Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

Resumen

Se describe una técnica novedosa para la detección de receptores endógenos de baja abundancia presentes en embriones de pez cebra. Lo hemos denominado AFLIP porque consiste en el marcaje de afinidad del receptor por su ligando ligado a la inmunoprecipitación.

Resumen

Mediante la combinación de las potencias de Affinity Labeling y Immunoprecipitation (AFLIP), se ha implementado una técnica para la detección de receptores de baja abundancia en embriones de pez cebra. Esta técnica aprovecha la selectividad y sensibilidad conferida por el marcaje de afinidad de un determinado receptor por su ligando con la especificidad de la inmunoprecipitación. Hemos utilizado AFLIP para detectar el receptor de TGF-β tipo III (TGFBR3), también conocido como betaglicano, durante el desarrollo temprano del pez cebra. AFLIP fue fundamental para validar la eficacia de un fenotipo de pez cebra morphant TGFBR3. En el primer paso, se preparan extractos de proteínas embrionarias y se utilizan para generar ^{complejos 125}I-TGF-β2-TGFBR3 que se purifican por inmunoprecipitación. Posteriormente, estos complejos se entrecruzan covalentemente y se revelan mediante la separación SDS-PAGE y la detección autorradiográfica. Esta técnica requiere la disponibilidad de un ligando marcado para el receptor que se va a detectar y de un anticuerpo específico contra él, y se adaptará fácilmente para identificar cualquier factor de crecimiento o receptor de citocinas que cumpla estos requisitos.

Introducción

La detección específica de proteínas expresadas durante el desarrollo embrionario es necesaria para validar los perfiles de expresión obtenidos mediante la medición de sus ARNm afines con RT-PCR o hibridación in situ (ISH). Esto se logra comúnmente mediante una transferencia de Western de extractos de embriones seguida de la detección con anticuerpos específicos. Sin embargo, este enfoque es difícil de aplicar a proteínas que se encuentran en muy baja abundancia, o que tienen propiedades que dificultan su transferencia cuantitativa durante su transferencia. El betaglicano, también conocido como receptor del factor de crecimiento transformante tipo III β (TGF-β) (TGFBR3), es un ejemplo de estas dificultades. TGFBR3 es un proteoglicano de membrana a tiempo parcial que se une a TGF-β a través de su proteína central¹, con una afinidad notablemente mayor por la isoforma TGF-β2, una propiedad que lo distingue de cualquier otra proteína de unión a TGF-β². El TGFBR3 en el pez cebra se expresa a partir de 8 hpf, alcanzando un máximo de 72 hpf, según lo detectado por RT-PCR de su ARNm³.

Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de un anticuerpo muy específico³, todos los intentos de detectar su producto traducido por Western blot resultaron infructuosos. Teniendo en cuenta que la naturaleza proteoglicana de TGFBR3, así como la supuesta baja abundancia, pueden ser responsables de este fracaso, se ideó un método de detección, AFLIP, que aprovecha la alta afinidad de TGFBR3 por TGF-β2. En este método, se permite que un extracto de proteína de embriones agrupados se una específicamente a ¹²⁵TGF-β2 marcado con I y los complejos receptor-ligando se purifican por inmunoprecipitación y se entrecruzan antes de la separación por SDS-PAGE. Los patrones de migración observados por autorradiografía de los geles revelaron la presencia y la naturaleza de las especies receptoras marcadas. Este enfoque combina la especificidad del ligando del marcaje de afinidad con la inmunoprecipitación por anticuerpos específicos, aumentando el rango de detección y evitando la transferencia ineficiente de TGFBR3. Debido a sus propiedades inherentes, el ensayo AFLIP no es un ensayo cuantitativo, pero se puede utilizar para medir con confianza las diferencias experimentales relativas en el receptor analizado.

Protocolo

Todos los experimentos llevados a cabo en animales fueron aprobados por el Comité para el Laboratorio de Cuidado y Uso de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Animal, bajo el número CICUAL-Protocolo: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Preparación de extracto de proteína de embriones

1. Recoger 100 - 200 embriones para cada condición de comparar (morphants vs tipo salvaje) en la etapa deseada, por ejemplo, 72 h después de la fecundación (HPF).
2. Coloque los embriones en placas de Petri que contienen los peces de agua (ver Tabla 1) y dechorionate manualmente embriones utilizando unas pinzas de punta fina. Evitar el uso de pronasa durante este paso (o cualquier otra proteasa durante todo el protocolo), ya que puede digerir el receptor diana.
3. Coloque los embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se lavan los embriones twhielo con solución tampón de fosfato 1x (PBS) (véase la Tabla 1).
4. Añadir 500 l de tampón deyolk (ver Tabla 1).
5. Liberar la mayor parte de la yema pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 30 - 40 veces) los embriones en la solución. Para el 72 y 48 HPF embriones HPF utilizar azul y amarillo, puntas de pipeta, respectivamente. puntas amarillas puede ser necesario cortar un poco para evitar la destrucción de embriones. La liberación de yema de éxito se puede verificar mediante la observación de los embriones bajo el microscopio.
6. Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg.
7. Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta.
8. Lavado de embriones dos veces con 500 l de tampón de lavado (ver Tabla 1) por agitación suave a la velocidad más baja.
9. Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg.
10. A partir de aquí, continuar con el procedimiento a 4 ° C.
11. Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta.
12. embriones resuspender en 350 l de tampón de lisis (véase la Tabla 1) y homogeneizar usando una mano de mortero de plástico.
13. Incubar los embriones lisadas 30 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° C.
14. Centrifugar lisaron embriones a 11.000 xg durante 15 min con el fin de eliminar los residuos insolubles.
15. Transferencia aclaró sobrenadante usando una pipeta a un tubo nuevo.
16. Determinación de proteínas totales mediante el ensayo de proteínas de Bradford ^4, u otro procedimiento adecuado. Si se utiliza el ensayo de Bradford, lleve a cabo la curva de calibración en presencia de concentraciones equivalentes de los detergentes presentes en el tampón de lisis, ya que provocan una subestimación de la proteína estándar ^4.

