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Artículo de método

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

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DOI:

10.3791/54421

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18 de septiembre de 2016

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1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

En este artículo

Resumen

En este modelo de colitis impulsada por antígenos, las células T CD4+ OT-II que expresan una proteína fluorescente roja se transfirieron adoptivamente a ratones RAG-/- que expresan una proteína fluorescente verde en fagocitos mononucleares (MP). Los huéspedes fueron desafiados con Escherichia coli (E. coli) que expresa la proteína ovoalbúmina (OVA) fusionada con una proteína cian fluorescente (CFP).

Resumen

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una inflamación crónica que afecta al tracto gastrointestinal (TGI). Una de las mejores formas de estudiar los mecanismos inmunológicos implicados durante la enfermedad es el modelo de transferencia de células T de la colitis. En este modelo, los ratones inmunodeficientes (receptores de RAG-/-) se reconstituyen con células T CD4+ vírgenes de huéspedes sanos de tipo salvaje.

Este modelo permite examinar los eventos inmunológicos más tempranos que conducen a la enfermedad y la inflamación crónica, cuando la inflamación intestinal se perpetúa pero no depende de un antígeno definido. Para estudiar el papel potencial de las células presentadoras de antígenos (APC) en el proceso de la enfermedad, es útil contar con un modelo de enfermedad impulsado por antígenos, en el que un antígeno derivado de un comensal definido conduce a la colitis. Por lo tanto, se ha desarrollado un modelo de colitis impulsada por antígenos. En este modelo, las células T CD4+ OT-II, que solo pueden reconocer epítopos específicos en la proteína OVA, se transfieren a huéspedes RAG-/- desafiados con E. coli que expresa CFP-OVA. Este modelo permite examinar las interacciones entre las APC y las células T en la lámina propia.

Introducción

El intestino es la mayor superficie del cuerpo que está expuesta al ambiente externo. matrices extensas de microbios residentes colonizan el intestino humano para formar la microbiota intestinal (o microflora). Se estima que esto constar de hasta 100 billones de células microbianas y constituye uno de los hábitats bacterianas más densamente poblados conocidos en la biología 1-3. En el GIT bacterias colonizan un nicho intestinal donde sobreviven y se multiplican 4. A cambio, la microbiota dota a la máquina con características funcionales adicionales no codificadas en su genoma 1. Por ejemplo, la microbiota estimula la proliferación de las células epiteliales, produce vitaminas que alberga no puede producir por sí mismos, regula el metabolismo y protege contra patógenos 4-6. Dada esta relación beneficiosa, algunos autores han sugerido que los humanos son "súper-organismos" o "holobionts" que son una mezcla de genes bacterianos y humanos 7,8. Dado el impacto beneficioso de la microbiota en el host (humana), el sistema inmune intestinal necesita para tolerar los microbios comensales para permitir su existencia en la luz, sino también matar a los patógenos que invaden desde el lado luminal 9-11. El sistema inmune intestinal ha desarrollado mecanismos para distinguir entre los microbios inofensivos luminales y potencialmente dañinos; sin embargo, estos mecanismos no están todavía bien entendidas 12. El mantenimiento de la integridad intestinal requiere una homeostasis inmune estrechamente regulado para mantener el equilibrio entre la tolerancia y la inmunidad 13. Un desequilibrio en la homeostasis inmune contribuye a la inducción de enfermedades intestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) 3,14.

Hay dos tipos principales de IBD: la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC). Los pacientes con estas enfermedades por lo general sufren de sangrado rectal, diarrea y dolor abdominal 15,16. La causa de la EII es todavíadesconocido, pero una combinación de factores genéticos, factores ambientales y las respuestas inmunes dysregulated podría ser el evento clave para el desarrollo de la enfermedad 15.

