En el clima actual de escasez de recursos, están surgiendo nuevas tecnologías que permiten a los investigadores realizar estudios más baratos, más rápidos y con más precisión. En este trabajo describimos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales basado en perlas para medir la exposición humana a múltiples patógenos ambientales simultáneamente.
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Artículo de método
El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales
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Resumen
Resumen
La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.
Introducción
Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede a....
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Protocolo
Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 08 a 1844, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) para la recogida de muestras de saliva crevicular con hiperestimulación de los bañistas en la playa de Boquerón, Puerto Rico, como parte de los Estados Unidos Agencia de Protección ambiental (EPA) Epidemiológica Nacional y Evaluación ambiental del recreativas (neear) Estudio del agua 23 para evaluar las exposiciones y enfermedades asociadas natación. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado y fueron instruidos en el uso del dispositivo de recogida de saliva por la USEPA contratistas ca....
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Resultados
Un conjunto de microesferas único se utilizó como control para medir la unión no específica y una muestra a la variabilidad. Estas perlas se trataron de forma idéntica a las perlas de antígeno junto con la excepción de que no se incubaron con cualquier antígeno en la etapa de acoplamiento. valores de MFI> 500 obtenidos a partir de las bolas de control incubadas con todas las muestras de saliva fueron retirados de los nuevos análisis debido a la sospecha de una contaminación a partir d.......
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Discusión
Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o múltiples.......
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Divulgaciones
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo de financiar y gestionar la investigación descrita aquí. Ha sido sometido a revisión administrativa del Organismo y aprobado para su publicación. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye una aprobación o recomendación para su uso.
Agradecimientos
Clarissa Curioso fue apoyada a través de un nombramiento en el Programa de Participación en Investigación de la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de EE. UU. y la EPA de EE. UU.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment and Software | |||
| Microcentrífuga | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Se utiliza para centrifugar muestras |
| Mezclador de vórtice | VWR | G560 | Se utiliza para mezclar muestras |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Se utiliza para separar perlas |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Varios | |
| Hemacitómetro (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Se utiliza para contar perlas acopladas |
| Colector de vacío multipantalla | Millipore | MSVMHTS00 | Se utiliza en las etapas de lavado para eliminar el sobrenadante |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Se utiliza para agitar las perlas durante las incubaciones Gradilla |
| tubos (1,5 ml y 0,5 ml) (surtido) | VWR | 30128-346 | |
| Báscula de pesaje | Mettler u otra | Se utiliza para medir los reactivos de lavado para la fabricación de tampones | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Se utiliza durante la etapa de incubación de acoplamiento |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos | |
| Luminex Analyzer con el software xPonent 3.1 | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrumento y software utilizados para ejecutar |
| fuerte.1 Virus de Norwalk: partícula p | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: partícula p | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg. |
| Virus de la hepatitis A: concentrado de grado II de cultivo celular | Meridian Life Sciences | 8505 | Antígeno acoplado a 100 y micro; g |
| Helicobacter pylori: lisado | Meridian Life Sciences | R14101 | Antígeno acoplado a 25 µ g |
| Toxoplasma gondii: p30 recombinante (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antígeno acoplado a 25 µ g |
| Campylobacter jejuni: células enteras muertas por calor | KPL | 50-92-93 | Antígeno acoplado a 50 & micro; g |
| Anticuerpos primarios | |||
| (CCHMC)* | NA | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento | |
| Anti-Hepatitis A de ratón IgG Meridian | Life Sciences | C65885M | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| Ratón anti-Hepatitis A | IgG Meridian Life Sciences | C65885M | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| Anticuerpo purificado BacTraceAffinity contra Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| de pAb de cabra a Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Se utiliza para la confirmación del acoplamiento |
| BacTrace Cabra anti-Campylobacter especie | KPL | 01-92-93 | Se utiliza para la confirmación |
| del acoplamientoSecundario"... Anticuerpos | |||
| Biotina-SP-Conjugado AffiniPure Donkey anti-Cabra IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Utilizado para la confirmación |
| acoplamiento Biotinilado Conejo anti-Cabra IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Utilizado para la confirmación del acoplamiento |
| Biotinilado Cabra anti-Ratón IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Se utiliza para la confirmación |
| del acoplamientoAnticuerpo purificado de afinidad Biotina marcada con cabra anti-conejo IgG (H + L) | KPL | 176-1506 | Utilizado para la confirmación de acoplamiento |
| Consumibles< / fuerte> | |||
| 1,5 ml de tubos de microcentrífuga de copolímero USA | Scientific | 1415-2500 | Utilizados como tubos de microcentrífuga de baja unión |
| 10 y micro; l recambios de punta de pipeta | BioVentures | 5030050C | |
| 200 y micro; l recambios de punta de pipeta | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 y micro; l recambios de punta de pipeta | BioVentures | 5130140C | |
| Papel de aluminio | Varios proveedores | utilizados Mantenga las perlas en la oscuridad durante las incubaciones | |
| Placas de pozos profundos | VWR | 40002-009 | Se utiliza para diluir muestras de saliva |
| Placas de filtro multipantalla | Millipore | MABVN1250 | Se utiliza para realizar ensayos |
| Sistema de recolección de saliva Oracol | Malvern Medical Desarrollos Limitado | Se utiliza para la recolección | |
| de saliva < | |||
| perlas | Los antígenos se acoplan a las microesferas | ||
| EDC (clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]Pierce | 77149 o 22980 | Utilizado en la activación | |
| de perlasSulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) | Pierce | 24510 | Utilizado en la activación de perlas |
| Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml) | Sondas moleculares | S-866 | Utilizado como MES reportero |
| (ácido 2-[N-Morpholino]etanosulfónico) | Sigma | M-2933 | Utilizado para el acoplamiento |
| Tween-20 (Polioxietilenosorbitán monolaurato) | Sigma | P-9416 | Se utiliza en el tampón de lavado para eliminar |
| tampones de proteínas < fuerte > no específicos< / tampón > | |||
| fuertePBS-TBN (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)* | *Filtro Esterilizar y almacenar a 4 grados; C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Azida de sodio (0.05% azida)** | Sigma | S-8032 | **Precaución: La azida de sodio es extremadamente tóxica. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use EPP apropiados. Deséchelo de acuerdo con las leyes aplicables. |
| MES/Tampón de acoplamiento (0,05 M MES, pH 5,0) | |||
| MES (ácido etansulfónico 2-[N-morfolino] | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| ensayo fuerte (PBS, 1% BSA, pH 7,4) | Filtro Esterilizar y almacenar a 4 &°; C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| activación fuerte (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filtro Esterilizar y almacenar a 4 & grados; C | ||
| NaH2PO4 (Fosfato de sodio, monobásico anhidro) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| lavado fuerte (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filtro Esterilizar y almacenar a 4 & grados; C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
Referencias
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