2. Detección de proteína endógena Receptor

1. Etiquetado de afinidad e inmunoprecipitación (todos estos pasos a 4 ^° C)
   1. Coloque 400-500 g de proteína total de embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluir a 1 g / l con tampón 1 (ver Tabla 1).
      Nota: Con el fin de obtener 500 g de proteína total del embrión, a unos 100 - 200 embriones deben ser procesados ​​inicialmente. 72 HPF embriones producen rutinariamente ~ 5 g de proteína embrión total, que es suficiente para la detección betaglicano.
   2. Añadir suficiente volumen de TGF-β2 etiqueta de valores para alcanzar una concentración final de 150 pM y se incuba con agitación en un tubo de ensayo basculante 2 horas a 4 ° C. TGF-β2 debe ser etiquetado antes de iniciar AFLIP, con ¹²⁵ I por el método de la cloramina T como se describe por Cheifetz et al. ^5.
      PRECAUCIÓN: El uso de blindaje para minimizar la exposición durante la manipulación marcado ^{con 125I} ligando.
   3. Añadir suficiente volumen de anticuerpo sin diluir contra el receptor de interés con el fin de llegar a una dilución de 1: 100 y continuar la incubación durante otras 2 horas a 4 ° C (incubación puede ser O / N). Esta es la dilución óptima de antisuero # 31, que se utiliza en este estudio y descrito en otra parte ^3, pero dependiendo de la calidad de la unatibody, una dilución mayor o menor puede ser la óptima.
   4. Añadir 50 l de perlas de unión a inmunoglobulina adecuado (por ejemplo, la proteína G-Sepharose, que se equilibró previamente en RTFP y se resuspendió 1: 5 de su volumen original en RTFP) e incubar durante 50 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° DO.
   5. Recuperar las cuentas por microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 seg.
   6. Desechar el sobrenadante en un recipiente de basura radiactiva adecuada.
   7. Se lavan las IP-cuentas tres veces con 1 ml de tampón de lavado IP (ver Tabla 1), por agitación e microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 segundos cada vez.
   8. Resuspender IP-perlas en 250 l de tampón de lavado IP.
   9. Añadir 1,5 l de suberato de disuccinimidilo (DSS, se disolvió en DMSO a 10 mg / ml). Preparar la solución de DSS justo antes de su uso en esta etapa.
   10. Incubar durante 15 min a 4 ° C con agitación.
   11. Con el fin de detener la reacción de reticulación, añadir 500 l Otampón de lavado f IP, suplementado con suficiente Tris-Cl pH 7,4 de stock para llegar a 25 mM Tris-Cl. Los grupos amino libres en Tris capturan DSS no reaccionado.
   12. Se centrifuga a 11.000 xg durante 20 segundos para recoger IP-cuentas y desechar el sobrenadante.
   13. Resuspender IP-perlas en 30 l de tampón reductor Laemmli.
   14. Hervir las muestras de 5 min a 94 ° C.
   15. Opcionalmente, el análisis de muestras en un contador gamma utilizando el protocolo del fabricante.
2. Análisis de las muestras
   1. Las muestras sometidas a desnaturalización SDS-PAGE. Utilice poliacrilamida en el porcentaje adecuado para la masa del receptor y ejecutar gel bajo procedimiento estándar.
   2. Sumergir gel en solución de fijación (véase la Tabla 1) durante 30 min a TA.
   3. Lavar gel con agua destilada durante 15 min.
   4. Coloque gel en papel de filtro previamente hidratado y cubrir con papel film película.
   5. gel seco a 80 ° C durante 1 hr.
   6. Exponer en gel en una scre PhosphorImager blancoa temperatura ambiente en O / N.
   7. Analiza pantalla expuesta mediante un PhosphorImager usando el protocolo del fabricante.

Resultados

La Figura 1 muestra un resultado representativo obtenido con AFLIP. Las señales en el carril 1 provienen de la I-ligando ¹²⁵ covalentemente ya sea a la proteína de pez cebra betaglicano núcleo (BG núcleo, por debajo del marcador de 150 kDa) o el núcleo de BG que ha sido procesada a su forma de proteoglicanos mediante la unión de los glicosaminoglicanos (GAG, frotis que van desde 170 kDa a la parte superior del gel). Este patrón de migración, una proteína núcle...

Discusión

El uso de transferencias de Western con un anticuerpo específico contra una proteína de interés es una herramienta valiosa para estudiar su expresión durante la embriogénesis ^7. Sin embargo, la inmunotransferencia de proteínas altamente glicosiladas no ha sido muy exitoso debido a su transferencia ineficiente y débil unión a nitrocelulosa o PVDF membranas ^8,9.

Los proteoglicanos son un buen ejemplo de este inconveniente, debido a sus cadenas de glicosaminoglicanos unido...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suberato de disuccinimidilo (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Proteína G Sepharose 4 Fast	Flow GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Secador de gel Modelo 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Ciencias de la Vida	63-0055-78
Cobra II Auto Contador	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Mezcla Marina del Mar Cristalino Empresas	Marinas http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix