados por comparación con la agarosa. polímeros de alto de unión son susceptibles de ser identificado en una matriz, y se pueden utilizar como controles positivos para experimentos posteriores. Para los polímeros que no muestran autofluorescencia en el canal de DAPI, co cualitativamparison de las imágenes in situ se puede hacer visualmente (como se muestra en la Figura 3, destacando un polímero de alto representante de unión y tres ejemplo, polímeros de baja unión). Tal comparación, mientras que proporciona menos información que el análisis estadístico, puede ser una validación visual útil de los valores de intensidad calculados.

Con 22 polímeros adecuados identificaron utilizando el microarray, experimentos a escala de arriba se llevan a cabo para confirmar su propiedad bacterias repelente cuando se utiliza para el recubrimiento de superficies más grandes. Se muestran los ejemplos de mejor desempeño, utilizados para cubrir las caídas de vidrio escudo (analizadas por SEM (Figuras 4 y 5)) y rodajas de catéter (analizadas por microscopía confocal (Figura 6) y SEM (Figura 7)). Ambos métodos microscópicos tienen la ventaja de permitir que los recuentos de células directos en la superficie, proporcionando datos inequívoca; reducción de la unión de las células es fácilmente visiblmi. Esos revestimientos que mejor conservan sus propiedades repelentes en la escala de arriba, además de ser susceptible de técnicas de recubrimiento a gran escala, se investigaron más. Los resultados mostrados ilustran los polímeros con mejores resultados de cada etapa.

Figura 1: SEM = microscopio electrónico de barrido pasos implicados en la identificación de los polímeros repelentes de bacterias a través de microarrays de polímero para aplicaciones biomédicas..

Figura 2:. Bacteriana de unión en una serie de polímeros, determinado por el análisis de microarrays de baja unión bacteriana se ve en una serie de poliacrilatos / acrilamidas (PA) y poliuretanos (PU). Los resultados de los microarrays de polímero sondaron con varios s bacterianas se muestran; pecies (BacMix-1 y BacMix-2 C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, y dos consorcios). La unión bacteriana expresa como corrección de fondo media DAPI intensidad de fluorescencia (normalizado). Las barras de error representan la desviación estándar. Adaptado de referencia ^6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Imágenes de ejemplo de puntos de polímero de fluorescencia (DAPI) y microscopía de campo claro imágenes de BacMix-2 que muestran la adhesión bacteriana en polímeros representativos. Un polímero con fuerza vinculante se incluye para la comparación de varios polímeros no vinculantes (PU-20, PA-336 y Pu-179). Barra de escala = 100 micras. Adaptado de referencia ^6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: experimentos a escala de arriba con cubreobjetos de vidrio imágenes de SEM que muestran la adhesión bacteriana sobre el vidrio revestido y vidrio recubierto con polímeros 'hit' (ejemplos seleccionados de la Tabla 1).. Barras de escala = 20 m.

Figura 5:. La unión bacteriana cuantificó por recuento de células a partir de imágenes de SEM Comparación de células unidas por unidad de superficie de las superficies recubiertas con los mejores polímeros 'hit'. La agarosa se utilizó como superficie 'no vinculante' un control, con el vidrio como una superficie de unión de control. Las barras de error representandesviación estándar.

Figura 6: Comparación de la unión bacteriana en rodajas catéter recubierto y sin recubrir imágenes confocales que comparan catéter sin tratar (cath-1) (A) y el catéter recubierto con PA13 (B) después de la incubación con BacMix-2.. Las imágenes tomadas con un objetivo de 40X (Barra de escala = 20 micras). Adaptado de referencia ^6.

Figura 7:. Comparación de la unión bacteriana en rodajas catéter recubierto y sin recubrir imágenes de SEM muestran la comparación de catéter sin tratar (cath-1) (A) y el catéter recubierto con PA13 (B) después de la incubación con un cóctel de bacterias que consiste en BacMix-2 Scale. bares = 101; m. Adaptado de referencia ^6.

