Artículo de método

Un enfoque simple para manipular el oxígeno disuelto para las observaciones de comportamiento animal

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DOI:

10.3791/54430

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28 de junio de 2016

 , 
1Department of Biology, Juniata College

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe un protocolo simple y reproducible para manipular las condiciones de oxígeno disuelto en un entorno de laboratorio para estudios de comportamiento animal. Este protocolo se puede utilizar tanto en entornos de enseñanza y la investigación de laboratorio para evaluar la respuesta del organismo de macroinvertebrados, peces, anfibios o de cambios en la concentración de oxígeno disuelto.

Resumen

La capacidad de manipular el oxígeno disuelto (DO) en un entorno de laboratorio tiene una aplicación importante para investigar una serie de cuestiones ecológicas y de comportamiento del organismo. El protocolo descrito aquí proporciona un método simple, reproducible, y controlado para manipular DO para estudiar la respuesta de comportamiento en los organismos acuáticos resultantes de la hipoxia y condiciones anóxicas. Durante la realización de la desgasificación del agua con nitrógeno se utiliza comúnmente en entornos de laboratorio, ningún método explícito para su aplicación ecológica (acuático) existe en la literatura, y este protocolo es el primero en describir un protocolo para desgasificar el agua para observar la respuesta del organismo. Esta técnica y el protocolo fueron desarrollados para la aplicación directa de los macroinvertebrados acuáticos; Sin embargo, pequeños peces, anfibios y otros vertebrados acuáticos podrían ser fácilmente sustituidos. Se permite la fácil manipulación de los niveles de OD que van desde 2 mg / L a 11 mg / L con la estabilidad para un máximo de un período de observación de los animales-5 min.Más allá de un periodo de observación de 5 minutos la temperatura del agua comenzó a subir, ya los 10 minutos se convirtieron en los niveles de OD demasiado inestable para mantener. El protocolo es escalable para el organismo estudio, reproducible y fiable, lo que permite una rápida implementación en laboratorios de enseñanza de introducción y aplicaciones de investigación de alto nivel. Los resultados esperados de esta técnica deberán establecer una relación disuelto cambios de oxígeno a las respuestas de comportamiento de los organismos.

Introducción

El oxígeno disuelto (DO) es un parámetro fisicoquímico clave importante en la mediación de un número de procesos biológicos y ecológicos dentro de los ecosistemas acuáticos. Las exposiciones a la hipoxia aguda y crónica subletal reducir las tasas de crecimiento en ciertos insectos acuáticos y reducen la supervivencia de los insectos expuestos 1. Este protocolo fue desarrollado para proporcionar un método controlado para manipular los niveles de OD en el agua corriente para observar los efectos sobre el comportamiento animal. Dado que la supervivencia de todos los organismos acuáticos aeróbicos 'depende de la concentración de oxígeno para vivir y reproducirse, los cambios en la concentración de DO a menudo se reflejan en los cambios de comportamiento de los organismos. Se han observado más invertebrados acuáticos y peces móviles para responder a bajas concentraciones de oxígeno (hipoxia) mediante la búsqueda de los lugares con mayor DO 2,3. Para los organismos acuáticos menos móviles, adaptaciones de comportamiento para aumentar la ingesta de DO puede ser la única opción viable. El orden de macroinvertebrados acuáticos de PlecOptera (stonefly) se ha observado para realizar movimientos "push-up" para aumentar el flujo de agua, y la absorción de oxígeno, a través de sus branquias externas 4 - 6. Estos comportamientos adaptativos se han observado en los entornos naturales y en experimentos de laboratorio.

manipulación en el laboratorio de OD en el agua abre importantes oportunidades para estudios de comportamiento animal, pero existen importantes lagunas en la implementación metodológica. Por ejemplo, un estudio utilizó grandes acuarios para evaluar el tiempo fisiológico respuesta de perca americana (Micropterus salmoides) a entornos hipóxicos siguiente gasificación con nitrógeno, pero escasa detalle se da para la metodología 7. Otro estudio realizado en peces cebra (Danio rerio) describe el uso de gas nitrógeno y una piedra porosa para entregar gas al agua y reducir la DO del agua 8. Para las aplicaciones basadas en la química, métodos para la desgasificación de solventes utilizan especializadaaparato 9-11 para eliminar el oxígeno a partir de disolventes, pero no sería adecuado para estudios de comportamiento animal. Si bien estos estudios emplean métodos para eliminar el oxígeno del agua, ningún método descriptivo se pudo identificar que permitiría la evaluación de la conducta animal en respuesta a cambios DO.

