La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Summary

En este trabajo describimos un método inmunoquímico sensible para mapear la distribución espacial de los derivados de oxidación de 5mC basado en el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y la amplificación de la señal de tiramida.

Abstract

La metilación de las bases de citosina (5-metilcitosina, 5mC) que ocurre en los genomas de los vertebrados generalmente se asocia con el silenciamiento transcripcional. La 5-hidroxilmetilcitosina (5hmC), la 5-formilcitosina (5fC) y la 5-carboxilcitosina (5caC) son las bases de citosina modificadas recientemente descubiertas producidas por oxidación enzimática de 5mC, cuyas funciones biológicas siguen siendo relativamente oscuras. Se han empleado una serie de enfoques que van desde técnicas bioquímicas hasta técnicas basadas en anticuerpos para estudiar la distribución genómica y el contenido global de estas modificaciones en varios sistemas biológicos. Aunque algunos de estos enfoques pueden ser útiles para la evaluación cuantitativa de estas formas modificadas de 5mC, la mayoría de estos métodos no proporcionan ninguna información espacial sobre la distribución de estas modificaciones del ADN en diferentes tipos de células, necesaria para la correcta comprensión de sus funciones funcionales. Aquí presentamos un método altamente sensible para la detección inmunoquímica de las formas modificadas de citosina. Este método permite la codetección de estas marcas epigenéticas con marcadores de linaje de proteínas y puede emplearse para estudiar su localización nuclear, contribuyendo así a descifrar sus posibles funciones biológicas en diferentes contextos experimentales.

Introduction

La metilación de las bases de citosina en el ADN (5mC) representa una importante marca epigenética encontrado en los vertebrados genomas asociados con silenciamiento transcripcional ^1. 5mC está siendo introducido y mantenido por metiltransferasas de ADN ^{de 2-5,} y se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en una serie de procesos biológicos incluyendo la impronta genómica, la inactivación del cromosoma X, la diferenciación celular, y desarrollo ^{3, 6.} En consecuencia, la interrupción de patrones genómicos 5mC se asocia con una serie de enfermedades ^{7, 8-11.} A pesar de los avances en la comprensión de papel 5mC en el desarrollo y la enfermedad, todavía se siguen en gran medida se desconoce cómo se va a quitar esta marca en el desarrollo y tejidos adultos. Recientemente se han propuesto varios mecanismos potenciales de la desmetilación de ADN que incluye mecanismos activos y pasivos de desmetilación ^{12, 13, 14, 15.} El descubrimiento de los productos de la oxidación secuencial 5mC mediadas a las diez y 11 Enzym translocaciónES (Tet1 / 2/3), tales como 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), y 5-carboxylcytosine (5caC) en eucariotas ADN ^{16, 17, 18, ​​19} especulaciones impulsó si pueden servir como intermedios de procesos de desmetilación de ADN o marcas epigenéticas actúan como estables en su propio derecho ^13. Mientras que la demostración de que el componente de reparación por escisión de base, glicosilasa timina-ADN (TDG) se puede unir y eliminar tanto 5FC y 5caC de ADN ^{19, 20} sugiere un papel para los derivados de 5mC modificados en una desmetilación de ADN activo. La evidencia reciente que demuestra que 5FC / 5caC puede modular la velocidad de los puntos de procesividad de ARN II a la posible participación de estas marcas en la regulación transcripcional ^29. Debido a este potencial importancia biológica de las formas oxidadas de 5mC, una gama de técnicas bioquímicas y de anticuerpos basado se han empleado para el estudio de su distribución genómica y contenido global ^{16, 19-24.}

Dado que la mayoría de tél vertebrado órganos consisten en diferentes tipos de células y que la distribución de las bases de citosina modificada es de tejido y de tipo celular específico ^{16 a 18, 20, 23, 25 a 27,} la determinación de la distribución espacial de los derivados oxidados 5mC en diferentes tejidos se convierte en un importante experimental tarea necesaria para desvelar sus funciones biológicas. La mayoría de los enfoques bioquímicos y de anticuerpos basados ​​no proporcionan ninguna información espacial sobre la distribución de las formas modificadas de 5mC en diferentes tejidos y tipos celulares. En contraste, las técnicas basadas en inmunoquímica pueden proporcionar una herramienta rápida para la evaluación de la distribución espacial y la localización nuclear de 5mC ²⁸ y sus derivados oxidados ^20. Lo que se dice, el comunicado muy baja abundancia de 5FC (20 de cada 10 ⁶ citosina) y 5caC (3 de cada 10 ⁶ citosina) en el genoma del ratón ¹⁸ representa un reto importante para la inmunoquímica estándar.

