En el clima actual de escasez de recursos, están surgiendo nuevas tecnologías que permiten a los investigadores realizar estudios más baratos, más rápidos y con más precisión. En este trabajo describimos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales basado en perlas para medir la exposición humana a múltiples patógenos ambientales simultáneamente.
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Artículo de método
El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales
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Resumen
Resumen
La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.
Introducción
Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede aplicar a los estudios epidemiológicos para determinar la exposición humana a estos patógenos y definir mejor las infecciones immunoprevalence e incidentes.
La saliva es muy prometedora como una alternativa al suero para la investigación de biomarcadores humanos. Entre las ventajas de usar saliva son la no invasividad y la facilidad de la recogida de muestras, bajo coste, y las muestras pueden ser fácilmente recogidos de los niños de 5-7 </ Sup>. Las muestras de suero y saliva se han estudiado ampliamente para anticuerpos contra H. pylori 2,3,8, 9 Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus de la hepatitis A y C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus dengue 16, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 17, y Escherichia coli O157: H7 18.
Un inmunoensayo multiplex permite el análisis de múltiples analitos simultáneamente dentro de un solo volumen de muestra y dentro de un solo ciclo o correr. Antígenos de C. multiplexados jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitis A virus, y dos norovirus se utilizaron para medir humano salival IgG e IgA 2-4 3,4 y respuestas de anticuerpos de IgG en plasma de 2,3 a estos patógenos utilizando unabasado en perlas inmunoensayo multiplexación. Cuando se utiliza en conjunción con estudios epidemiológicos de la exposición a microbios en el agua, el suelo y los alimentos, del tipo de ensayo descrito en este estudio puede proporcionar información valiosa para mejorar la comprensión de las infecciones causadas por patógenos ambientales. Además, los datos de anticuerpos salivales obtenidos de tales estudios se pueden usar para mejorar los modelos de evaluación de riesgos 19-22.
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Protocolo
Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 08 a 1844, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) para la recogida de muestras de saliva crevicular con hiperestimulación de los bañistas en la playa de Boquerón, Puerto Rico, como parte de los Estados Unidos Agencia de Protección ambiental (EPA) Epidemiológica Nacional y Evaluación ambiental del recreativas (neear) Estudio del agua 23 para evaluar las exposiciones y enfermedades asociadas natación. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado y fueron instruidos en el uso del dispositivo de recogida de saliva por la USEPA contratistas capacitados. Las muestras de saliva fueron enviadas en hielo y, a la recepción, se centrifugaron y se almacenaron a -80 ° C como se describe 4.
1. La activación del grano
- Volver a suspender las poblaciones conjunto de microesferas por agitación y sonicación durante 20 segundos y la transferencia de aproximadamente 5,0 x 10 6 de las cuentas de valores (400 l) a tubos de microcentrífuga.
Nota: TLas cuentas se le suministra a una concentración de 12,5 x 10 6 perlas / ml. - Sedimentar las cuentas de valores por centrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas sedimentadas en 100 l de agua destilada (dH2O) por vortex y sonicación durante 20 segundos. Repita el paso 1.2.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las perlas lavadas en 80 l de fosfato monobásico de sodio 100 mM, pH 6.2 por vortex y sonicación durante 20 seg.
- Inmediatamente antes de su uso, hacer una solución de 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mediante la adición de 200 l de dH2O de 10 mg de sulfo-NHS alícuota. Mezclar por vórtice.
- Añadir 10 l de la 50 mg / ml de Sulfo-NHS a las perlas. Mezclar por vórtice.
- Inmediatamente antes de su uso, hacer una 50 mg / ml de 1-etil-[3dimethylaminopropyl] carbodiimida solución (EDC) mediante la adición de 200 l de agua destilada (dH2O) a la alícuota de 10 mg de EDC. Mezclar por vórtice.