Los modelos animales de EII se han utilizado durante más de 50 años. En las últimas décadas nuevos sistemas modelo de EII se han desarrollado para probar las diversas hipótesis relativa a la patogénesis de la EII 17,18. El modelo mejor caracterizado de colitis crónica es el modelo de transferencia de células T que induce la interrupción de la homeostasis de células T 19,20. Este modelo implica la transferencia de células T vírgenes de ratones inmunocompetentes en huéspedes que carecen de T y células B (como RAG - / - y ratones SCID) 16,21. El desarrollo de la enfermedad en este modelo se supervisa durante 3-10 semanas mediante la evaluación de la presencia de diarrea, la reducción de la actividad física, y la pérdida de peso corporal. Esto se llama así el síndrome de desgaste 16. En comparación con los ratones sano el tejido del colon de los ejércitos trasplantados es Thicker, más corto y más pesado 16. Usando el modelo de transferencia de células T, es posible comprender cómo los diferentes poblaciones de células T pueden contribuir a la patogénesis de la EII 22. El modelo de transferencia de células T no analiza las interacciones entre APCs y células T en el proceso de la enfermedad de una manera específica de antígeno. Se ha demostrado que la interacción entre las células mieloides y células linfoides podría ser responsable del desarrollo de la inflamación intestinal 23. Aunque no se han aclarado muchos aspectos de la EII, los eventos iniciales que conducen al desarrollo de la enfermedad todavía tienen que ser claramente entendido.

Se ha demostrado que, en ausencia de colitis transferencia microbiota no se puede establecer 24. Recientemente, varias teorías sugieren que la EII podría ser el resultado de una respuesta inmunitaria contra bacterias comensales 25. también han propuesto Autores que las bacterias comensales son esenciales para inducir la inflamación en el intestino distal26. En libre de gérmenes (GF), los animales del sistema inmunitario intestinal es generalmente deteriorada 27,28, pero una colonización de estos ratones con una mezcla de específico libres de patógenos bacterias resultados en el desarrollo del sistema inmunitario intestinal totalmente competente 29. Por lo tanto, la microbiota parece ser un elemento clave en la patogénesis de la EII, ya sea como un mecanismo que predispone a o protege contra el desarrollo de la inflamación intestinal 30,31. Las teorías actuales sugieren que la EII es el resultado de un desequilibrio microbiano, llamada disbiosis, en pacientes predispuestos genéticamente 32, pero no es claro aún si el disbiosis es la causa o la consecuencia de la enfermedad 12. Teniendo en cuenta el papel de los microorganismos en el desarrollo de la EII, en experimentos in vitro mostraron que las células T CD4 + se pueden activar por APCs pulsadas con bacterias intestinales 33,34.

Por otra parte, se ha demostrado que los antígenos dediferentes especies de bacterias comensales, tales como E. coli, Bacteroides, Eubacterium y Proteus, son capaces de activar células T CD4 + 35. Esto indica que la presentación de antígenos bacterianos a las células T es de importancia para el desarrollo de la EII. Para reducir la complejidad de múltiples antígenos derivados por la microflora en el proceso de la enfermedad, una cepa de E. coli ha sido creado que produce el antígeno OVA. La colitis transferencia fue inducida por la inyección de células T específicos de OVA en RAG - / - animales colonizados con OVA-expresión de E. coli.

Este modelo se basa en la evidencia reciente sugiere que la CX 3 CR1 + parlamentarios, un subconjunto de células importante en la lámina propia del colon (CLP) 36, están interactuando con las células T CD4 + durante la transferencia de la colitis 37. Los diputados de la muestra La luz intestinal para el antígeno de partículas, tales como bacterias, utilizando sus dendritas 36, 38,39. Estudios previosdemostró que los parlamentarios también puede tomar hasta antígenos solubles, tales como OVA, introducidos en el lumen intestinal 40,41. Dada la abundancia de CX 3 CR1 + parlamentarios en el CLP, es posible que estas células pueden degustar las bacterias luminales e interactuar con las células T CD4. Confocal de imágenes de los ratones trasplantados con células T CD4 + específicos de OVA colonizados con E. coli CFP-OVA, muestran que CX 3 CR1 + MPs están en contacto con las células OT-II T CD4 + durante el desarrollo de colitis antígeno impulsado. Este modelo permite el estudio del proceso de la presentación del antígeno entre APCs intestinales y células T específicas únicamente para determinados bacterias que expresan el antígeno en la luz intestinal.

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Protocolo

Los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en las instalaciones de animales de la Universidad de Ulm (Ulm, Alemania). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la utilización de animales local y el comité de cuidado y la Ley Nacional de Protección de los Animales.

