El gusto es un proceso sensorial importante que facilita la atracción hacia sustancias beneficiosas y evita las sustancias tóxicas. Este protocolo describe un ensayo de ingestión simple para determinar la preferencia gustativa de Drosophila por un compuesto químico determinado.
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Artículo de método
Ensayo Preferencia gusto por adulto
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Resumen
Resumen
La percepción olfativa y gustativa del entorno es vital para la supervivencia de los animales. La aplicación más obvia de estos quimiosentidos es ser capaz de distinguir las buenas fuentes de alimentos de las potencialmente peligrosas. La gutación requiere contacto físico con un compuesto químico que es capaz de enviar señales a través de los receptores gustativos que se expresan en la superficie de las neuronas. En los insectos, estas neuronas gustativas se pueden ubicar en todo el cuerpo del animal, lo que permite que el gusto juegue un papel importante en muchos comportamientos diferentes. Los insectos suelen preferir los compuestos que contienen azúcares, mientras que los compuestos que se consideran de sabor amargo se evitan. Dada la importancia biológica básica del gusto, existe un gran interés en comprender los mecanismos moleculares que subyacen a esta modalidad sensorial. Describimos un ensayo de sabor de Drosophila adulta que refleja la preferencia de los animales por un compuesto gustativo dado. Este ensayo se puede aplicar a animales de cualquier origen genético para examinar la preferencia de sabor por un compuesto soluble deseado.
Introducción
Los animales usan para distinguir chemosensation condiciones ventajosas, aparte de las condiciones desventajosas. Esta percepción puede ser crítico para cosas tales como la determinación de la mejor fuente de alimento, evitar sustancias tóxicas o determinar el mejor socio de acoplamiento 1. Chemosensation a menudo se divide en dos componentes sensoriales: sentidos olfativos y gustativos sentidos. Un principal característica distintiva de estos sentidos es que el olfato (olor) se utiliza para muestrear el ambiente químico gaseoso circundante mientras gustation (sabor) requiere contacto físico con un sustrato no volátil. Ambas modalidades sensoriales estimulan respuestas neurológicas que son tratados y decodificados en el cerebro para producir el comportamiento de atracción o repulsión adecuada 2. Estos sentidos son de importancia crítica para la supervivencia del animal.
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un organismo modelo que sigue creciendo en popularidad para su uso en entendering cómo los insectos perciben olor y sabor. moscas de la fruta ofrecen enormes ventajas sobre otros sistemas modelo debido a la gran cantidad de herramientas genéticas disponibles para la disección de las vías moleculares, celulares y de comportamiento. Trabajo en los últimos 15 años ha sido especialmente importante en la caracterización de las identidades celulares específicos, receptores neuronales, y los mecanismos que intervienen en tanto olor y el sabor de señalización. Ahora, el poder de la genética de Drosophila se utiliza para aclarar aún más cómo estos procesos se codifican en el nivel sola neurona y simple circuito 3-6. Por lo tanto, los ensayos que proporcionan anotó fácilmente lecturas de las alteraciones en las vías sensoriales son vitales para el avance continuado de esos campos.
Mientras que una gran cantidad se sabe acerca de cómo las señales olfativas son codificados y procesados en el cerebro, y mucho menos se sabe acerca de los mecanismos similares en la vía gustativa. Se describe aquí un protocolo que se puede utilizar para determinar preferen gustativasce en Drosophila. Drosophila, como los mamíferos, por lo general prefieren compuestos de sabor dulce en lugar de compuestos de sabor amargo. Cualquier combinación de estas fuentes de alimentos se puede utilizar en este diseño experimental para determinar cómo las alteraciones genéticas conocidas afectan a la elección gusto. Además, las estrategias de intervención farmacológica de manera similar se pueden evaluar por sus efectos sobre la preferencia del gusto de los animales. La facilidad y flexibilidad de este ensayo hace que sea un paradigma útil para comprender la naturaleza de la percepción gustativa en Drosophila.