- Añadir 10 l de 50solución mg / ml EDC a las perlas. Mezclar por vórtice. Se incuban las perlas durante 20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad, con mezcla por vórtice a intervalos de 10 min. Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 250 l de ácido 2- mM 50 [N morfolino] etanosulfónico (MES), pH 5,0 por vortex y sonicación durante 20 seg.
- Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
- Repita los pasos 1.9 y 1.10.
Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con MES 50 mM, pH 5,0. - Resuspender las perlas en 100 l de MES 50 mM, pH 5.0 por vortex y sonicación durante 20 seg.
2. El acoplamiento del grano
- Pareja los antígenos a los conjuntos de microesferas utilizando las concentraciones mostradas en la Tabla 1.
- Añadir cada antígeno a las perlas activadas y llevar el volumen total a 500 l en MES 50 mM, pH 5,0. Mezclar los antígenos de unaperlas d por vórtice.
- Incubar los antígenos y los granos para las 2 horas con mezcla por rotación (~ 15 rpm) a temperatura ambiente en la oscuridad. Sedimentar las perlas acopladas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) -bovine albúmina de suero (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sodio al azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vortex y sonicación. Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min y separar el sobrenadante.
Precaución: La azida de sodio es un producto químico muy tóxico. Es fatal si se ingiere o entra en contacto con la piel. No respirar el polvo / el humo / el gas / la niebla / los vapores o el aerosol. Use equipo de protección personal adecuado (PPE) al manipular y desechar de acuerdo con las leyes apropiadas. - Resuspender las perlas en 1 ml de PBS-TBN por vortex y sonicación durante 20 seg.
- Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
- Repita los pasos 2.5 y 2.6.
Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con PBS-TBN. - Resuspender las perlas acopladas y se lavaron en 1 ml de PBS, 1% de BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Almacenar las perlas acopladas en un refrigerador C 2-8 ° en la oscuridad.
3. Contador del grano
- Preparar una dilución 1:10 de las perlas acopladas en agua o tampón PBS.
- Carga de 10 l de la dilución de la gota sobre un hemocitómetro en el punto de introducción de la muestra.
- Contar las perlas visto en uno de los 4 x 4 rejillas de esquina. Calcular el número total de perlas acoplaron usando la siguiente fórmula: Count (1 esquina de 4 x 4 grid) x (1 x 10 4) x (factor de dilución) x resuspensión volumen en ml.
4. Confirmación de antígeno de acoplamiento
- Resuspender la mezcla social de perlas acopladas a antígenos de interés por vortex y sonicación durante 20 seg.
- Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una finalconcentración de 100 cuentas / l de cada perla única establecido en tampón de PBS-1% de BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).
- Preparar al menos 7 dos veces diluciones en serie de IgG anti-especie de anticuerpo primario de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en placa de 96 pocillos de fondo redondo con tampón de PBS-1% BSA.
- Pre-humedecer una columna de 8 pocillos separada (8 filas) de una placa de fondo de filtro de 96 pocillos para cada antígeno prueba de confirmación de acoplamiento con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Añadir 50 l de mezcla de glóbulos de trabajo (perlas de antígenos acoplados a) a los pocillos pre-mojado.
- Añadir 50 l de diluciones de anticuerpos a las filas 1-7 de cada columna de la placa de filtro de 96 pocillos y 50 l de tampón BSA PBS-1% a la fila 8, en lugar de anticuerpo diluido para servir como pozos de fondo. Mezclar con una pipeta multicanal pipeteando arriba y abajo 5 veces. Realice el mismo procedimiento para cada conjunto de microesferas antígeno acoplado a confirmarse.
- Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambienteratura durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío.
- Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repita 1x. Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
- Diluir con biotina anti-especie anticuerpo de detección secundario IgG específica de 16 g / ml en PBS-1% BSA.
- Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo pipeteando arriba y abajo 5 veces.
- Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
- Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
- Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA.