Aquí,se describe un método inmunoquímico de alta sensibilidad que proporciona robusto y una detección rápida de la forma oxidada de la citosina en el tejido cerebral de los mamíferos. Mediante la incorporación de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa junto con una etapa de amplificación de la señal, este método evita los desafíos de la detección de las cantidades muy bajas de 5FC y 5caC. Además, esta técnica se puede utilizar para co-detectar las formas modificadas de la citosina con marcadores específicos de linaje, que complementa eficazmente otros enfoques en la aclaración de las funciones biológicas de estas marcas epigenéticas.

Protocol

Todos los procedimientos involucrados en animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de Nottingham junta de revisión ética.

1. Selección de preparación de tejidos adecuados para inmunotinción

1. Generar sección en parafina de tipo salvaje embriones de ratones CD1 y tejidos cerebrales en adultos como se ha descrito previamente ^25. Utilice secciones de tejido cerebral fijos, ya sea con 4% de formaldehído (FA) o el 4% de paraformaldehído (PFA) para inmunotinción método ^25.
   NOTA: El uso de secciones de tejidos embebidos en parafina requiere de-depilación con cera antes del marcaje de anticuerpos. Dado que el tratamiento con 2 - 4 de M de ácido clorhídrico (HCl) empleado en el protocolo para la desnaturalización del ADN no es compatible con la mayoría de las estrategias de recuperación de antígeno, se recomienda el uso de cualquiera de las secciones de micrótomo para criosféricos o co-detección de los derivados de la oxidación de proteínas 5mC marcadores.

2. El desparafinado de parafina secciones de tejido incluidas < / P>

1. En una cabina de seguridad de clase en curso II, lavar la parafina secciones de tejidos embebidos en una jarra Coplin llena de xileno, 2 veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente.
   NOTA: Es importante usar xileno fresco como la eliminación de parafina incompleta puede dar lugar a patrones de tinción inconsistentes.
2. Después de-cera, rehidratar rápidamente las secciones de tejido de lavado consecutivamente en 95, 75, y 50% de etanol durante 10 min cada uno a temperatura ambiente.

3. La fijación y permeabilización de Cryo-micrótomo y las Secciones

1. Fijar las secciones de tejido rehidratadas por su inclusión en cualquiera de hielo frío 4% PFA o 4% FA durante 15 min a RT.
2. Eliminar el exceso de fijador lavando las secciones en PBS (solución salina tamponada con fosfato) durante 5 min a TA.
3. Permeabilizar las secciones de tejido mediante la colocación en un tarro Coplin llena de PBX (0,5% Triton X-100 en PBS) durante 30 min a TA. Eliminar el exceso de PBX lavando las secciones en breve en PBT (0,01% de Tween 20 en PBS).

