Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Summary

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Abstract

enfoques de purificación por afinidad han tenido éxito en el aislamiento de los complejos nativos para la caracterización proteómica. La heterogeneidad estructural y un grado de heterogeneidad de composición de un complejo por lo general no impiden el progreso en la realización de dichos estudios. En contraste, un complejo destinado a la caracterización estructural debe ser purificado en un estado que es a la vez de composición y estructuralmente homogéneo, así como a una concentración mayor que la requerida para la proteómica. Recientemente, se han producido avances significativos en la aplicación de la microscopía de electrones para la determinación de la estructura de grandes complejos macromoleculares. Esto ha aumentado el interés en los enfoques para purificar complejos nativas de calidad y cantidad suficiente para la determinación estructural mediante microscopía electrónica. El método de purificación de afinidad en tándem (TAP) ha sido optimizado para extraer y purificar un joven de 18 subunidad, ~ 0,8 ensamblaje ribonucleoproteína MDA a partir de levadura en ciernes (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

Muchos de los principales procesos celulares se llevan a cabo por gran proteína y proteína-ARN complejos ^1. Un cuello de botella significativo para la realización de estudios biofísicos y estructurales de tales complejos de ellos es la obtención de una calidad adecuada (es decir, homogeneidad) y a una concentración apropiada. El aislamiento de un complejo de una fuente nativa tiene muchas ventajas, incluyendo la retención de las modificaciones post-transcripcionales y / o traduccionales relevantes de subunidades y asegurar complejo montaje adecuado. Sin embargo, grandes complejos celulares están a menudo presentes en una célula en un bajo número d....

Protocol

Nota: El siguiente protocolo se diseñó para la purificación de un complejo de 4 l de cultivo de células, aproximadamente 40 g de peso húmedo de células. Una vez preparada, todos los tampones deben almacenarse a 4 ° C y utilizarse dentro de un mes de su preparación. Los inhibidores de la proteasa y de agentes reductores sólo se incorporan al tampones justo antes de su uso.

1. Preparación del extracto de células enteras para Tandem Purificación por Afinidad

1. El crecimiento de S. Las células cerevisiae
   1. Pasar la derivación deseada etiquetada S. cerevisiae cepa de almacenamiento (-80 ° C) en una soluci....

Results

Un método TAP modificado se utiliza para purificar a partir de S. cerevisiae, el U1 snRNP, un complejo de ribonucleoproteína 18 de la subunidad. Una purificación TAP inicial del complejo después de la ^2,3 protocolo publicado produjo un complejo que apareció heterogénea, migrando como tres bandas en un plata manchadas gel de poliacrilamida nativo (Figura 2A). Múltiples rondas de optimización del método de TAP, produjeron un complejo que migró como prin.......

Discussion

El método TAP utiliza dos etiquetas que equilibren la necesidad de más rigurosa y selectiva la unión a una resina de afinidad con el deseo de mantener cerca de condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. Además, TAP individuo etiquetada ORFs están disponibles de una fuente comercial, de modo que se puede obtener cualquier cepa de levadura con una pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cepa marcada con TAP de S. cerevisiae	Open Biosystems	YSC1177	Esta es la principal cepa de levadura utilizada para desarrollar el protocolo TAP. Su fondo es S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2 y Delta; 0, met15 y Delta; 0, ura3 y Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Molinillo de café	Mr. Coffee	IDS77	Utilizado para la lisis celular
Hemocitómetro, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Utilizado para evaluar la lisis celular
JA 9.100 rotor centrífugo	Beckman Coulter, Inc.		Se utiliza para cosechar las células de levadura
JA 20 rotor centrífugo de ángulo fijo	Beckman Coulter, Inc.		Se utiliza para limpiar el extracto celular de material celular no soluble
Rotor centrífugo de ángulo fijo Ti 60	Beckman Coulter, Inc.		Se utiliza para limpiar aún más el extracto de células solubles
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Agitador de temperatura controlada
Novex sistema de gel Thermo	Fisher Scientific
Resina IgG	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6
resina de calmodulina	Agilent Technologies, Inc.	214303	Resina de afinidad
Cóctel de inhibidores de la proteasa, mini comprimidos	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra sin EDTA Cóctel de
inhibidores de la proteasa, comprimidos grandes	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra sin EDTA Fluoruro
de fenilmetanosulfonilo (PMSF)			Disuelto en isopropanol
2 ml Columna Bio-spin	Bio-Rad Laboratorios, Inc.	7326008	Se utiliza para empacar y lavar la
columna de preparación de resina de calmodulina de 10 ml	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Se utiliza para envasar y lavar la resina IgG
Prefabricada PAGE Bis-Tris geles	Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% geles de poliacrilamida prefabricados
NativeMark Estándar de proteínas Thermo	Fisher Scientific	LC0725	Estándar de proteínas sin tinción utilizado para PAGE nativo. Carga 7.5 μ l para un gel teñido de plata y 5 μ l para un SYPRO Gel teñido de rubí
Prefabricado SDS PAGE Bis-Tris geles Life	Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% geles prefabricados de poliacrilamida
PageRuler estándar de proteínas	Thermo Fisher Scientific	26614	Estándar de proteínas sin teñir utilizado para Western bólter
tampón SDS	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Tampón
anticuerpo TAP	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Anticuerpo primario contra la etiqueta CBP
Anticuerpo secundario	Thermo Fisher Scientific	31341	Fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra conjugada
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro azul tetrazolio
Unidades de dializamiento	Thermo Fisher Scientific	88401	Miniunidades de diálisis Slide-A-Lyzer
Unidades de filtro centrífugo, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-100
Perlas absorbentes de detergente	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbentes
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Colorante fluorescente para la tinción de ácidos nucleicos, cuando se detecta con SYPRO Ruby presente, utilice una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 532 nm
Sondas moleculares	SYPRO Ruby	S-12000	Colorante fluorescente para la tinción de proteínas, cuando se detecta con SYBR Green II presente, utilice una longitud de onda de excitación de 457 nm y una longitud de onda de emisión de 670 nm
Rejillas de cobre	Ciencias de la Microscopía Electrónica	G400-CP