- Añadir 50 l de reportero a cada pocillo y mezclar pipeteando arriba y abajo 5 veces.
- dosobre la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
- Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29.
Nota: Los resultados del inmunoensayo multiplex basado en perlas se miden en la intensidad de fluorescencia media (MFI). Consulte siempre a la última versión del manual de software, si está disponible para evitar errores.
5. salival Multiplex Inmunoensayo
- Retire la saliva del congelador a -80ºC y permitir que se descongele a temperatura ambiente.
- Resuspender el antígeno acoplado stocks de talón por vortex y sonicación durante 20 seg.
- Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una concentración final de 100 granos / l de cada conjunto de microesferas único en PBS-BSA 1% de tampón.
- Preparar una dilución 1: 4 de saliva wITH tampón PBS-BSA al 1% en un 96 pocillos, placa de pozo profundo.
- placa de filtro pre-mojado con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío.
- Añadir 50 l de una mezcla de glóbulos de trabajo y un volumen igual de saliva diluida a 95 pocillos de las placas de filtro de 96 pocillos para un 1: dilución final 8. Mezclar reacciones con una pipeta multicanal. Para el control del pozo, se añaden 50 perlas de antígenos acoplados a más 50 l l de PBS-1% de BSA (tampón como un sustituto de la saliva).
- Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
- perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
- Diluir anti-humano IgG anticuerpo de detección secundario de cabra biotinilado a 16 g / ml en PBS-1% BSA.
- Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo y mezclar el contenido conuna pipeta multicanal.
- Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
- perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
- Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA.
- Añadir reportero 50 l a cada pocillo y mezclar con una pipeta multicanal.
- Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
- Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29.
Nota: Los resultados del inmunoensayo múltiplex se miden en unidades de mediana intensidad de fluorescencia (IMF). Siempre consultela última versión del manual de software, si está disponible, para evitar errores.
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Resultados
Un conjunto de microesferas único se utilizó como control para medir la unión no específica y una muestra a la variabilidad. Estas perlas se trataron de forma idéntica a las perlas de antígeno junto con la excepción de que no se incubaron con cualquier antígeno en la etapa de acoplamiento. valores de MFI> 500 obtenidos a partir de las bolas de control incubadas con todas las muestras de saliva fueron retirados de los nuevos análisis debido a la sospecha de una contaminación a partir d...
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Discusión
Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o múltiples...
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Divulgaciones
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo de financiar y gestionar la investigación descrita aquí. Ha sido sometido a revisión administrativa del Organismo y aprobado para su publicación. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye una aprobación o recomendación para su uso.
Agradecimientos
Clarissa Curioso fue apoyada a través de un nombramiento en el Programa de Participación en Investigación de la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de EE. UU. y la EPA de EE. UU.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment and Software | |||
| Microcentrífuga | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Se utiliza para centrifugar muestras |
| Mezclador de vórtice | VWR | G560 | Se utiliza para mezclar muestras |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Se utiliza para separar perlas |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Varios | |
| Hemacitómetro (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Se utiliza para contar perlas acopladas |
| Colector de vacío multipantalla | Millipore | MSVMHTS00 | Se utiliza en las etapas de lavado para eliminar el sobrenadante |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Se utiliza para agitar las perlas durante las incubaciones Gradilla |
| tubos (1,5 ml y 0,5 ml) (surtido) | VWR | 30128-346 | |
| Báscula de pesaje | Mettler u otra | Se utiliza para medir los reactivos de lavado para la fabricación de tampones | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Se utiliza durante la etapa de incubación de acoplamiento |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos | |
| Luminex Analyzer con el software xPonent 3.1 | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrumento y software utilizados para ejecutar |
| fuerte.1 Virus de Norwalk: partícula p | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: partícula p | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg. |
| Virus de la hepatitis A: concentrado de grado II de cultivo celular | Meridian Life Sciences | 8505 | Antígeno acoplado a 100 y micro; g |
| Helicobacter pylori: lisado | Meridian Life Sciences | R14101 | Antígeno acoplado a 25 µ g |
| Toxoplasma gondii: p30 recombinante (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antígeno acoplado a 25 µ g |
| Campylobacter jejuni: células enteras muertas por calor | KPL | 50-92-93 | Antígeno acoplado a 50 & micro; g |
| Anticuerpos primarios | |||
| (CCHMC)* | NA | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento | |
| Anti-Hepatitis A de ratón IgG Meridian | Life Sciences | C65885M | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| Ratón anti-Hepatitis A | IgG Meridian Life Sciences | C65885M | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| Anticuerpo purificado BacTraceAffinity contra Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| de pAb de cabra a Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| BacTrace Cabra anti-Campylobacter especie | KPL | 01-92-93 | Se utiliza para la confirmación |
| del acoplamientoSecundario"... Anticuerpos | |||
| Biotina-SP-Conjugado AffiniPure Donkey anti-Cabra IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Utilizado para la confirmación |
| acoplamiento Biotinilado Conejo anti-Cabra IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Utilizado para la confirmación del acoplamiento |
| Biotinilado Cabra anti-Ratón IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Se utiliza para la confirmación |
| del acoplamientoAnticuerpo purificado de afinidad Biotina marcada con cabra anti-conejo IgG (H + L) | KPL | 176-1506 | Utilizado para la confirmación de acoplamiento |
| Consumibles< / fuerte> | |||
| 1,5 ml de tubos de microcentrífuga de copolímero USA | Scientific | 1415-2500 | Utilizados como tubos de microcentrífuga de baja unión |
| 10 y micro; l recambios de punta de pipeta | BioVentures | 5030050C | |
| 200 y micro; l recambios de punta de pipeta | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 y micro; l recambios de punta de pipeta | BioVentures | 5130140C | |
| Papel de aluminio | Varios proveedores | utilizados Mantenga las perlas en la oscuridad durante las incubaciones | |
| Placas de pozos profundos | VWR | 40002-009 | Se utiliza para diluir muestras de saliva |
| Placas de filtro multipantalla | Millipore | MABVN1250 | Se utiliza para realizar ensayos |
| Sistema de recolección de saliva Oracol | Malvern Medical Desarrollos Limitado | Se utiliza para la recolección | |
| de saliva < | |||
| perlas | Los antígenos se acoplan a las microesferas | ||
| EDC (clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]Pierce | 77149 o 22980 | Utilizado en la activación | |
| de perlasSulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) | Pierce | 24510 | Utilizado en la activación de perlas |
| Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml) | Sondas moleculares | S-866 | Utilizado como MES reportero |
| (ácido 2-[N-Morpholino]etanosulfónico) | Sigma | M-2933 | Utilizado para el acoplamiento |
| Tween-20 (Polioxietilenosorbitán monolaurato) | Sigma | P-9416 | Se utiliza en el tampón de lavado para eliminar |
| tampones de proteínas < fuerte > no específicos< / tampón > | |||
| fuertePBS-TBN (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)* | *Filtro Esterilizar y almacenar a 4 grados; C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Azida de sodio (0.05% azida)** | Sigma | S-8032 | **Precaución: La azida de sodio es extremadamente tóxica. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use EPP apropiados. Deséchelo de acuerdo con las leyes aplicables. |
| MES/Tampón de acoplamiento (0,05 M MES, pH 5,0) | |||
| MES (ácido etansulfónico 2-[N-morfolino] | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| ensayo fuerte (PBS, 1% BSA, pH 7,4) | Filtro Esterilizar y almacenar a 4 &°; C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| activación fuerte (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filtro Esterilizar y almacenar a 4 & grados; C | ||
| NaH2PO4 (Fosfato de sodio, monobásico anhidro) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| lavado fuerte (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filtro Esterilizar y almacenar a 4 & grados; C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
Referencias
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