jove_title "> 4. La inmunotinción para Oxi-5mC Derivados

1. Colocar las secciones permeabilizadas en HCl 2 N durante 60 min a RT para la despurinización del ADN.
   NOTA: Aunque las concentraciones más altas de HCl (por ejemplo, 4 N) conducen a un desnaturalizante del ADN más eficiente, que no son compatibles para la co-detección de oxi-MCS con DAPI.
2. Colocar las secciones en 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) durante 30 min a RT para neutralizar el HCl. Alternativamente, lavar las secciones tres veces durante 5 minutos cada uno en PBS. Se incuban las secciones en PBT durante 5 min a RT.
3. Retirar con cuidado el líquido de la zona que rodea la sección de tejido sin dejar que la sección de tejido se seque por completo en cualquier paso agitando suavemente el portaobjetos. Utilice un bolígrafo barrera hidrofóbica para rodear la sección sin tocar la sección.
   NOTA: La pluma barrera hidrofóbica reduce el volumen de anticuerpo requerido para teñir el tejido y puede permitir múltiples secciones que se tiñeron con diferenanticuerpos t en la misma diapositiva.
4. Incubar las secciones en 100 l de solución de bloqueo (albúmina de suero bovino 10% en PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
   NOTA: Saltarse este paso no afectaría a la eficacia de la tinción de las bases de citosina modificadas.
5. Incubar las secciones de tejido en 100 l de una dilución 1: 5000 de anticuerpo monoclonal de ratón anti-5hmC y una dilución 1: 1000 de anticuerpos policlonales de conejo anti-5caC anticuerpos primarios en solución de bloqueo durante 1 hora a RT en una cámara húmeda. Alternativamente, lleve a cabo la incubación durante la noche a 4 ° C si es necesario.
   NOTA: Las secciones procesadas sin anticuerpos primarios pueden servir como controles negativos adecuados para el procedimiento de tinción. Los 12,5 días después de las secciones del cerebro de embriones murinos coito enriquecidas en 5caC, 5FC y 5hmC ²⁰ se puede utilizar como control positivo.
6. Retire el exceso de anticuerpos mediante el lavado de las secciones en una jarra Coplin llena de PBT tres veces durante 5 minutos cada uno en un politarro lin a TA.
   NOTA: El aumento del volumen de las soluciones de lavado puede reducir la tinción de fondo.
7. Eliminar el exceso de PBT y, si es necesario, rodear las secciones de nuevo con la pluma barrera hidrófoba como PBT contiene detergente que puede debilitar la barrera hidrofóbica.
8. Hacer una dilución 1: 400 de anticuerpo conjugado con HRP de cabra anti-conejo y una dilución 1: 400 de burro anti-ratón de anticuerpo conjugado con 555 en solución de bloqueo.
9. Incubar las secciones de tejido en 100 l de mezcla de anticuerpo secundario de la etapa 4.9 durante 1 hora a RT en una cámara húmeda.
10. Lavar las secciones de tejido en una jarra Coplin llena de PBT tres veces durante 5 minutos cada uno a TA.
11. Colocar las secciones de tejido en 100 l de una dilución 1: 200 de tiramida en el tampón de amplificación de la señal de tiramida por 2 min a TA.
12. Inmediatamente, eliminar la solución tiramida exceso por lavado de los portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno en PBT.
13. cuidadoy eliminar el exceso de PBT y cubrir inmediatamente las secciones con una gota de medio de montaje (ver Lista de Materiales).
14. Con cuidado, coloque un cubreobjetos sobre las secciones de tejido y tapar inmediatamente el cubreobjetos con esmalte de uñas.
15. Almacenar las secciones de tejido a 4 ° C durante varias horas antes del examen microscópico. Examinar bajo el microscopio fluorescente a 405, 488 y / o 555 nm (10 - 40 aumentos).

Results

Para determinar la distribución de 5hmC en secciones de tejido de cerebro, se realizó co-detección de esta modificación epigenética con un marcador de neuronas post-mitóticas, NeuN, empleando anticuerpos 5hmC contra comercial que interactúa específicamente con esta marca, pero no con otras formas de modificado citosina ^{20, 25.} el análisis inmunohistoquímico de las distribuciones 5hmC y 5caC en el cerebro adulto reveló que mientras que el prominente tinción 5hmC co-localiza con células NeuN positivos, células gliales NeuN-negativas poseen niveles más bajos de genómica 5hmC (Figura 1) ^20.

Recientemente, hemos mostrado que la oxidación 5mC Tet-dependiente es operativa durante la especificación linaje de células madre neurales (NSC) ^20. A pesar de ser inmunoquımicamente indetectable en NSCs, 5FC y 5caC muestran inmunotinción prominente en las primeras etapas de la diferenciación neuronal NSCs hacia una nd linajes gliales. Tanto estas marcas transitoriamente acumulan simultáneamente con aspecto de los marcadores de diferenciación neuronal temprana y glial ^20. Para determinar la distribución de 5caC en la diferenciación de NSCs hemos realizado co-tinción de esta marca con un marcador GFAP glial en los cultivos fijados de NSCs a los 3 días de la inducción de la diferenciación glial. A diferencia de los comités directivos nacionales o astrocitos maduros (datos no mostrados), se observó una fuerte señal de 5caC en proporción relativamente grande de las células que expresan GFAP en estos cultivos (Figura 2) ^20.

Se muestra la Figura 1. Co-inmunotinción de 5hmC (verde) con NeuN (rojo) en el tejido cerebral en adultos de contraste con DAPI (azul). Los canales individuales y la vista fusionada. Las barras de escala son 25 micras.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Co-inmunotinción de 5caC con GFAP en la Cultura de la NSC en el Día 3 de diferenciación glial. Los canales individuales y la vista fusionada se muestran. Las barras de escala son de 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aunque el reportado baja abundancia de los derivados de oxidación 5mC, 5FC y 5caC en algunos tejidos presentaría limitaciones significativas para un protocolo inmunoquímica estándar, la incorporación de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa permitió la detección de estas modificaciones de citosina en tejidos fijados y las células (Figura 2) . Sin embargo, el tiempo óptimo de incubación con la solución de tiramida debe ser optimizado experimentalmente para cada lote individual de tiramida kit de amplificación de señal, donde se observa una relación lineal entre la intensidad de la señal y la duración de la señal de amplificación basado tiramida, para más detalles se refiere a Almeida et al. 2012 ²⁶ . Además, la relación señal / fondo se puede mejorar significativamente mediante la realización de los lavados en un tarro Coplin para permitir la eliminación eficaz de exceso de anticuerpos. Después de la incubación con solución de tiramida, es importante para detener inmediatamente la reacción por lavado en solución PBT a dtinción de fondo ecrease. Es muy importante no permitir que las secciones se sequen en cualquier momento durante el procedimiento.

