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Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

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DOI:

10.3791/54426

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27 de septiembre de 2016

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1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

En este artículo

Resumen

Describimos un morbidostat configurable de bajo coste que permite la caracterización de la resistencia a los antibióticos mediante el ajuste dinámico de la concentración del fármaco. El dispositivo puede integrarse con una plataforma microfluídica multiplexada. El enfoque puede ampliarse para estudios de resistencia a antibióticos en laboratorio.

Resumen

Describimos un bajo costo, morbidostat configurable para la caracterización de la vía evolutiva de resistencia a los antibióticos. El morbidostat es un dispositivo de cultivo bacteriano que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano y ajusta dinámicamente la concentración de fármaco para desafiar constantemente las bacterias a medida que evolucionan para adquirir resistencia a los medicamentos. El dispositivo cuenta con un volumen de trabajo de ~ 10 ml y es totalmente automatizado y equipado con medición de la densidad óptica y micro-bombas para el medio y la administración de fármacos. Para validar la plataforma, que mide la adquisición gradual de la resistencia a trimetoprima en Escherichia coli MG 1655, e integró el dispositivo con una plataforma de microfluidos multiplexado para investigar la morfología celular y la sensibilidad a los antibióticos. El enfoque puede ser de hasta a escala en los estudios de laboratorio de resistencia a los antibióticos, y es extensible a la evolución adaptativa para las mejoras de deformación en la ingeniería metabólica y otros experimentos con cultivos bacterianos.

Introducción

Desde la introducción del primer fármaco antibiótico penicilina, la resistencia microbiana a los antibióticos se ha convertido en un problema de salud mundial 1. Aunque la adquisición de resistencia a los antibióticos puede ser estudiado retrospectivamente in vivo, las condiciones de estos experimentos a menudo no están controlados a lo largo de toda la evolución 2. Alternativamente, la evolución adaptativa de laboratorio puede revelar la evolución molecular de una especie microbiana menores de estrés ambiental o la presión de selección de un fármaco antibiótico 3. Recientemente, muchos experimentos evolutivos bien controlados de resistencia a los antibióticos han permitido comprender la aparición de resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el grupo de Austin demostró emergencia rápida en un entorno compartimentado microfluidos diseñado adecuadamente 4. El morbidostat recientemente desarrollado induce mutaciones sistemáticas bajo la presión de selección de drogas 5,6. El morbidostat, una selec microbianadispositivo de la que ajusta continuamente la concentración de antibiótico para mantener una población casi constante, es un avance importante en la prueba de fluctuación se utiliza en microbiología 7,8. En la prueba de fluctuación, un fármaco antibiótico se inyecta a alta concentración, y los mutantes supervivientes se tamizan y se contó. En cambio, los microbios en un morbidostat son constantemente desafiados y adquieren múltiples mutaciones.

El morbidostat opera de manera similar a la quimiostato, un dispositivo inventado por la cultura y Novick Szliard en 1950 que mantiene una población constante mediante el suministro continuo de nutrientes, mientras que la dilución de la población microbiana 9. Desde su introducción, el quimiostato se ha avanzado y mejorado. quimiostatos microfluidos actuales han alcanzado las capacidades de nanolitros y unicelulares. Sin embargo, estos dispositivos no son adecuados para los experimentos de evolución adaptativa, que requieren una población de células grandes con muchos eventos de mutación 10,11. Recientemente, mini-quimiostatos con volúmenes de trabajo de ~ 10 ml también se han desarrollado para rellenar el hueco entre los biorreactores de escala en litros y el microfluidos quimiostato 12,13.

Aquí se presenta el diseño y el uso de un bajo costo, morbidostat automatizado para un estudio de resistencia a los antibióticos. El módulo propuesto se puede emplear en un incubador agitador en un laboratorio de microbiología con el requisito mínimo de hardware. El firmware de código abierto también se adapta fácilmente a las aplicaciones específicas de la evolución de adaptación, como la ingeniería metabólica 3. Por último, el morbidostat está integrado en una plataforma de microfluidos multiplexado para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos 14.

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Protocolo

1. Las pruebas preliminares de la Asamblea y del dispositivo Morbidostat

  1. Asamblea de la Morbidostat
    1. Perforar 3 agujeros en el tapón del vial de cultivo con una aguja de jeringuilla 18 G. Cortar tres piezas de tubo de polietileno ~ 7 cm de longitud. Insertar estas tres piezas de tubo de polietileno en la tapa.
    2. Use cinta adhesiva para envolver el borde de la tapa para servir de molde para la mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS). Mezclar 5 g de un componente y 0,5 g del componente B de los PDMS en un recipiente de plástico 150 ml por agitación manual con un palillo de dientes. Cargar la mezcla en una jeringa de 10 ml.
      1. Verter la mezcla de PDMS en la tapa con la jeringa. Hornear toda la tapa para curar los PDMS durante 8 horas en el horno a 70 ° C.
    3. Soldar el ánodo del LED con el cable de calibre 24 y el cátodo del LED con la resistencia de carbono con un soldador. Soldar una resistencia de 680 Ω de carbono con un alambre G 24. Aislar la conexión de cables utilizando cinta aislante.
    4. Asi quelder el colector del fotodetector con el alambre G 24 y el emisor del fotodetector con una resistencia de 100 kW de carbono. Aislar la conexión de cables utilizando cinta aislante.
    5. Coloque el diodo emisor de luz en el soporte de vial de cultivo. Siguiendo el esquema de conexiones en la figura complementaria 2, conecte el diodo emisor de luz y el poder con una fuente de alimentación de 5 V. Asegúrese de que el LED funciona mediante el uso de una cámara digital que puede detectar IR (por ejemplo, una cámara de teléfono móvil).
    6. Coloque el fotodetector en el soporte de vial de cultivo. Siguiendo el esquema de conexiones en la figura complementaria 2, conecte el fotodetector y la potencia con una fuente de alimentación de 5 V. Conectar el cable a ambos lados de las resistencias de fotodetectores para medir el voltaje a través del panel de control electrónico.
    7. Pegar un imán en el eje del ventilador de refrigeración, que sirve como la unidad de agitador magnético. Tenga en cuenta que la alignment del eje del ventilador para el vial de cultivo, y la separación entre el vial de cultivo y el imán es muy crítica para el correcto funcionamiento de la unidad de agitación magnética.
    8. Conectar cada trozo de tubo de polietileno de la cultura vial en la pieza correspondiente de tubos de silicona para las micro-bombas, botellas medianas y botella de residuos. A su vez en la bomba durante 1 hr y medir el volumen total que se bombea desde la botella medio en el vial de cultivo para determinar la velocidad de la bomba. Tenga en cuenta que la velocidad de bombeo típica debe ser ~ 4 ml / hora, lo que corresponde a la tasa de dilución D = 0,33 h-1 durante unos 12 ml de volumen del vial de cultivo de trabajo.
    9. Colocar todo el conjunto en un incubador con agitación de tamaño mediano (34 cm x 34 cm x 43,5 cm).
  2. Pruebas preliminares del Morbidostat
    1. tensión de alimentación conjunto de ventilador fresco a 5 V para iniciar su motor para probar la barra de agitación magnética. Tenga en cuenta que la acción de agitación se puede inspeccionar visualmente. La tensión que impulsans del motor del ventilador de refrigeración se controla con precisión mediante modulación por ancho de pulso (PWM).
    2. Preparar una serie de tipo salvaje E. muestras coli con densidades ópticas a 600 nm que típicamente varía 0,07-0,3 para la calibración. Coloque una prueba E. coli muestra en el vial de cultivo y registrar la tensión fotodetector.
      1. Place ~ 100 l de la misma muestra en el lector de placas y registrar la densidad óptica. Utilice la tensión fotodetector frente a los datos de densidad óptica para trazar la curva de calibración. Tenga en cuenta que por lo general, una unidad de cambio en la densidad óptica corresponde a ~ 7,6 V cambio en el fotodetector con el esquema de restricción utilizado aquí.

2. Ejecutar el Morbidostat

  1. Preparación Antes de comenzar el experimento diario
    1. Preparar el vial de cultivo con tres tubos Tygon resistentes ultra-químicas con diámetro interior de 1/32 de pulgada y diámetro exterior 3/32 pulgadas para las entradas para formar el dispositivo como en la sección1.1 y en la Figura 1 complementario.
    2. Preparar el medio M9 mínimo (0,2% de glucosa) y trimetoprim (TMP) de drogas medio que contiene. Esterilizar el medio, la botella de medio, la botella de medio con el fármaco, la botella de residuos, y el vial de cultivo en un autoclave a 121 ° C.
      NOTA: La TMP es una solución de reserva que se utiliza para lograr más tarde las concentraciones de la Tabla 1 y el fármaco TMP que contiene el medio no se trata en autoclave.
  2. La ejecución de la Morbidostat
    1. En el primer día del experimento, descongelar 1 ml de tipo salvaje congelado E. células de E. coli MG1655 de 5 min a temperatura ambiente y la transferencia de 120 l de las células a la vial de cultivo que contiene ~ 12 ml de medio de crecimiento M9. Después del primer día, descongelar 1 ml de E. congelado coli células del día anterior durante 5 min y la transferencia de 120 l de las células a un nuevo vial de cultivo que contiene ~ 12 ml de medio de crecimiento M9.
    2. Encienda la incubadora agitador y ajuste la tempe ratura de 30 ° C sin agitación.
    3. Iniciar la operación de morbidostat activando la micro-bomba, la unidad de agitación magnética, y la medición de la densidad óptica.
      NOTA: Durante la operación, un algoritmo de umbral de realimentación se utiliza para controlar la inyección de drogas. Cuando la densidad óptica medida supera un umbral preestablecido, la bomba de inyección de drogas se enciende y la bomba del medio se apaga. De lo contrario, la bomba de inyección de drogas permanece apagado y la bomba está en medio.
    4. Monitor de la tensión de vez en cuando para asegurar que no es el crecimiento microbiano.
      Nota: Debido al ciclo de congelación y descongelación, E. coli células presentan un retraso de ~ 4 horas durante el crecimiento de cada día.
    5. Después de ~ 23 horas, detener la micro-bomba apagando su tensión de alimentación y sacar el tubo del cultivo. Añadir 15% de glicerol en el vial de cultivo y la congelación de la muestra a -80 ° C para el almacenamiento.
    6. Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.5.
Le "> 3. susceptibilidad antibiótica de medición en 96 Bueno Formato

NOTA: Realice la medición tasa de crecimiento en un lector de placas con un formato de 96 pocillos para determinar el nivel de resistencia a los antibióticos.

  1. Descongelar la muestra congelada diaria a temperatura ambiente durante 5 min y transferir 15 l de la célula para el vial de cultivo que contiene ~ 15 ml de medio M9. Permiten que crezcan hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanza ~ 0,1. Divida a los 15 ml en 1 ml botellas y añadir el fármaco TMP en este paso para obtener las concentraciones de fármaco deseadas como se muestra en la Tabla 1.
  2. Tomar 200 l de la muestra a partir del paso 3.1 y lugar en cada pocillo en el lector de placas y les permiten crecer durante 12 horas 5. La densidad óptica a la longitud de onda 600 nm se registra automáticamente durante la medición.
    NOTA: Para cada punto de datos, mediciones por triplicado se registran y se promedió para asegurar la consistencia de los datos. Los datos sobre la densidad óptica en función del tiempo puede be utiliza para obtener la tasa de crecimiento.
  3. Representar gráficamente los datos de la tasa de crecimiento frente a la concentración de fármaco para obtener IC50. Tenga en cuenta que IC 50 se define como la concentración de fármaco en el que la tasa de crecimiento es el cincuenta por ciento de la tasa de crecimiento máximo 5.

4. Single Cell Morfología y susceptibilidad antibiótica de medición en dispositivos de microfluidos

  1. Realizar la fabricación de los dispositivos de microfluidos mediante litografía blanda multicapa de PDMS como se describe en otra parte 15.
    1. Utilice la fotolitografía para hacer el molde fotorresistente para las capas de control y de flujo. Tenga en cuenta que para la capa de control, utilice fotoprotector negativo (~ 15 m de altura) y fotoprotector positivo (~ 8 m de altura) para producir un molde sobre una oblea de silicio al descubierto.
    2. Preparar las mezclas de PDMS con relaciones de reticulación de 5: 1 y 20: 1 para la capa de control y la capa de flujo, respectivamente. Poner las mezclas en un desecador a vacío para eliminar las burbujas, Por 1 hr.
    3. Exponer los moldes capa fotorresistente de control en la oblea de silicio para trimetilclorosilano vapor (TMCS). Hacer la capa de control de ~ 6 mm de espesor por colada la mezcla de PDMS (con una relación de reticulación 5: 1) en la oblea de silicio sobre el molde de control de capa fotorresistente. Hornear la capa de control durante 40 minutos a 80 ° C durante 1 hora en el horno.
    4. Hacer la capa de flujo por giro el recubrimiento de una mezcla de PDMS (con una relación de reticulación 20: 1, velocidad de centrifugado 3000 rpm durante 60 segundos) en un molde de resina fotosensible capa de flujo. Hornear la capa de flujo durante 30 min a 80 ° C durante 1 hora en el horno.
    5. Use una hoja de afeitar para cortar la capa de control en el chip de tamaño deseado (típicamente de 3 cm x 2 cm) y manualmente retire la capa de control. Coloque la capa de control en la parte superior de la capa de flujo y alinearlos bajo un estereomicroscopio. Curar el montaje alineado a 80 ° C durante la noche en el horno. Después, disfrute del conjunto en 250 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico durante 5 horas para disolver los PTM residual.
    6. Posteriormente, perforar los agujeros de entrada con 20 agujas G y unir todo el elastómero a un portaobjetos de vidrio recubierto con una capa de PDMS en blanco (cruz PDMS que une relación de 5: 1, velocidad de centrifugado 2000 rpm durante 30 sec) por tratamiento con plasma de aire de 40 segundos a 1.2 Torr presión de aire.
    7. Llevar a cabo una amplia hornear durante 36 horas a 80 ° C para reducir los efectos citotóxicos de PDMS. Tenga en cuenta que esta etapa de cocción es crítica para minimizar la toxicidad para las células bacterianas.
  2. El experimento de crecimiento de la viruta
    1. Antes de cargar en el dispositivo de microfluidos, lavarlo con agua desionizada durante 1 hora y medio M9 durante 1 hora.
    2. Descongelar la muestra congelada diaria a temperatura ambiente durante 5 min y inocular un nuevo tubo de ensayo con medio M9 fresco. Colocar la muestra en un incubador con agitación a 37 ° C durante la noche.
    3. Diluir la muestra microbiana 10 veces con medio M9 y cargarlo en el dispositivo de microfluidos al presionar al recipiente de la muestra microbiana a 5 psi. A continuación, cargue el medicamento TMPmedio en el chip presionando el recipiente medio con el fármaco a 5 psi. Ejecutar la mezcla entre el microbio y el fármaco por accionamiento de la válvula micromecánica entre las dos cámaras en el chip microfluídico para 15 min.
    4. Coloque el chip de microfluidos en la incubadora microscopio montado en el microscopio invertido. Adquirir la imagen de células en la cámara de crecimiento cada hora durante 8 horas con la cámara CCD montada en el microscopio invertido.
    5. Utilice la secuencia de programa personalizado para calcular el número de células a través de un algoritmo de umbral en los datos de imagen celular 18. Tenga en cuenta que los datos de número de células se promedian por lo general más de tres cámaras de microfluidos.

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Resultados

El morbidostat anteriormente descrito se esquematiza en la Figura 1. Las operaciones morbidostat comunes, incluyendo la evolución experimental, prueba de susceptibilidad a los antibióticos y la comprobación de la morfología celular, fueron validados en una E. cultivo de E. coli MG1655 expuesto a trimetoprim (TMP), un fármaco antibiótico que se usa comúnmente 5,6. TMP induce muy distintivos incrementos escalonados en resistencia a los medicame...