Este método se describe a continuación es un intento para describir completamente un protocolo para la manipulación de la DO de agua mediante el uso de gas nitrógeno. Además, este método fue desarrollado hacia la observación de relaciones entre el comportamiento stonefly (flexiones) y DO que se empleó en un laboratorio de biología de nivel de primer año. Una de las principales ventajas de este método es que se puede realizar fácilmente en un laboratorio con material de vidrio y materiales accesibles a la mayoría de los centros de enseñanza secundaria y superior común. El protocolo también es fácilmente adaptable, lo que permite a las personas a escala del procedimiento para cumplir con los objetivos establecidos para aplicaciones de investigación o de enseñanza.

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Protocolo

Nota: Este experimento no hizo uso de los vertebrados y por lo tanto no requieren la aprobación por el Instituto de Juniata College para el Cuidado de Animales y el empleo. Sin embargo, para las personas adaptación de este método para su uso con vertebrados, la aprobación del IACUC debe ser buscada.

Recogida de muestras 1. Campo

  1. Determinar y evaluar los posibles sitios de campo para la capacidad de recopilar, almacenar y stoneflies de transporte rápido para minimizar el tiempo en tránsito con un tiempo máximo recomendado en el tránsito de 1 hr.
  2. Tomar muestras de lanzamiento neta en el lugar de campo seleccionado siguiendo los procedimientos estándar kick-net suficientes veces para recoger al menos 35 stoneflies 12.
  3. Recoger 50 L de agua corriente y las rocas con un diámetro máximo de 2 cm a partir de corrientes.
  4. Coloque acuarios en un frigorífico ajustado a la temperatura de la corriente de sitio. Distribuir rocas recogidas en el lugar de la corriente en acuarios y rellenar con 4 L de agua corriente por acuario. Coloca 20-30 Stoneflies recogidos por el acuario y colocar una piedra burbujeo unido a un burbujeador de acuario en cada tanque y se convierten en peleles que añade continuamente aire de la habitación al agua.
  5. Permitir que las moscas de piedra para adaptarse al nuevo ambiente en los acuarios para un período de 48 horas.

figure-protocol-1
Figura 1. Configuración para la manipulación de oxígeno disuelto. (A) 1) Colocación de un tubo de cobre de lengüeta de la manguera macho 2) Ubicación del tapón de sellado para examinar para asegurar así frasco sellado. (B) 1) 2 L matraz de brazo lateral llena con 1,9 l de agua 2) Tubo de Gas y burbujeador de aire (azul) para su uso en burbujeo de nitrógeno y burbujeo de aire de la habitación, respectivamente 3 tanque de nitrógeno) y los valores calibrados 4) 2 L matraz llena con 0,4 l de agua con tubo de vacío sumergida 5) medidor de oxígeno disuelto. Por favor, haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.

2. Conjunto Experimental hasta

  1. En una parte superior del banco, conectar un tubo de vacío de pared estándar al brazo lateral de un 2 L matraz de brazo lateral como se muestra (1 en la Figura 1B).
  2. Llenar el matraz con 1,9 l de agua corriente de envases de plástico de 3 L que contengan agua corriente recogida en el refrigerador ajustado a 12 ° C.
  3. Colocar el matraz y el tubo en una bandeja suficientemente grande para contener un baño de hielo alrededor del matraz de brazo lateral y sin entorpecer la visión del interior matraz y llenar la bandeja con hielo.
  4. Perforar dos agujeros 3 mm de diámetro en un tapón de goma para permitir el paso de 1) un tubo de cobre para entregar el gas al recipiente y 2) la sonda de un metro de oxígeno en el matraz de 2 l de brazo lateral (1 en la Figura 1B) .
  5. Haga una incisión lateral desde el borde del tapón a uno de los orificios para permitir el asentamiento del cable de la sonda de DO en el tapón.
  6. Conectar un acoplador con una manguera macho de 3 mmpúa a un trozo de tubo de cobre de 2 mm de diámetro (1 en la Figura 1A). Asegúrese de que este tubo es lo suficientemente largo para llegar a un radio de 10 cm de la parte inferior del matraz mientras que llegar a través del tapón.
  7. Colocar el tubo con el acoplador de que el segundo agujero en el tapón hasta que la longitud de la parte inferior del tapón es suficiente para alcanzar al menos de 10 cm de la parte inferior del matraz.
  8. Conectar un tubo de gas de polietileno de pared fina 0,75 m de longitud con un diámetro de 3 mm para el acoplador en el tubo.
  9. Deslizar tanto el sensor de oxígeno y el tubo de cobre en el matraz y sellar el frasco con el tapón.
  10. Verificación de un sello seguro entre el tapón y el frasco, así como un ajuste perfecto entre el tubo y el cable de la sonda dentro del tapón.
  11. Llenar un matraz de 1 l con 0,4 l de agua del grifo y coloque adyacente a la bandeja con el baño de hielo y el frasco vacío.
  12. Sumergir el tubo de polietileno procedentes de la gran matraz de vacío en el agua del matraz 1 L. asegurar latubo con cinta de tal manera que permanecerá sumergida a través del experimento.
  13. Conectar la línea de gas de diámetro 3 mm del frasco de vacío a una sala de burbujeo de aire acuario. Comience a burbujear el agua en el matraz de 2 L enchufando el burbujeador de acuario, que introduce aire de la habitación y oxígeno al agua.
  14. Monitorear la concentración de oxígeno y la temperatura del agua con el medidor de OD durante 5 minutos o hasta que se establece el equilibrio de la DO dentro de la cámara de tal manera que se produce un pequeño cambio en la DO.

3. Prueba de la estabilidad del montaje experimental

  1. Pruebe cada instalación para la estabilidad DO antes de la adición de la mosca de las piedras.
  2. Añadir tres o cuatro rocas en el matraz de 2 L de modo que tienen stoneflies sustrato propicio para flexiones de brazos.
  3. Comience una manipulación de prueba de la DO desconectando el tubo de gas del pelele y lo conecta a la línea de gas nitrógeno.
  4. Empezar burbujear nitrógeno a 20 pies cúbicos por hora (CFH) por aproximadamente 40seg a 1 min.
  5. Una vez que la DO ha bajado hasta 0.5 mg / L de la concentración objetivo, reducir el flujo a 15 CFH y permitir que la concentración disminuya hasta el objetivo.
  6. Alto el flujo de nitrógeno inmediatamente una vez que se alcanza la concentración objetivo.
  7. Utilice el burbujeador sala de aire de acuario para regresar la concentración a la concentración objetivo si la DO disminuye por debajo del objetivo.
  8. Si la DO es inestable durante el ensayo de una puesta a punto a continuación, comprobar el volumen de agua todavía está en el 1,9 L y no hay agua ha burbujeado a cabo, la temperatura del agua es estable y no cambia, y los sellos en todos los accesorios parecen ser apretadas y selladas.
  9. Una vez que los tres ensayos se han realizado y el experimentador tiene confianza en la capacidad de controlar la DO, conecte la tubería de gas de burbujeo y la burbuja al equilibrio de nuevo.
  10. Burbuja para el equilibrio uniendo la línea de gas de 3 mm de diámetro para el burbujeador de acuario y comenzar la adición de aire de la habitación al agua hasta que la concentración deoxígeno en el agua no aumenta o cambia por 3 min.
  11. Una vez en equilibrio, deje de burbujear y quitar el sello del frasco.

