Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Summary

En este modelo de colitis impulsada por antígenos, las células T CD4⁺ OT-II que expresan una proteína fluorescente roja se transfirieron adoptivamente a ratones RAG^-/- que expresan una proteína fluorescente verde en fagocitos mononucleares (MP). Los huéspedes fueron desafiados con Escherichia coli (E. coli) que expresa la proteína ovoalbúmina (OVA) fusionada con una proteína cian fluorescente (CFP).

Abstract

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una inflamación crónica que afecta al tracto gastrointestinal (TGI). Una de las mejores formas de estudiar los mecanismos inmunológicos implicados durante la enfermedad es el modelo de transferencia de células T de la colitis. En este modelo, los ratones inmunodeficientes (receptores de RAG^-/-) se reconstituyen con células T CD4⁺ vírgenes de huéspedes sanos de tipo salvaje.

Este modelo permite examinar los eventos inmunológicos más tempranos que conducen a la enfermedad y la inflamación crónica, cuando la inflamación intestinal se perpetúa pero no depende de un antígeno definido. Para estudiar el papel potencial de las células presentadoras de antígenos (APC) en el proceso de la enfermedad, es útil contar con un modelo de enfermedad impulsado por antígenos, en el que un antígeno derivado de un comensal definido conduce a la colitis. Por lo tanto, se ha desarrollado un modelo de colitis impulsada por antígenos. En este modelo, las células T CD4⁺ OT-II, que solo pueden reconocer epítopos específicos en la proteína OVA, se transfieren a huéspedes RAG^-/- desafiados con E. coli que expresa CFP-OVA. Este modelo permite examinar las interacciones entre las APC y las células T en la lámina propia.

Introduction

El intestino es la mayor superficie del cuerpo que está expuesta al ambiente externo. matrices extensas de microbios residentes colonizan el intestino humano para formar la microbiota intestinal (o microflora). Se estima que esto constar de hasta 100 billones de células microbianas y constituye uno de los hábitats bacterianas más densamente poblados conocidos en la biología ^1-3. En el GIT bacterias colonizan un nicho intestinal donde sobreviven y se multiplican ^4. A cambio, la microbiota dota a la máquina con características funcionales adicionales no codificadas en su genoma ^1. Por ejemplo, la microbiota estimula la proliferación de ....

Protocol

Los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en las instalaciones de animales de la Universidad de Ulm (Ulm, Alemania). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la utilización de animales local y el comité de cuidado y la Ley Nacional de Protección de los Animales.

1. Construcción del plásmido pCFP-OVA

1. Amplificar el gen de tamaño OVA completa usando los cebadores Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') y Ova_ClaI_rev (3' GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5 ') ³⁷ utilizando el plásmido pCI....

Results

Para establecer un modelo de colitis antígeno impulsado por una E. coli cepa ha sido construido que contiene un plásmido en el que el gen de la PPC se fusiona a la secuencia codificante para la proteína ovoalbúmina de pollo y la construcción de fusión se expresa bajo el control del promotor constitutivo fuerte P _hiper (Figura 1A). Microscopía fluorescente muestra que la E. recombinante coli pCFP-OVA, pero no el pa.......

Discussion

Al igual que con cualquier otro modelo, el modelo de colitis antígeno impulsado descrito anteriormente puede presentar algunos problemas que el investigador realiza la técnica debe tener en cuenta. Cuando se inyecta el AT-II / rojo ⁺ T CD4 ⁺ CD62L ⁺ células en los ejércitos, el investigador debe ser muy suave y cuidado de insertar la aguja en la cavidad peritoneal. El no hacerlo puede resultar en el desgarramiento del intestino del ratón, que podría conducir a la muerte, o una administra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244620
Batido rotativo	Reiss Laborbedarf e. K.	Modelo 3020 GFL
2 mm gap couvettes	Peqlab Biotechnologie GmbH	71-2020
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-100ML
Gene Pulsser Xcell system	BioRad Laboratories GmbH	1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244510
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393-5G
SOC Medio	Sigma-Aldrich	S1797-100ML
Kit de aislamiento de plásmidos de alta pureza	Roche 11754777001
Agarosa	Carl Roth GmbH & Co	3810.1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	537020
Cámara de gel	PEQLAB Biotechnology GmbH	40-0708
Colorante de carga	Thermo Fisher	R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher	SM0312
Solución de bromuro de etidio	Carl Roth GmbH & Co. KG	2218.3
Sistema de documentación fotográfica	Decon Science Tech GmbH	DeVision G
Secuenciación de ADN	MWG-Biotech GmbH
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Biochrom	L182-50
Microscopio fluorescente	Zeiss	HBO 100
mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad Laboratories GmbH	1658005
PageRuler Escalera de proteínas preteñida	Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania
IstanBlue Solution	Expedeon, Cambridgeshire, Reino Unido
Membrana de nitrocelulosa	Macherey-Nagel GmbH & Co. KG	741280
Electro secante	Biometra GmbH	846-015-600
Albúminas séricas bovinas (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003-25G
Anticuerpo anti-ovoalbúmina	Abcam	ab181688
Anti-conejo IgG  HRP	Sigma-Aldrich	A0545
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc	32132
Forene	Abbott	2594.00.00
FBS	Invitrogen	10500-064
Falcon Cell Strainers	Fischer Scientific	08-771-2
Cloruro de amonio	Sigma-Aldrich	254134-5G
Tris Base	Sigma-Aldrich	10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit de aislamiento T	Miltenyi Biotec	130-093-227
Columnas MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS Columnas	Miltenyi Biotec	130-042-201
MidiMACS Separador	Miltenyi Biotec	130-042-302
MiniMACS Separador	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Aguja de alimentación 20G	SouthPointe Surgical Supply, Inc	FN-7903
Solución de formalina, neutro tamponado, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Parafina	Sigma-Aldrich	1496904
Hematoxilina	Sigma-Aldrich	H9627
Eosina Y	Sigma-Aldrich	230251
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9779
Colagenasa tipo VIII	Sigma-Aldrich	C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio	AppliChem	A2044, 9050
Azida sódica	Sigma-Aldrich	438456
ratón BD Fc Block	BD Pharmingen	553141
Unión de mAb conjugada con FITC Vß 5.1, 5.2	BD Pharmingen	553189
de mAb conjugado con APC CD4 GK1.5	eBioscience	17-0041-83
FACS Calibur	Software BD Biosciences
FCS Express V3 Microscopio	DeNovo
Meta	Zeiss	LSM 710
Estación de trabajo Zeiss	Zeiss	LSM 7
Software Zeiss ZEM	Zeiss	v4.2.0.121
Placas inmunológicas Maxisorp	NUNC, Roskilde	442404
Estreptavidina fosfatasa alcalina conjugada	Jackson Immuno Research	016-050-084
Sustrato de fosfatasa alcalina 4-Nitrofenil fosfato sal disódica hexahidratado	Sigma-Aldrich	71768-5G
mAb R4-6A2	BD Biosciences	551216
mAb XMG1.2	BD Biosciences	554410
Lector de microplacas-ELISA TECAN	Tecan
DNase I recombinante		4536282001