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Protocolo
1. El hambre
- Preparar volar viales de hambre por saturación de una bola de algodón con el 18,2 mO agua en el fondo de un vial mosca estándar. Por otra parte, de manera similar saturar una pequeña tira de papel de filtro con 18,2 mO agua y el lugar en un ángulo dentro del vial.
- Recoger las moscas en conjuntos de ~ 100 animales en una almohadilla de CO 2 y luego agregar las moscas a un vial preparado.
Nota: Los mejores resultados se obtienen con los animales que están a menos de 5 días de edad. Sin embargo, la edad exacta de los animales puede ser controlado como una variable experimental para determinar los cambios en la preferencia de sabor con el tiempo. - Utilice un tapón de algodón o espuma para asegurar los viales cerrados. Colocar los viales en su lado en una incubadora con ambiente controlado. Mantener la temperatura a 25 ° C, y la humedad por encima de 70%. Deja viales sin tocar durante 24 horas.
Ensayo Preferencia 2. Sabor
- Preparar todos los estimulantes del gusto para el ensayo en el mismo día unas prueba.
Nota: Los estimulantes del gusto exacta a usar variará dependiendo de la pregunta experimental que se les pide. Los siguientes son ejemplos de estimulantes del gusto utilizados en este protocolo. Ver la sección 4 para optimizaciones.- Preparar el control saborizante (sacarosa 1 mM) mediante la combinación de 10 l de solución de sacarosa 100 mM, 13 l de colorante rojo, y 977 l de agua 18.2 mO.
- Preparar saborizante experimental (sacarosa al 5 mM) mediante la combinación de 50 l de solución de sacarosa 100 mM, 10 l de colorante azul, y 940 l de agua 18.2 mO.
- Hacer cámaras de ensayo usando una 100 mm x 15 mm placa de petri de plástico estándar preparado de la siguiente manera:
- Coloque tres gotas 10 l de saborizante de control más cercano al borde de la placa a las 12 horas y las otras 3 gotas a las 6 h. Asegúrese de que la separación entre gotas es similar.
- Coloque tres gotas 10 l de saborizante experimental más cercana al borde de la placa a las 3 en punto y unaotras 3 gotas a las 9 en punto. Asegúrese de que la separación entre gotas es similar.
- Repita los pasos 2.2.1 y 2.2.2 para tantas repeticiones como se desee.
- 1 frasco de vacío ~ 100 moscas hambrientas en una almohadilla de CO 2 sólo el tiempo suficiente para anestesiar a todos los animales (aproximadamente 10 segundos). Cepillo de los animales en el medio de una cámara de ensayo preparado y cubrir con la tapa de la placa.
Nota: El aumento de los periodos de exposición al CO 2 se debe evitar para mejorar el tiempo de recuperación y limitar la interferencia con el comportamiento alimentario. La exposición a hielo (~ 5 min) puede ser utilizado para anestesiar para evitar CO 2 efectos de comportamiento que pueden surgir de incluso una exposición limitada. - Coloque la cámara de ensayo en una caja de cartón opaco. Asegúrese de marcar la parte exterior de la caja con la condición y el genotipo siendo probados.
- Coloque la configuración completa (cámara de ensayo contenida dentro de la caja de cartón desde el paso 2.4) en un 25 ° C incubadora con al menos un 70% de humedad durante 2 horas.
- Repita los pasos 2.3 a través 2.5 para todas las repeticiones.
- Después de 2 horas, colocar las cámaras de ensayo, todavía contenidas dentro de cajas de cartón, directamente en un congelador a -20ºC hasta que esté listo para la cuantificación.
3. Ensayo de Sabor Preferencia Cuantificación
- Permitir que una sola cámara de ensayo se caliente a la temperatura ambiente (aproximadamente 5 minutos).
- Bajo un microscopio de disección, usando un cepillo o un par de pinzas, los animales del grupo basado en el color de su abdomen: rojo, azul, púrpura o clara (Figura 1).
- Registre el número de animales en cada grupo. Considere animales claras para no hayan participado en el ensayo y por lo tanto no los incluyen en los cálculos.
- Calcular el índice de preferencia de acuerdo con una de las siguientes ecuaciones:
- Si se añade el saborizante experimental de interés para el tinte rojo, a continuación, utilizar (N + rojo púrpura 0,5 N) / (N + N rojo azul + N purple).
- Si se añade el saborizante experimental para el colorante azul, y luego ajustar la ecuación de (N + azul púrpura 0,5 N) / (N + N azul rojo púrpura + N).
- Repetir los cálculos para todas las condiciones experimentales y repeticiones.
4. Optimización de Ensayo de preferencia de sabor
- Empíricamente determinar la concentración de los indicadores de colorante de alimentos para ser usado de modo colorante de alimentos no afecta el resultado del ensayo de sabor, como sigue:
- Preparar 4 estimulantes del gusto usando el mismo compuesto de base (por ejemplo, sacarosa al 5 mM) como se indica en el paso 2.1, pero omitir el colorante de alimentos.
- Añadir 1,3% de colorante rojo a uno de los estimulantes del gusto. Hacer los 3 restantes con estimulantes del gusto azul colorante de alimentos de las concentraciones que varían en cada tubo (por ejemplo, 0,6%, 1% y 1,3%).
- protocolo completo los pasos 2.2 a 3.4 para cada par saborizante: 1,3% frente a 0,6% de azul rojo; 1,3% frente a 1% de color rojo y azul1,3% frente a 1,3% de azul rojo.
- Repita el paso 4.1.1-4.1.3 con diferentes porcentajes de colorante azul hasta los promedios del índice de preferencia un valor de 0 (Figura 2).
Nota: Como punto de partida, un 1,3% de colorante rojo junto con 1% de colorante azul normalmente da buenos resultados. Si hay concentración satisfactoria de colorante azul se puede adaptar al 1,3% de colorante, a continuación, paso 4.1.1 a través de 4.1.3 se puede repetir con diferentes concentraciones de colorante rojo y una concentración constante de colorante azul. - Analizar todas las condiciones de la prueba con las mismas concentraciones de colorantes de alimentos optimizados.
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Resultados
Algunos resultados típicos de los ensayos de preferencias gustativas se muestran a continuación. En la mayoría de los experimentos alguna variación en la intensidad de la coloración abdominal se verá (Figura 1). Cualquier coloración en el abdomen ya sea intensa o débil se considera una ingesta positivo. Por tanto, es aconsejable que los investigadores para anotar animales mientras ciegos a la condición experimental de modo que se limiten los posibles sesgos.
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Discusión
Hemos descrito un protocolo simple pero eficaz para determinar preferencia de sabor en Drosophila. Las versiones de este ensayo se utilizan habitualmente en experimentos para determinar las contribuciones de los receptores gustativos (gr) para percibir las diferentes calidades (amargo, dulce, agrio, salado y umami) de los compuestos del sabor. El genoma de Drosophila contiene aproximadamente 60 genes que codifican los receptores gustativos 68 identificados por splicing alternativo 8,9. Sin e...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Tessier por la lectura crítica de este manuscrito y sus útiles sugerencias durante la preparación de este protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colorante alimentario azul (agua, propilenglicol, FD& C Azul 1 y Rojo 40, Propilparabeno) | McCormick | N/A | |
| Cajas criogénicas/congeladoras sin divisores | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Ácido acético glacial | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Microscopio estereofónico 0.63X-4.0X | W. Nuhsbaum, Inc. | ||
| Placa de Petri (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reutilizable si se lava y seca a fondo |
| Microtubos Quick-Snap | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Colorante alimentario rojo (agua, propilenglicol, FD& C Rojos 40 y 3, Propilparabeno) | McCormick | N/A | |
| Sacarosa | IBI Scientific IB37160 |
Referencias
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- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
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