El Visual detección colorimétrica de polimorfismos de múltiples nucleótidos en una plataforma de manipulación de neumático de la gotita

Summary

Este trabajo presenta un método simple y visual para detectar polimorfismos de nucleótido múltiples en una plataforma de manipulación de gotas neumático. Con el método propuesto, todo el experimento, incluyendo la manipulación de gotas y detección de polimorfismos de múltiples nucleótidos, se pueden realizar cerca de 23 ° C sin la ayuda de instrumentos avanzados.

Abstract

Un método simple y visual para detectar polimorfismo multi-nucleótidos (MNP) se realizó en una plataforma de manipulación de gotas neumático en una superficie abierta. Este enfoque para la detección de ADN colorimétrico se basa en el crecimiento de hibridación mediada de sondas de nanopartículas de oro (sondas AUNP). El tamaño de crecimiento y la configuración de la AuNP están dominadas por el número de muestras de ADN se hibridaron con las sondas. Basado en las propiedades ópticas reducción de tamaño y de forma dependiente específicas de las nanopartículas, el número de desajustes en un fragmento de ADN de la muestra a las sondas es capaz de ser discriminado. Los ensayos se realizaron a través de gotitas que contienen los reactivos y las muestras de ADN, respectivamente, y se transportaron y se mezclan en la plataforma neumática con la succión neumática controlada de la membrana superhidrofóbica a base de PDMS flexibles. Las gotitas pueden ser entregados al mismo tiempo y con precisión en una superficie abierta en la plataforma neumática propuesto que es altamente biocompatible con ningún lado efect de muestras de ADN dentro de las gotitas. La combinación de los dos métodos propuestos, el polimorfismo multi-nucleótido puede ser detectada a la vista en la plataforma de manipulación de gotas neumático; no se requiere ningún instrumento adicional. El procedimiento de instalación de las gotitas en la plataforma para el resultado final en menos de 5 min, y mucho menos que con los métodos existentes. Además, este enfoque de detección de MNP combinado requiere un volumen de muestra de sólo 10 l en cada operación, que es notablemente menor que la de un sistema de macro.

Introduction

Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), que es una única diferencia de pares de bases en una secuencia de ADN, es una de las variaciones genéticas más comunes. Los estudios actuales indican que SNPs están asociados con el riesgo de enfermedad, la eficacia del fármaco y los efectos secundarios de los individuos al afectar la función del gen. ^1,2 Estudios recientes también revelaron que las mutaciones de dos o de múltiples puntos (polimorfismo multi-nucleótidos) causan enfermedades y individuo particular las diferencias en los efectos de la enfermedad. ^3,4 La detección de polimorfismo de nucleótido tanto, es imperativo en la preselección enfermedad. Los métodos simples y eficaces para la detección rápida de oligonucleótidos específicos de secuencia estaban muy desarrollados en las últimas dos décadas. ^1,5 Los enfoques actuales para identificar mutaciones de ADN que suelen implicar procedimientos que incluyen la inmovilización de la sonda, el etiquetado de fluorescencia, electroforesis en gel, etc., ^6,7 pero estos métodos requieren generalmente un proceso analítico de largo, expensive equipos, técnicos bien entrenados, y el consumo significativo de muestras y reactivos.

Una nanopartícula con una gran relación de área superficial a volumen y las propiedades fisicoquímicas únicas es un material ideal como una plataforma de detección altamente sensible y barato para biomarcadores específicos. Las nanopartículas de oro (AUNP) son ampliamente utilizados para la detección de ADN debido a su gran capacidad de ser modificado con sondas de oligonucleótidos. ^8-10 técnicas de detección de SNP también se desarrollaron utilizando AuNP. ^11-13 En este trabajo hemos adoptado un enfoque novedoso colorimétrico para detectar la polimorfismo multi-nucleótidos (MNP) a través del ADN crecimiento hibridación mediada de sondas AUNP. ¹⁴ Este sencillo y rápido método de sondeo se basa en la teoría de que longitudes variadas de ADN de cadena sencilla (ssDNA) o ADN de doble cadena (dsDNA) conjugado con AUNP influir en el tamaño de crecimiento y la forma del AuNP (véase la Figura 1). ¹⁵ Este método de detección de ADNcuenta con un pequeño consumo de reactivos, una duración de ensayo pequeño (unos pocos minutos), y un procedimiento simple y sin control térmico que es aplicable en el futuro para el diagnóstico clínico y el examen médico interno.

