Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Summary

Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.

Abstract

La comprensión de las interacciones tempranas heterotípicos entre las células cancerosas y el estroma no canceroso que rodea es importante en el esclarecimiento de los acontecimientos que conducen a la activación del estroma y el establecimiento del microambiente tumoral (TME). Varios in vitro y en modelos in vivo de la TME se han desarrollado; Sin embargo, en general, estos modelos no permiten fácilmente el aislamiento de poblaciones de células individuales, en condiciones no perturbar, para su posterior estudio. Para evitar esta dificultad, se ha empleado un modelo TME in vitro usando un sustrato de crecimiento de las células que consta de un inserto de membrana microporosa permeable que permite la generación sencilla de poblaciones de células altamente enriquecido crecido íntimamente, sin embargo, por separado, a cada lado de la membrana de la pieza de inserción para co extendida -Cultura veces. Mediante el uso de este modelo, que somos capaces de generar fibroblastos enormemente enriquecido asociada al cáncer (CAF) las poblaciones de fibroblastos humanos diploides normales siguienteco-cultivo (120 horas) con células de carcinoma de mama humano altamente metastásicas, sin el uso de marcado fluorescente y / o la clasificación de células. Además, mediante la modulación del tamaño de poro de la inserción, se puede controlar para el modo de comunicación intercelular (por ejemplo, comunicación brecha cruce, factores secretados) entre las dos poblaciones de células heterotípicos, que permite la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la TME, incluyendo el papel de la permeabilidad brecha de la salida. Este modelo sirve como una herramienta valiosa en la mejora de la comprensión de los eventos iniciales que conducen a la iniciación del cáncer de estroma, la evolución temprana de la TME, y el efecto de modulación del estroma en las respuestas de las células cancerosas a los agentes terapéuticos.

Introduction

El microambiente tumoral (TME) es un sistema altamente complejo compuesto de células de carcinoma que coexisten y evolucionar junto estroma huésped. Este componente estromal típicamente consiste en fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, varios componentes inmunológicos, así como una matriz extracelular ^1. Un constituyente importante, a menudo la mayoría de este estroma, son fibroblastos activados, refiere con frecuencia como fibroblastos asociados al cáncer o fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) ^2,3. A diferencia de los fibroblastos normales, no activado, CAF contribuyen a la iniciación del tumor, la progresión, la angiogénesis....

Protocol

1. Preparación de medios de cultivo y las células

1. Preparar 500 ml de medio de Eagle esencial mínimo suplementado con 12,5% (vol / vol) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamina, y 100 unidades de penicilina y 100 mg de estreptomicina por ml.
   NOTA: El medio de crecimiento y suplemento (s) se puede cambiar fácilmente para los requisitos de crecimiento de otras cepas de células o líneas celulares.
2. Preparar 70 l de medio de cultivo celular para cada pieza de inserción (6 pocillos formato de inserto): medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 50% (vol / vol) 2 mM L-alanil-L-glutamina FBS, inactivado por c....

Results

Aquí hemos adaptado un inserto de membrana microporosa permeable para desarrollar un sistema de células de co-cultivo heterotípicos in vitro que imita el microambiente tumoral in vivo (Figura 1). Este sistema permite que dos poblaciones diferentes de células que se cultivan en cada lado de la membrana porosa de la pieza de inserción para largos períodos de tiempo (hasta 120 horas, en el uso). Es importante destacar que el sistema es capaz de mantener la.......

Discussion

El protocolo descrito aquí es un simple, adaptable en procedimiento in vitro (Figura 1) que utiliza un inserto de membrana microporosa permeable para generar poblaciones de células individuales altamente enriquecido de un co-cultivo de células heterotípicos. De manera significativa, el modelo es adecuado para la investigación de diversos medios de comunicación intercelular. Los pasos críticos incluyen la selección de la pieza de inserción de tamaño de poro apropiado para el interés exp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) fibroblasto diploide humano	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 línea celular de adenocarcinoma de mama	PerkinElmer	119261	línea parental: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP línea celular de adenocarcinoma de mama	Cell Biolabs	AKR-201
Medio esencial mínimo (MEM) de EagleCorning	Cellgro	15-010-CV
Suero fetal bovino (FBS), Calificado	Sigma	F6178-500mL
Suplemento de Corning Glutagro (200 mM L-alanil-L-glutamina)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Solución de Penicilina Estreptomicina, 100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
Inserto Transwell (i.e., inserto de membrana microporosa permeable) (0.4 μ m poro)	Inserto Transwell Costar	3450
(i.e.e., inserto de membrana microporosa permeable) (1 μ m poro)	Greiner bio-one	657610
Inserto Transwell (i.e., inserto de membrana microporosa permeable) (3 μ m poro)	Costar	3452
Placa de cultivo de 6 pocillos	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 matraz de cultivo CellStar		658 170
solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	sin calcio y magnesio
0,25% (vol/vol) Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-CL
Tubo de centrífuga de 15 ml	CellTreat	229411
plato de cultivo celular de 35 mm x 10 mm	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Para microscopía inmunofluorescente
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Inmunofluorescencia - 1:5.000
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón anti-ratón en cabra, conjugado Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11029	in situ Inmunofluorescencia - 1:2.000
Albúmina sérica bovina - Fracción V	Rockland	BSA-50	libre de inmunoglobulinas y proteasas
	ThermoFisher Scientific	28908	Diluir al 4% con 1x PBS
Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold reactivo antidecoloración con DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Para análisis de citometría >de
fuerte,	Sondas moleculares	C3100MP
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Número de catálogo<	strong>Comments
For Western Blot Análisis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1.000
Tween-20	BioRad	170-6531
Membrana de nitrocelulosa (0,2 μ m)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Ensayo de proteínas BioRad		500-0116
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	BioRad	161-0302
Desoxicolato de sodio monohidratado (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
Solución de acrilamida/Bis al 30%, 37,5:1	BioRad	161-0158