La eficiencia de la despurinización del ADN puede mejorarse llevando a cabo la reacción despurinación a 37 ° C. Durante el uso de HCl 4 N en lugar de 2 N mejora la tinción de las formas modificadas de 5mC utilizando HCl 4 N para la despurinización de ADN no permitiría co-tinción con DAPI, ya que interactúa exclusivamente con el ADN de doble cadena.

Aunque esta técnica puede proporcionar robusto evaluación semi-cuantitativa de las formas modificadas de las bases de citosina donde detectable, no se puede utilizar para la evaluación de los niveles absolutos de 5mC o sus derivados de oxidación. Por lo tanto, se recomienda el uso de otros enfoques complementarios pero cuantitativo ^{16, 19 -24.} Desde el descubrimiento de los derivados de oxidación 5mC en los genomas de mamíferos, varios enfoques han sido desarrollados para estudiar sus funciones biológicas ^{16, 19-24.} Aunque estos approaches pueden ser útiles en la determinación de los niveles absolutos de los derivados de oxidación 5mC, que no proporcionan información sobre su distribución espacial ^{20, 26.} Hemos utilizado con éxito el método descrito aquí para cartografiar la distribución espacial y la localización de los derivados de oxidación 5mC en diferentes tipos de células del cerebro en desarrollo y adultos ²⁰

Al revelar su distribución espacial ^20, esta técnica puede ser crucial para la comprensión de las implicaciones biológicas y el destino de los derivados oxidados de 5mC en varios contextos biológicos, donde estos derivados modificados de 5mC se pueden detectar incluyendo celular diferenciación, el desarrollo y la enfermedad. Además, el método como se describe aquí puede dar evaluaciones semi-cuantitativas de los derivados oxidados de 5mC en diferentes tejidos mediante la evaluación de la cinética de la reacción de la peroxidasa (que es proporcional a la intensidad de la tinción) a diferentes tiempos de incubación con tyramide ^26.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tarro Coplin	Cole-Parmer	UY-48585-30	Xileno
			Úselo solo en el gabinete de seguridad de Clase II
Tampón de fosfato salino (PBS)	Fisher Scientific	12821680	pH 7.5, filtrado antes
de usar 4% de paraformaldehído (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Una vez hecho se puede almacenar a -20 ° C en alícuotas durante varios meses
4% de formaldehído  (FA)	Sigma Aldrich	F8775	Una vez hecho se puede almacenar a -20 ° C en alícuotas durante varios meses
Etanol, anhidro desnaturalizado, grado histológico	Sigma Aldrich	64-17-5	95, 75, 50% en PBS
0.01% Tween 20 en PBS	Sigma Aldrich	P9416	PBT
0.5% Triton X-100 en PBS	Sigma Aldrich	X100	PBX
2 N HCl	Sigma Aldrich	71826	precaución extremadamente tóxico
100 mM Tris-HCl	Promega	H5121	pH ajustado a 8,5
Pluma de barrera hidrofóbica	Abcam	ab2601	para inmunohistoquímica
Cámara de humedad de portaobjetos	Scientific Device Laboratory	197-BL
anticuerpo anti-5mC para ratones	Diagenode	C15200081	anticuerpo primario monoclonal
Anticuerpo anti-5hmC	Active Motif	39791	conejo policlonal anticuerpo primario
Anticuerpo anti-5caC	Active Motif	61225	conejo policlonal anticuerpo primario
conjugado con peroxidasa anticuerpo secundario anti-conejo	Dako	K1497
555-congjuado anticuerpo anti-ratón de cabra	Sondas moleculares	A-11005	anticuerpo secundario
10% BSA	Sigma Aldrich	A9418	Solución de bloqueo
22 x 32 mm Deslizamientos de cubierta de vidrio	BDH	406/0188/24
Sistema de amplificación de señal de tiramida	Perkin Elmer	NEL741001KT	Se pueden utilizar otros anticuerpos secundarios conjugados con fluoroccomas para la detección conjunta de oxi-5mC
Medio de montaje con DAPI	Vector Labs	H-1200
Esmalte
policlonal anticuerpo policlonal anticuerpo policlonal anti-GFAP	Thermo Scientific	PA5-18598	dilución 1:400
anticuerpo monoclonal anti-NeuN de ratón Merck	milipore	MAB377B	dilución 1:400