1. Construcción del plásmido pCFP-OVA

  1. Amplificar el gen de tamaño OVA completa usando los cebadores Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') y Ova_ClaI_rev (3' GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5 ') 37 utilizando el plásmido pCI-OVA 42 como una plantilla (resistente a la ampicilina). Clonar el producto de PCR (es decir, la secuencia que codifica OVA) en un fago mediados de vector disponible en el mercado usando SpeI y ClaI restricciones sitios de los cebadores y vector para producir el plásmido OVA-específico.
  2. Amplificar el gen codificante PPC junto con el promotor constitutivo fuerte P hiper utilizando el plásmido Dap 1 -cCFP (resistente al cloranfenicol) 43 como una plantilla y cebadores CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') y CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Clonar el gen de CFP-codificación en el OVA-plásmido específico (resistente a la ampicilina) usando los sitios de restricción SpeI y SacI de los cebadores y vector 37. Esto introduce un espaciador de 6 residuos de glicina entre el CFP-codificación de la secuencia de OVA-codificación.

2. Construcción de E. coli pCFP-OVA

  1. Crecer E. coli cepa DH10B en 100 ml de Luria Bertani (LB) aeróbicamente a 37 ° C en un agitador rotatorio durante la noche.
  2. Mezclar 800 l de cultivo bacteriano con 200 l de glicerol para crear stock de glicerol y se almacena a -80 ° C.
  3. Añadir 50 l de E. coli cepa DH10B de stock de glicerol en 5 ml de medio LB y crecer aeróbicamente a 37 ° C en un agitador rotatorio ovedejarían de.
  4. La transferencia de la cultura en un matraz de 1 L con deflectores Erlenmeyer con 250 ml de medio LB a 37 ° C en un movimiento rotatorio.
  5. Cultivar las bacterias hasta una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,5 y, a continuación enfriar el cultivo en hielo durante 30 min. Centrifugar las bacterias a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  6. Bacterias Resuspender con 100 ml de H2O estéril frío de hielo y centrifugar las bacterias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. bacterias Resuspender con 100 ml de helado de 10% de glicerol y centrifugar las bacterias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este último paso dos veces.
  7. Después de la etapa de lavado final, resuspender las bacterias en 700 l de 10% de glicerol. Congelar 50 ml de alícuotas en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
  8. Descongelar una alícuota de 50 l en el hielo y la transferencia en una cubeta de electroporación previamente enfriada (2 mm de distancia entre electrodos).
  9. Añadir 5 l de ADN de plásmido (100 ng) a la 50 l E. aliquo colits. Realizar electroporación con un solo pulso a 25 mF, 200 ohmios (Ω) y 2,5 kV.
  10. bacterias resuspender en 1 ml pre-calentado medio SOC (/ L de extracto de 5 g de levadura, 2 g / L de triptona, cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2,5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM) y se incuba a 37 ° C aeróbicamente durante 1 hr.
  11. las bacterias de la placa sobre placas de agar LB suplementadas con ampicilina 100 mg / ml (añadir 100 l de una 100 mg / ml de ampicilina social a 100 ml de LB-agar) y se incuba durante la noche aeróbicamente a 37 ° C.
  12. Recoger colonias individuales y las vuelve a la racha en placas de agar LB suplementadas con ampicilina 100 mg / ml. Incubar toda la noche aeróbicamente a 37 ° C.
  13. Recoger colonias individuales y crecer durante la noche en 10 ml de medio LB suplementado con ampicilina 100 mg / ml para el aislamiento del plásmido. Utilice mini kit de preparación de plásmido disponible en el mercado y eluir ADN plásmido con 30 dH l 2 O (agua destilada) de acuerdo con el fabricante; S protocolo. Verificar plásmidos mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN 37,42,43.
  14. Establecer una cultura de clones positivos de E. coli pCFP-OVA en 100 ml de medio LB suplementado con ampicilina 100 mg / ml. Crecer aeróbicamente a 37 ° C durante la noche en un agitador rotatorio.
  15. Mezclar 800 l de cultivo bacteriano con 200 l de glicerol puro y se almacena a -80 ° C.
  16. Centrifugar el resto del cultivo durante la noche a 5000 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y resuspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Colocar 10 l de la suspensión sobre portaobjetos de vidrio y se cubre con un cubreobjetos.
  17. Observar las muestras en un microscopio de fluorescencia estándar para confirmar la expresión de la fluorescencia CFP-OVA (excitación PPC a 450 nm, emisión a 480 nm). Analizar las bacterias comienzan con una ampliación de 400X.
  18. Centrifugar 1 ml de bacterias a partir de cultivos de una noche en 5000 xg durante 10 min, RT. Resuspender el precipitado en 40 l dePBS y hierven a 95 ° C durante 10 min.
  19. Centrifugar las muestras a 30.000 xg durante 10 min y el uso de los sobrenadantes para análisis de transferencia de Western 37. Utilice el anticuerpo policlonal anti-OVA de conejo levantado diluido 1: 400.