Varios sistemas microfluídicos para la detección de la secuencia de ADN se han desarrollado; ¹⁶ estos sistemas de microfluidos, evolucionado a partir de protocolos experimentales tradicionales, requiere un menor número de piezas de equipo a gran escala y simplificado los protocolos experimentales a fin de mejorar la sensibilidad, límite de detección y especificidad de la DNA biosensor. Los métodos de detección de ADN en los sistemas de microfluidos todavía requieren, sin embargo, los instrumentos de un proceso posterior, tal como un (reacción en cadena de la polimerasa) PCR máquina para la amplificación de la señal y un lector de fluorescencia para un solo lectura para identificar el heterogénea SNP ^17,18. El desarrollo de un sencillo plataforma sin el posterior procesamiento para leer directamente los resultados de polimorfismo multi-nucleótidoes altamente deseable. En comparación con bien utilizado, convencional, los sistemas cerrados de microfluidos, la superficie abierta dispositivos de microfluidos prometedora ofrecen varias ventajas, tales como un camino claro óptica, una forma fácil de acceder a la muestra, una accesibilidad ambiental directa y la cavitación no forman fácilmente u obstrucción interfacial en el canal. ¹⁹ Nuestro trabajo previo introducido una plataforma neumática simple para la manipulación de la superficie abierta de gotitas (véase la Figura 2). ²⁰ en esta plataforma, las gotitas pueden ser transportados y manipulados sin la interferencia de una energía de accionamiento mediante una fuerza de succión al mismo tiempo, que tiene una un gran potencial en aplicaciones biológicas y químicas. Esta plataforma neumática se utiliza de este modo para ejecutar la manipulación de muestras de ADN para la detección de MNP en combinación con el enfoque colorimétrico utilizando el concepto de ADN crecimiento hibridación mediada de sondas AUNP.

El protocolo presentado en este documento se describenun simple detección visual de los polimorfismos de múltiples nucleótidos en la plataforma de manipulación de gotas neumático en una superficie abierta. Este trabajo confirma que el polimorfismo de nucleótido múltiples es detectable a simple vista; la plataforma neumática propuesto es adecuado para aplicaciones biológicas y químicas.

Protocol

1. Método para detectar MNP

Nota: Esta sección describe el procedimiento para detectar la MNP basado en el crecimiento de hibridación mediada de nanopartículas de oro.

1. Preparar el DNA sonda solución (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') a una concentración 100 mM.
2. Preparar las partículas AuNP modificado con sonda de ADN (sonda AuNP). ²¹
   Nota: El volumen utilizado aquí depende de la exigencia de partículas AuNP modificado con sonda de ADN (sonda AuNP). Es por lo tanto depende del número de experimentos para llevarse a cabo. normalmente preparamos el exceso de partículas de sonda AuNP como repuestos. El volumen utilizado en estos pasos es ajustable y flexible.
   1. Añadir sonda de ADN (100 mM, preparado en el paso 1.1) a una solución de nanopartículas de oro (13 nm, 17 nM) a una concentración de 1 OD / ml.
   2. Llevar las concentraciones finales de dodecil sulfato de sodio (NaCl ₁₂ H ₂₅ SO _4, SDS) y tampón fosfato (PBS) a 0,01% y 0,01 M, respectively.
   3. Después de 20 min, llevar la concentración de cloruro de sodio (NaCl) a 0,05 M con una solución de NaCl (2 M) y PBS (0,01 M) mientras se mantiene SDS a 0,01% y se incuba durante 20 min.
   4. Aumentar la concentración de NaCl en incrementos de 0,1 M a una concentración final de 1 M más de 20 intervalos min.
   5. Incubar toda la noche con agitación en un mezclador de vórtice a 23 ° C. La velocidad de agitación no afecta el experimento siempre que las muestras de ADN y sondas AUNP convierten hibridado.
   6. Centrifugar las nanopartículas de oro a 7.000 xg durante 30 segundos y retirar el sobrenadante.
3. Añadir partículas sonda AUNP en agua desionizada (agua DI) a una concentración de 25 nM (solución de sonda AuNP).
4. Preparar muestras de ADN diana (totalmente complementarias: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 ', tres pares de bases no coincidentes: 5'-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3', seis pares de bases no coincidentes: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') en concentracionesde 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 M, respectivamente.
5. Añadir solución de sonda AuNP (6 l, 25 nM) en las muestras de ADN (350 l) con NaCl (14 mM).
6. Agitar la mezcla de muestras de ADN y sondas AUNP con un mezclador de vórtice a 23 ° C durante 5 min para la hibridación de ADN.
7. Para el crecimiento AuNP, añadir NH ₂ OH (6 l, 400 mM) y _HAuCl4 (6 l, 25,4 mM) a la solución (la mezcla de muestras de ADN y sondas AUNP). El crecimiento de AuNP tarda aproximadamente 30 segundos para su finalización. El cambio constante de coloración mantiene más de 1 hora.
   PRECAUCIÓN: El contacto de la piel con _HAuCl4 podría producir efectos tóxicos graves. Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de usar. Por favor, use guantes y utilizar una campana cuando se utiliza _HAuCl4.

2. Fabricación de una plataforma de manipulación neumática de la gotita

Nota: La plataforma de manipulación de gotas a base-PDMS comprende dos componentes: un PDMS membrana (100 micras) con una superficie súper hidrófoba y una capa de aire de canal (5 mm). Sin un proceso de MEMS, se utilizaron los procesos de mecanizado comunes para fabricar este dispositivo, que incluye el control por ordenador numérico micromecanizado (CNC) para la fabricación de un molde, de fundición PDMS y la replicación para el prototipado rápido de los componentes microfluidos, y micromecanizado con láser para la fabricación de una superficie súper hidrófobo (ver Figura 3).

1. Use la máquina CNC equipado con una broca (0,5 mm) para producir moldes maestros basados en PMMA (ver Figura 3) con microestructuras. Utilice una velocidad de alimentación de la broca 7 mm / seg y una velocidad de rotación de 26.000 rpm. Utilice un soplador de aire y el agua DI para eliminar el desecho PMMA y para limpiar la superficie de los moldes maestros.
2. Preparar una mezcla de la base de PDMS y el agente de curado en la relación de 10: 1. Desgasificar la mezcla dentro de un desecador durante 30 min, o hasta que todas las burbujas de aire se eliminan.
3. Verter el PDMS en THe molde maestro y hornear los PDMS de 3 horas a 60 ° C en el horno para obtener las microestructuras inversos de las cámaras de aire (membrana PDMS) y los canales de aire (capa PDMS).
4. Eliminar la capa de PDMS del molde maestro (a mano). Perforar agujeros en la capa de PDMS para las entradas de succión de aire.
5. Ponga la membrana de PDMS, la capa de PDMS y el sustrato de vidrio en la cámara del sistema de tratamiento de oxígeno-plasma. Después del tratamiento de oxígeno-plasma, unir la membrana de PDMS, la capa de PDMS y el sustrato de vidrio juntos sobre una placa caliente (90 ° C) durante 10 min.
6. Poner el chip de material compuesto en la máquina de corte por láser (PDMS lado de la membrana hacia arriba). Importe el archivo .dwg para definir el área superhidrofóbica (15 mm x 12 mm). Véase la Figura 3. Directamente grabar la membrana de PDMS con una máquina -Laser CO ₂ para crear el área superhidrofóbica en la membrana de PDMS (potencia 12 W, velocidad de exploración 106,68 mm / seg).
7. Limpiar la superficie superhidrofóbica con agua DI para lavarlos restos carbonizados de distancia de la superficie.
8. Conectar la entrada de succión de aire y la bomba de vacío a través de una válvula de solenoide (véase la Figura 4). Conectar la válvula de solenoide a la computadora y el control con un módulo USB de E / S digital.

3. Operación para la detección de MNP en la plataforma neumática

Nota: En esta sección se describe la operación para identificar rápidamente la colorimetría y MNP en la plataforma de la manipulación de gotas neumático (ver Figura 5). Todos los pasos se llevan a cabo a 23 ° C (temperatura ambiente) y una humedad relativa del 85%.