Polímero	monómero 1	monómero 2	monómero 3	Relación de monómeros
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	MiSAmA	6	1	3
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	3
PA13		DMAA	-	9	1	-
PE1	PEG2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	PEG2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	BICH	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU227	PPG-PEG-1900	HDI	-	4.9	5.2	-
PU129	PPG425	BICH	DMAPD	2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	BICH	-	4.9	5.2	-
PU179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

Tabla 1: Composición de las bacterias no vinculantes 'golpeado' polímeros en la Figura 2.

Discusión

La unión de las bacterias a una superficie es un proceso complejo determinado por una amplia gama de factores dependientes de las especies bacterianas, las propiedades de la superficie, el medio circundante y el medio ambiente físico. Aunque ciertos grupos químicos son conocidos por afectar a la unión de bacterias (poliglicoles, por ejemplo, típicamente resistir fijación ^11), la correlación de los efectos biológicos de los polímeros con sus estructuras químicas, es difícil, por lo que el diseño racional de los polímeros para funciones específicas desafiantes. En ausencia de mecanismos detallados de fijación, otros estudios han tratado de imitar origen natural superficies repelentes, con largo y extenso optimización de procesos ^21. El método de alto rendimiento miniaturizado que aquí se presenta supera estos retos mediante la facilitación de la detección paralela de cientos de polímeros para identificar clientes potenciales para su posterior estudio.

Los resultados del método de microarray sirven principalmente para identify candidatos probables de plomo. La figura 2 ilustra 22 candidatos con baja unión de al menos una especie, mientras que la Figura 3 muestra la clara reducción de la capacidad de unión. Los 22 polímeros de unión bajas que se muestran en la Figura 2 se tomaron hacia adelante en experimentos a escala de arriba, durante los cuales el mejor (en términos de propiedades de repelencia y revestimiento) se determinó que eran PU83, PA13 y PA515 (Figuras 4 y 5). Los poliacrilatos ofrecen una mayor flexibilidad en términos de métodos de polimerización y por lo que el poliacrilato más bajo de unión, PA13, se escogió para estudios de revestimiento catéter (Figuras 6 y 7). Más trabajo más detallado sobre otros candidatos se llevó a cabo y se ha informado en otras partes ^6.

A través de una serie de iteraciones experimentales encontramos una serie de medidas de menor importancia fueron la clave para el éxito y la reproducibilidad. Además de facilitar la adhesión de lapolímeros a los portaobjetos de vidrio, utilizando un agarosa bajo-recubrimiento proporciona un fondo limpio, como agarosa es altamente resistente a la colonización bacteriana. De la misma manera la consistencia en el polímero de spots de sí mismos, tanto dentro de la misma matriz y entre las matrices, es vital y, por tanto, la impresión de las matrices debe ser controlada cuidadosamente. Se requiere un cuidadoso ajuste de los pernos en el cabezal de impresión y el relleno también uniforme de la placa de 384 pocillos para asegurar manchado uniforme. Como algunos de los polímeros que utilizamos exhibido un grado de autofluorescencia, tomando datos de fluorescencia de fondo para cada diapositiva antes de la incubación con bacterias era vital. Para dar cuenta de las variaciones y obtener Se aconseja a los robustos réplicas de datos de microarrays.

La mancha empleado aquí (DAPI) no tiene selectividad para las especies bacterianas, de unión no específica al ADN. Por lo tanto, una buena técnica aséptica es esencial una vez que se introducen cultivos bacterianos como contaminantes pueden pasar desapercibidos, confundiendo la interpretación de los resultados. Lo mismo es cierto de posteriores experimentos utilizando microscopía electrónica de barrido, donde sólo es posible distinguir bacilos y cocos, pero no género o especie.

Después de la selección de microarrays, polímeros prometedores deben ser elegidos para su posterior validación. En el ejemplo que aquí se presenta, siete polímeros de interés se identificaron por su clara reducción en la fluorescencia en el microarray y su inhibición de la unión se confirmó mediante el recubrimiento en superficies más grandes. Las Figuras 4 y 5 muestran la reducción en la unión logrado en cubreobjetos de vidrio, una medios prácticos para poner a prueba el comportamiento de los polímeros en forma de revestimientos a granel en lugar de en forma de manchas de microarrays. Posteriormente, estos polímeros se recubrieron sobre productos sanitarios para cuantificar plenamente la reducción en la adhesión bacteriana. Es importante que el disolvente elegido (véase la sección 8 de protocolo) para estos estudios de revestimiento es benigno al sustrato deseado (aquí, el catéter), mientras que retenering capacidad de disolver el polímero de interés, a fin de permitir revestimiento. Aquí, se utilizó acetona que, además de las propiedades mencionadas, tiene un bajo punto de ebullición y se evapora rápidamente para dejar un recubrimiento uniforme.

