Se describe una técnica novedosa para la detección de receptores endógenos de baja abundancia presentes en embriones de pez cebra. Lo hemos denominado AFLIP porque consiste en el marcaje de afinidad del receptor por su ligando ligado a la inmunoprecipitación.
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Artículo de método
Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Mediante la combinación de las potencias de Affinity Labeling y Immunoprecipitation (AFLIP), se ha implementado una técnica para la detección de receptores de baja abundancia en embriones de pez cebra. Esta técnica aprovecha la selectividad y sensibilidad conferida por el marcaje de afinidad de un determinado receptor por su ligando con la especificidad de la inmunoprecipitación. Hemos utilizado AFLIP para detectar el receptor de TGF-β tipo III (TGFBR3), también conocido como betaglicano, durante el desarrollo temprano del pez cebra. AFLIP fue fundamental para validar la eficacia de un fenotipo de pez cebra morphant TGFBR3. En el primer paso, se preparan extractos de proteínas embrionarias y se utilizan para generar complejos 125I-TGF-β2-TGFBR3 que se purifican por inmunoprecipitación. Posteriormente, estos complejos se entrecruzan covalentemente y se revelan mediante la separación SDS-PAGE y la detección autorradiográfica. Esta técnica requiere la disponibilidad de un ligando marcado para el receptor que se va a detectar y de un anticuerpo específico contra él, y se adaptará fácilmente para identificar cualquier factor de crecimiento o receptor de citocinas que cumpla estos requisitos.
Introducción
La detección específica de proteínas expresadas durante el desarrollo embrionario es necesaria para validar los perfiles de expresión obtenidos mediante la medición de sus ARNm afines con RT-PCR o hibridación in situ (ISH). Esto se logra comúnmente mediante una transferencia de Western de extractos de embriones seguida de la detección con anticuerpos específicos. Sin embargo, este enfoque es difícil de aplicar a proteínas que se encuentran en muy baja abundancia, o que tienen propiedades que dificultan su transferencia cuantitativa durante su transferencia. El betaglicano, también conocido como receptor del factor de crecimiento transformante tipo III β (TGF-....
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Protocolo
Todos los experimentos llevados a cabo en animales fueron aprobados por el Comité para el Laboratorio de Cuidado y Uso de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Animal, bajo el número CICUAL-Protocolo: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Preparación de extracto de proteína de embriones
- Recoger 100 - 200 embriones para cada condición de comparar (morphants vs tipo salvaje) en la etapa deseada, por ejemplo, 72 h después de la fecundación (HPF).
- Coloque los embriones....
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Resultados
La Figura 1 muestra un resultado representativo obtenido con AFLIP. Las señales en el carril 1 provienen de la I-ligando 125 covalentemente ya sea a la proteína de pez cebra betaglicano núcleo (BG núcleo, por debajo del marcador de 150 kDa) o el núcleo de BG que ha sido procesada a su forma de proteoglicanos mediante la unión de los glicosaminoglicanos (GAG, frotis que van desde 170 kDa a la parte superior del gel). Este patrón de migración, una proteína núcle.......
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Discusión
El uso de transferencias de Western con un anticuerpo específico contra una proteína de interés es una herramienta valiosa para estudiar su expresión durante la embriogénesis 7. Sin embargo, la inmunotransferencia de proteínas altamente glicosiladas no ha sido muy exitoso debido a su transferencia ineficiente y débil unión a nitrocelulosa o PVDF membranas 8,9.
Los proteoglicanos son un buen ejemplo de este inconveniente, debido a sus cadenas de glicosaminoglicanos unido.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Gilberto Morales por el cuidado y mantenimiento de los peces, y a los Dres. Claudia Rivera y Héctor Málagón (IFC-UNAM Animal Facility) por su ayuda en la inmunización de conejos. Este trabajo contó con el apoyo de becas de CONACYT 131226 y PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Suberato de disuccinimidilo (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Proteína G Sepharose 4 Fast | Flow GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Secador de gel Modelo 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Ciencias de la Vida | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto Contador | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Mezcla Marina del Mar Cristalino Empresas | Marinas http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
Referencias
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J.
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Reimpresiones y permisos