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Discusión

Un dispositivo morbidostat bajo la huella de componentes de bajo coste se demuestra. Los aumentos en el nivel de resistencia a los medicamentos registrados por el dispositivo son coherentes con los informes anteriores de 5. Diseñado para los estudios evolutivos de la resistencia a los medicamentos, el dispositivo es potencialmente aplicable a muchos otros experimentos. En primer lugar, una amplia base de datos de mutaciones inducidas por fármacos se puede establecer para un gran conjunto de antibióticos clíni...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Prof. Sze-Bi Hsu y a la Sra. Zhenzhen por sus útiles discusiones y ayuda en el análisis teórico y la simulación numérica. Y. T. Y. desea agradecer el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia y Tecnología bajo los números de subvención MOST 103-2220-E-007-026 y MOST 104-2220-E-007-011, y de la Universidad Nacional Tsing Hua bajo los números de subvención 103N2042E1, 104N2042E1 y 105N518CE1.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Incubadora de agitador ambientalBioSanES-20
Placa Arduino Leonardo ResistenciaArduinoLeonardo
680 Ohm Resistencia de polarizaciónDigikeypara LED
Resistencia de carbono de 100k ohmios Resistencia de polarizaciónDigikeypara fototransistor
Diodo emisor de luz de 940 nmLED brillante electrónicoBIR-BM13E4G-2 Medición dedensidad óptica
fototransistor de 940 nmKodenshi ST-2L2B Medición dedensidad óptica
Darlington par IC ToshibaMouserULN2803APGeste IC impulsa microbombas y unidad de agitación magnética
Ventilador sin escobillas de 5 V CCADDAAD0405LX-G70especificación: voltaje de alimentación de 5 V y 80  mamá; disponible www.jameco.com
Microbomba piezoeléctricaCurieJetPS15I-FT-5LPresión > 3  kPa; Caudal >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Barra de agitación magnéticaCOWIEforma cónica dim: 10  mm x 4 mm
Centelleo de vidrio Frasco de 20 mlDGSVidrio Pyrex 28 mm (diámetro) x 61 mm (altura)
Soportede cultivo Hecho a medida de poliformaldehído 
SiliconaDow CorningSylgald 184utilizada para sellar el vial de vidrio
Frasco medianoVWR66022-065
Difco M9 sal mínima 5xBDMedio
CadaminoácidoBDGlucosa media
Sigma
Oxoidebateriológicopara placa
de agarLuria Bertani Medio
Microscopio invertidoLeica MicrosystemsLeica DMI-LEDutilizado para la medición microfluídica Uso Objetivo 40X NA = 0,55
Microscopio IncubadoraInstrumento de célula vivaCU-109utilizado para la medición microfluídica
Válvulas solenoidalesPneumadyneS10MM-31-12-3Normalmente abierto 1,3 vatios 12 V CC
Tarjeta de interfaz USBMódulo de E/S digitales USBIO24-R de Hobby Engineering para la medición microfluídica
Compresor de aireRocker ScientificROCKER 440Fuente de presión para microfluidos; Presión máx. 80 psi
Racores luer-lock macho de 1/8" de lengüetaMTLL230 ValuePlastics.com-1utilizados para el control microfluídico
Lengüeta de 1/8" a puerto roscado 10-32ValuePlastics.comB-1utilizados para el control microfluídico
Accesorios Luer-lock hembra para puertoroscado 10-32ValuePlastics.comKFTL-1utilizado para el control microfluídico
NPN transistor darlington 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDutilizado para el control microfluídico
10 kOhm, resistencia de película de carbono, 0,25 WDigiKey.com P10KBACT-NDutilizado para el control microfluídico
Condensador de tantalio, 10  μ F, 25 V, 10%DigiKey.com478-1841-NDutilizado para el control microfluídico
Cámara CCD AndorZyla 4.2 Plus SCMOSutilizado para imágenes microfluídicas en chip
placas ELISA de
dos componentes Silicona MomentiveRTV 615utilizado para la fabricación de chips microfluídicos
SU-8 fotorresistenteMicrchemSU8 2015utilizado para la fabricación de chips microfluídicos
AZ4620 fotorresistenteClariantAZ 4620utilizado para la fabricación de chips microfluídicos
Limpiador de plasmaHarrick PlasmaPDC 32Gutilizado para la fabricación de chips microfluídicos
Aguja de jeringa de calibre 20BDutilizado para la fabricación de chips microfluídicos
LabcyclerSensoquestLabcycler PCR
ADN polimerasaToyoboKDO PlusAmplificación de PCR
TrimethoprimSigma Lector de
placasBiotekSynergy H1 hybrid Medición de resistencia antibiótica
de carbono para viales Agar Lector de

Referencias

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