Los medios de validación elegido dependerá de la aplicación específica que se estudian. Como observación de las células por microscopía electrónica y de fluorescencia permite la cuantificación directa de la unión celular individual, elegimos estas técnicas como un complemento a la ensayo de tinción de microarrays granel. Los resultados se muestran en las figuras 6 y 7, que demuestran la importancia de los métodos de validación gratuitos. Las imágenes confocales de la Figura 6 proporcionar imágenes muy claras de las células individuales, mientras que el SEM tiene el beneficio añadido de permitir una evaluación de la superficie del polímero, que es aquí suave y uniforme. Estos métodos están limitados por el campo de visión de los microscopios utilizados, y por lo tanto es important a tomar una serie de fotografías que tener confianza en los resultados. El método descrito anteriormente no puede cuantificar la adherencia bacteriana sobre toda la superficie, solamente inferir la cobertura de un número de pequeñas regiones. Creemos que esto es suficiente para la aplicación descrita. Reducción en la unión bacteriana se pudo evaluar mediante la enumeración de bacterias adheridas de la superficie sobre toda las piezas de catéteres con y sin recubrimiento, utilizando métodos como se describe en otra parte ^22. Sin embargo, tales métodos requieren las superficies de biomateriales seleccionados para tener un área superficial uniforme, que es difícil de mantener cuando los ensayos se realizan con dispositivos médicos, que a menudo tienen geometría compleja.

Claramente, cualquier producto destinado para su uso clínico tiene que pasar por la prueba más importante para garantizar la seguridad y la eficacia en seres humanos. El método presentado aquí representa el comienzo de este proceso y más trabajo debe incluir la confirmación de la actividad in vivo. En este caso, el estudio de c venosaatheters, el trabajo inicial podría investigar la unión de componentes sanguíneos y células enteras al polímero. El efecto de los componentes sanguíneos en la unión bacteriana también se debe considerar, posiblemente mediante la repetición de los ensayos de unión en presencia de suero inactivado o sangre fibrinated ^de-23. La prueba definitiva de la tecnología estará en un modelo in vivo, tal como un modelo de infección implante subcutáneo ^24.

Se demuestra el potencial del método para la detección de microarrays de polímero de polímeros que alteran la superficie. Tales polímeros (ambos resistentes y promueven la unión de bacterias) tienen un gran número de aplicaciones en la medicina, la industria alimentaria y la biotecnología, es decir, este método puede ser útil en muchas áreas de investigación. Aunque los trabajos aquí utiliza bacterias, el método podría adaptarse a otros tipos de células y del mismo modo otros microarrays químicos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa	Sigma	05066
Portaobjetos de preparación de silano	Sigma	S4651
Polímeros	Sintetizados internamente	No aplicable
NMP	Sigma	494496
LB	Caldo Oxoid	CM1018
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Tetrahidrofurano	Sigma	401757
(3- aminopropilo) portaobjetos de vidrio recubierto de trietoxisilano Sigma		Preparación
Tampón de cacodilato	Sigma	97068
Catéter 1	Arrow International	Catéter de CS12123E
2	Baxter Healthcare	ECS1320
Tetróxido de osmio	Sigma	201030
Equipo
Impresora de contacto	Genetix	Qarraymini
Microscopio	Microarray IMSTAR	Pathfinder
Spin Coater	Speedline Technologies	6708D
Microscopio confocal	Leica	SP5
Software de análisis de imágenes	Media Cybernetics	Image-Pro Plus
Microscopio electrónico de barrido	Philips	XL30CP
Recubrimiento por pulverización catódica	Bal-Tec	SCD050