1. Coloque la gota de muestra de ADN diana (10 l, 0,5 M) en el área de la plataforma superhidrofóbica manipulación de gotas neumático.
2. Coloque la gota de la sonda AuNP (10 l, 25 nM) en la zona de la plataforma superhidrofóbica manipulación de gotas neumático.
3. Control de la aspiración de aire para causar la deflexión de la membrana de PDMS con una válvula de solenoide y un SImple programa (por ejemplo, Labview). Proporcionar de aspiración de aire en cada cámara de aire a lo largo de la ruta de migración de las gotitas (que contienen ADN diana y las sondas AUNP respectivamente) en la membrana de PDMS de manera que las gotitas chocan entre sí y se unen. Use una presión de trabajo de la bomba de vacío de -80 kPa (presión manométrica).
   1. Alternativamente, el control de la aspiración de aire manualmente siempre que la gotita está completamente mezclado. A mano, conectar o desconectar la bomba de vacío y las entradas de cámara de aire con tubos en las primeras etapas de la prueba.
4. Control de la aspiración de aire para rodar la gota de coalescencia adelante y hacia atrás para mejorar la eficiencia de mezcla durante 3 min usando el sistema de control de la válvula de solenoide. El ADN diana y las sondas AUNP vuelven bien mezclado y se hibrida a menos de 3 min. Usar una frecuencia de conducción y una presión de trabajo de 5 Hz y -80 kPa (presión manométrica), respectivamente.
5. Colocar una gota que contiene NH ₂ OH (2 l, 400 mM) y HAuCl4 (2 l, 25,4 mM) en la zona de la plataforma superhidrofóbica manipulación de gotas neumático.
6. Controlar la succión de aire (-80 kPa de presión manométrica) para permitir que las gotas chocan entre sí y se fusionan. Luego controlar la succión de aire (5 Hz y -80 kPa de presión manométrica) para que el rollo de coalescencia de gotas hacia adelante y hacia atrás para mejorar la eficacia de la mezcla durante 1 min.
7. Medir y registrar el color de la gotita se unieron con el ojo desnudo.

Results

En este trabajo, tres muestras de ADN se ensayaron usando un método sencillo y novedoso de detección a través de la DNA crecimiento hibridación mediada de las sondas AUNP. Las secuencias de ADN de la sonda y muestras de ADN de tres clases, en concreto, ADNc (totalmente complementaria a la sonda de ADN), TMDNA (tres pares de bases de ADN unido mal), y SixMDNA (seis pares de bases de ADN no coinciden) se enumeran en el Protocolo paso 1. los desajustes a la sonda de las muestras de ADN de p...

Discussion

En este protocolo, un método colorimétrico simple de detectar MNP se puede implementar en concentraciones que van desde 0.11-0.50 M en tubos de microcentrífuga. Además, el método de detección de MNP propuesto se lleva a cabo en una plataforma de manipulación de gotas neumático que tiene un alto potencial para la detección de ADN y otras aplicaciones biomédicas. En la práctica, la gama detectable de la concentración de ADN de la muestra depende de la eficiencia de mezclado de las plataformas operativas. Para asegurarse d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184
grabadores de sobremesa	Roland DG	EGX-400
máquina de corte por láser	Universal Laser Systems, Inc.	VLS 3.50
Sistema de tratamiento de plasma de oxígeno	Femto Science Inc. Corea	Válvula
	bomba
		DA-30D
Solución de AuNP de 13 nm	TAN Bead Inc., ADN	NG-13
(con tiol marcado con extremo 5')	MDBio, Inc., solución
(PBS)	UniRegion  Biotecnología,. Taiwán	PBS001-1L
dodecil sulfato de sodio (SDS)	J. T. baker	4095-04
Solución de hidroxilamina (NH2OH)	Sigma-Aldrich	467804
Ácido cloroáurico (HAuCl4)	Sigma-Aldrich	G4022
cloruro de sodio (NaCl)
mezclador de vórtice	Digisystem Instrumentos de Laboratorio Inc.	Centrífuga VM-2000
	Hermle Labortechnik GmbH.	Z 216 MK