3. Generación de OT-II / Ratones Red

  1. Cruzar una hembra de ratón macho / OT-II con un ratón hembra / macho que expresa la proteína fluorescente roja (ambas cepas comercialmente disponible) con el fin de generar los ratones OT-II / Red 37.

El aislamiento de la célula 4. Spleen

  1. La eutanasia a la OT-II / ratones Red por dislocación cervical después de la anestesia por inhalación de cualquier éter halogenado (hasta 5% para la inducción) disponible comercialmente.
  2. Use las tijeras para cortar la parte abdominal superior, izquierda del ratón. En virtud de esta parte abdominal existe el bazo (forma oval con un color rojo oscuro). Use las tijeras y pinzas para quitarla.
    1. Extraer el bazo de los ratones rojos / OT-II y pasarla a través de un 100filtro de células micras coloca en un tubo de 50 ml usando el émbolo de una jeringa de 1 ml con el fin de obtener una suspensión de una sola célula. Se lava el filtro dos veces con 10 ml de PBS suplementado con suero 1% inactivado por calor fetal bovino (FBS).
  3. Centrifugar la suspensión celular a 390 xg durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado con 5 ml de tampón de pre-calentado de lisis (144 mM NH 4 Cl, Tris 17 mM, pH = 7,2) para lisar las células rojas de la sangre. Incubar 10 minutos a 37 ° C.
  4. Lavar la muestra con 25 ml de PBS suplementado con 1% de FBS. Centrifugar a 390 xg durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado en 10 ml de PBS suplementado con 1% de FBS.
  5. Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
    1. Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determine el número medio de células por cuadrado. Las células viables aparecen, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml multiplicar el número de células por el factor de dilución. Si 2-4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.

Enriquecimiento de la célula 5. CD4 + CD62 + T L

  1. Enriquecer células del bazo para las células T CD4 + CD62L + a través de kit de aislamiento magnético utilizando los principios de la selección negativa o positiva. A continuación, utilice la selección negativa para aislar las células T CD4 + y utilizar la selección positiva para enriquecer aún más para el CD62L + población dentro de la reserva de células T CD4 +.
    NOTA: En el procedimiento de selección negativa, las células, las cuales serán no aislados (aquí: Todas las células CD4 negativos) están marcadas con anticuerpos específicos, junto con microperlas magnéticas. Durante el lavado de la columna de los pasos de las células T CD4 + se pasan a través de la columna de modo que puedan ser EASILy recogido. En las células del procedimiento de selección positiva que ser aislado son etiquetados con el anticuerpo apropiado junto con microperlas magnéticas. Durante el lavado de la columna pasos las células marcadas se mantendrán en la columna y se pueden recoger mediante la eliminación de la columna del campo magnético y de enjuagar con el tampón.
  2. Para el procedimiento de selección negativa, resuspender 10 7 células totales del bazo en 40 l de PBS frío suplementado con albúmina de suero bovino 0,5% (BSA). Añadir 10 l de biotina marcado con cóctel de anticuerpos suministrado con el kit de aislamiento magnético (anticuerpos específicos de unión a las células T no CD4 +) y se incuba 15 min en hielo.
    1. Añadir 30 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA y 20 l de microperlas anti-biotina. Incubar 20 minutos en hielo.
    2. Añadir a la muestra 10 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA y centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces. Resuspender las células en 1 ml de PBS frío suplementado con 0,5% BSA.
    3. Colocar la columna específica para el procedimiento de selección negativa en el campo magnético y enjuague con 3 ml de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA en la columna. Añadir la suspensión celular en la columna y lavar 3 veces con 3 ml de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA.
    4. Centrifugar las células del efluente a 390 xg durante 5 min. Paso del efluente a través de la columna contiene células T CD4 + no marcados. Resuspender el precipitado en 1 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA y contar las células.
    5. Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
      1. Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determinar el número medio de células por cuadrado. Las células viables aparecen, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml se multiplican cell número por el factor de dilución. Si 2-4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.
  3. Para el procedimiento de selección positiva, añadir 10 l de microperlas de CD62L por 10 7 fracción de células T CD4 + pre-enriquecido. Incubar 15 minutos en hielo.
    1. Añadir a la muestra 10 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA y centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces. Resuspender en 500 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA.
    2. Colocar la columna específica para el procedimiento de selección negativa en el campo magnético y enjuague con 500 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA en la columna. Añadir la suspensión celular en la columna y lavar 3 veces con 500 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA.
    3. Retirar la columna del campo magnético y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. Añadir 1 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA en la columna y eliminar las células CD4 + T + CD62Ls retenida en la columna presionando firmemente el émbolo en la columna.
      NOTA: Los aislados + células T CD4 + CD62L son ahora listo para aplicaciones posteriores, como los experimentos in vivo. De acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de aislamiento de células CD4 + T + CD62L, las microperlas no son tóxicos. Debido al pequeño tamaño (alrededor de 50 nm), que no se activan las células y no van a saturar epítopos de la superficie celular. Por lo tanto las células aisladas pueden ser transferidos a ratones inmunodeficientes para inducir colitis 37,44,45.
    4. Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
      1. Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determinar el número medio de células por cuadrado. Las células viables appeaR, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml multiplicar el número de células por el factor de dilución. Si 2 - 4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.

6. La inducción de la colitis impulsado por el antígeno

  1. Se inyecta por vía intraperitoneal 3 x 10 5 células T OT-II / rojo CD4 + CD62L en CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones. Para la inducción de la colitis específica de antígeno, administrar E. coli pCFP-OVA cada segundo día a una dosis de unidad de formación de colonias de 1 x 10 8 (CFU) en 100 l de PBS por animal por sonda o instilación oral, detrás de los incisivos.
  2. Supervisar dos veces por semana el peso corporal de los ratones trasplantados y su condición clínica (presencia de sangre en las heces, consistencia de las heces y la actividad de los ratones).

7. Las muestras de tejido para el examen histopatológico

  1. Tomar muestras de tejido de The intestino grueso de los ratones, fijar en formalina tamponada neutra (10%) y de inserción en parafina como se ha descrito previamente 36,46.
  2. Sección las muestras de parafina en un microtomo, se montan en portaobjetos, y llevar a cabo la tinción con 47,48.
  3. Categorizar la histología del intestino grueso según lo publicado anteriormente 47,48: normal (puntuación 0); La colitis leve (puntuación 1), la colitis moderada (puntuación 2) y la colitis severa (puntuación 3).

8. Aislamiento de células de la lámina propia del colon

  1. La eutanasia a los ratones trasplantados por dislocación cervical después de la anestesia por inhalación de cualquier éter halogenado (hasta 5% para la inducción) disponible comercialmente.
  2. Colocar el animal hacia abajo con el vientre hacia arriba. El uso de fórceps para agarrar la piel en sentido anterior a la abertura de la uretra. Use las tijeras para cortar la piel a lo largo de la línea media ventral desde la ingle hasta el pecho. Tire de la piel hacia atrás en los lados.
  3. Corte a través de la pared muscular peritoneal transparente yla apertura de la cavidad corporal. Identificar los dos puntos que va desde el ano hasta el ciego 49. Cortar las 2 extremidades y liberar el tejido de grasa.
  4. Abrir longitudinalmente el colon usando unas tijeras de disección. Utilice unas pinzas para agitar el tejido del colon en una placa de Petri que contiene 25 ml de PBS suplementado con FBS al 1% para eliminar los residuos y las mucosas. Cortar los dos puntos en 5 - 8 mm piezas.
  5. Coloque los segmentos de colon en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml del tampón de lavado. El tampón de lavado contiene 500 ml de DPBS, 10 mM de Hepes y ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA).
  6. Vortex el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
  7. Incubar el tubo con los segmentos de colon en un baño de agua a 37 ° C con 200 rpm agitación durante 10 min.
  8. Después de la incubación, agite el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
  9. Desechar los sobrenadantes y colocar las muestras de tejido en un nuevo tubo de 50 ml que contiene 20 ml del tampón de lavado. Repita los pasos 6-9 tres veces
  10. Desechar los supernatants y colocar las muestras de tejido en una placa de Petri que contiene 25 ml de PBS. Utilice unas pinzas para sacudir suavemente las muestras de tejido en la placa de Petri durante unos segundos para eliminar las células epiteliales residuales. Repita este paso tres veces.
  11. Cortar los tejidos del colon en 2 x 2 mm 2 piezas y digerir por incubación en 10 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio con 0,5 mg / ml de colagenasa tipo VIII de Clostridium histolyticum y 10 U / ml de ADNasa I.
  12. Vortex el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
  13. Incubar los fragmentos de colon en un baño de agua a 37 ° C con agitación 200 rpm durante 35 minutos y agitar el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima cada 5 minutos.
  14. Al final de la incubación vórtice el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
  15. Recoger los fragmentos digeridos pasándolos a través de un filtro de células de 70 micras colocada en un nuevo tubo de 50 ml.
  16. Lavar la muestra mediante la adición de 20 ml de DPBS y centrifugar a 400 g durante 5 min. A continuación, volver a suspender tél células en 1 ml de DPBS.
  17. Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
    1. Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determinar el número medio de células por cuadrado. Las células viables aparecen, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml multiplicar el número de células por el factor de dilución. Si 2-4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.

9. La tinción extracelular de Análisis FCM

  1. Se centrifuga la CLP células 5 min a 390 x g. Resuspender las células en 1 ml de FACS A (PBS suplementado con 1% de BSA y azida sódica al 0,1%)
    NOTA: La azida de sodio es altamente tóxico. Puede causar hipotensión, hipotermia, convulsiones dolor de cabeza o la muerte. Las soluciones diluidas de azida de sodio (00,1 a 1,0%) por lo general no presentan peligros extraordinarias para el usuario, pero son los ojos y de la piel irritantes. Por lo tanto, utilice azida de sodio sólo en el capó química mientras lleva puesto un abrigo de laboratorio y un doble par de guantes de nitrilo desechables.
  2. Se incuban las células durante 15 min a RT con el anticuerpo monoclonal (mAb) 2.4G2 dirigido contra el Fc? RIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 mg de mAb / 10 6 células) diluido en FACS A.
  3. Añadir 200 l de FACS A a las células y centrifugar 5 min a 390 x g. Repita este paso dos veces. Se incuban las células con 0,5 ng / 10 6 células del mAb relevante durante 20 min a 4 ° C. Diluir los anticuerpos en FACS A.
  4. Añadir 200 l de FACS A a las células y centrifugar 5 min a 390 x g. Repita este paso dos veces. Resuspender las muestras en 100 l de FACS A.
  5. Analizar las células T de CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones reconstituidos con células T CD4 rojo en el citómetro de flujo 37 OT-II /.
  6. analizar los datos utilizando el software disponible en el mercado.

Análisis 10. Microscopía Confocal

  1. Analizar el colon de CX 3 CR1 GFP / + ratones reconstituidos o no con OT-II / Red Cell CD4 + T + CD62L y alimentados por vía oral cada dos días con 1 x 10 8 UFC de E. coli cepa DH10B pCFP-OVA.
  2. Extirpar el colon de los ratones usando tijeras y pinzas. Abrir longitudinalmente utilizando unas tijeras de disección.
  3. Corte un pedazo de 5-8 mm de la muestra de colon con unas tijeras, poner en portaobjetos de vidrio y cubrir con cubreobjetos.
  4. Analizar las muestras de colon con un microscopio confocal con una ampliación de 40 / 1,30.
  5. Detectar la CX 3 CR1 + MPs, marcado con proteína fluoresceína verde (GFP), utilizando un conjunto de filtros con excitación a 488 nm y emisión a 509 nm.
  6. Detectar la célula T CD4 + que expresan la proteína rojo utilizando un conjunto de filtros con excitación a 554 nm y emisión a 586 nm.
  7. Detectar E.coli pCFP-OVA utilizando un conjunto de filtros con excitación a 450 nm y emisión a 480 nm.
  8. Definir un área de interés y generar diagramas de dispersión como se ha descrito previamente 50 para llevar a cabo el análisis de co-localización. Utilice 2 fórmulas diferentes: El coeficiente de superposición de acuerdo con Manders y el coeficiente de Pearson.

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Resultados

Para establecer un modelo de colitis antígeno impulsado por una E. coli cepa ha sido construido que contiene un plásmido en el que el gen de la PPC se fusiona a la secuencia codificante para la proteína ovoalbúmina de pollo y la construcción de fusión se expresa bajo el control del promotor constitutivo fuerte P hiper (Figura 1A). Microscopía fluorescente muestra que la E. recombinante coli pCFP-OVA, pero no el pa...

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Discusión

Al igual que con cualquier otro modelo, el modelo de colitis antígeno impulsado descrito anteriormente puede presentar algunos problemas que el investigador realiza la técnica debe tener en cuenta. Cuando se inyecta el AT-II / rojo + T CD4 + CD62L + células en los ejércitos, el investigador debe ser muy suave y cuidado de insertar la aguja en la cavidad peritoneal. El no hacerlo puede resultar en el desgarramiento del intestino del ratón, que podría conducir a la muerte, o una administra...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

JHN cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza (SNSF 310030_146290).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Batido rotativoReiss Laborbedarf e. K.Modelo 3020 GFL
2 mm gap couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulsser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicilinaSigma-AldrichA9393-5G
SOC MedioSigma-AldrichS1797-100ML
Kit de aislamiento de plásmidos de alta purezaRoche 11754777001
AgarosaCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Ácido acético glacialSigma-Aldrich537020 
Cámara de gel PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Colorante de cargaThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo FisherSM0312
Solución de bromuro de etidioCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Sistema de documentación fotográfica Decon Science Tech GmbHDeVision G 
Secuenciación de ADN MWG-Biotech GmbH
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)BiochromL182-50
Microscopio fluorescente ZeissHBO 100
mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Escalera de proteínas preteñida Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Reino Unido
Membrana de nitrocelulosa Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Electro secante Biometra GmbH846-015-600
Albúminas séricas bovinas (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anticuerpo anti-ovoalbúmina Abcamab181688
Anti-conejo IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
Cloruro de amonioSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit de aislamiento T Miltenyi Biotec130-093-227 
Columnas MACS LS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Columnas Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Aguja de alimentación 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Solución de formalina, neutro tamponado, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParafinaSigma-Aldrich1496904
HematoxilinaSigma-AldrichH9627
Eosina YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Colagenasa tipo VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medioAppliChemA2044, 9050
Azida sódicaSigma-Aldrich438456
ratón BD Fc BlockBD Pharmingen553141
Unión de mAb conjugada con FITC Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
de mAb conjugado con APC CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur Software BD Biosciences
FCS Express V3 MicroscopioDeNovo
Meta ZeissLSM 710 
Estación de trabajo ZeissZeissLSM 7
Software Zeiss ZEM Zeissv4.2.0.121
Placas inmunológicas Maxisorp NUNC, Roskilde442404
Estreptavidina fosfatasa alcalina conjugadaJackson Immuno Research016-050-084
Sustrato de fosfatasa alcalina 4-Nitrofenil fosfato sal disódica hexahidratadoSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
Lector de microplacas-ELISA TECANTecan
DNase I recombinante4536282001
unión confocal de barrido Software EasyWin

Referencias

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Modelo de transferencia de células Tlámina propia colónicacélulas T CD4 OT-IIE. coli que expresa CFP-OVAanálisis de citometría de flujoimágenes de microscopía confocalprotocolo de aislamiento celularmétodo de digestión de tejidos
Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T
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