4. Stonefly Experimento push-up

  1. Se divide el número total de moscas de piedra por el número de observadores para determinar el número de ensayos a realizar.
  2. Determinar diferentes niveles de OD entre 2 y 10 mg / L para evaluar la respuesta de comportamiento de stoneflies (número de flexiones).
  3. Configurar un frasco por ensayo y añadir un número igual de stoneflies ya que no son observadores en el matraz (4 stoneflies dentro de este diseño), colocar la sonda y el tubo de nuevo en el frasco, a continuación, volver a sellar el frasco con el tapón de goma.
    Nota: Una inicial DO concentración de 10 mg / L fue elegido como el primer punto de observación, ya que era la concentración de oxígeno de la corriente desde donde se tomaron muestras de las moscas de piedra.
  4. Una vez que el agua está a 10 mg / L por burbujeo siguientes pasos 02/10 a 02/11, registrar la temperatura del agua de arranque y permitir elstoneflies para insertarse en el sustrato de roca en el matraz.
  5. Asignar sólo un observador para ver una sola stonefly para garantizar un recuento preciso del comportamiento de flexión de brazos, que es el movimiento del cuerpo hacia arriba y abajo exhibido por el stonefly.
  6. Contar y registrar el número de flexiones observados a lo largo de un período de observación de 3 min.
  7. Manipular hacer para el siguiente nivel de OD experimental y repetir período de observación de 3 minutos para los niveles experimentales adicionales.
    Nota: Dentro de este diseño experimental, se evaluaron tres diferentes niveles de OD.

5. Análisis estadístico

  1. Para llevar a cabo el análisis de utilización promedio estadístico de flexiones en los cuatro moscas de piedra a través de un grupo para un ensayo DO dado.
  2. Utilice el software de cálculo estadístico R libre 12 para llevar a cabo un análisis de la varianza (ANOVA) en el número de flexiones y las concentraciones a cabo con el fin de cada ensayo experimental (DO nivel) y la temperatura como covariates. Analizado DO como los niveles discretos de un solo factor.
  3. Utilice una prueba de normalidad de Anderson-Darling residuales para comprobar la normalidad 13.
  4. Realizar una regresión lineal de los datos mediante el trazado de la media del número de flexiones de brazos contra las concentraciones de OD.

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Resultados

Seis ensayos de la configuración descrita fueron realizadas por 24 estudiantes de primer año de licenciatura en un entorno de laboratorio de enseñanza para cuantificar el número de flexiones stoneflies realizan en respuesta a diferentes concentraciones de oxígeno en el agua. El número medio de flexiones realizado dentro de un nivel de OD y dentro de cada ensayo se agruparon para trazar flexiones contra el nivel de OD en la Figura 2. Se realizó un ANOVA inicialmente...

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Discusión

Los pasos críticos
Este procedimiento proporciona una manera sencilla y eficaz para manipular DO en un entorno de laboratorio para llevar a cabo estudios de comportamiento en los organismos acuáticos. Encontramos que hayan varios pasos / los elementos vitales para tener en cuenta al realizar este experimento que relaciona directamente con los resultados. Dentro de un ensayo, es crítico para mantener la presión de la cámara para evitar cambios en la presión parcial de los gases por encima del agua, y posterior DO ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores primero quieren agradecer a todos los estudiantes del primer año del laboratorio del Módulo de Biología 121- Ecología en Juniata College por su ayuda en la generación de datos utilizados en este estudio. También nos gustaría agradecer al Dr. Randy Bennett, Chris Walls, Sherry Isenberg y Taylor Cox por su ayuda en la adquisición de los materiales necesarios para desarrollar esta metodología. Además, nos gustaría agradecer al Dr. Norris Muth y al Dr. John Unger por sus consejos sobre el desarrollo metodológico y a la Dra. Jill Keeney y al departamento de Biología por su apoyo a este esfuerzo. También nos gustaría agradecer a los revisores anónimos que han ayudado a dar forma y enfoque a este manuscrito. Por último, pero no menos importante, me gustaría agradecer a Hudson Grant por su ayuda con la colección inicial de moscas de piedra para su uso en el desarrollo de esta técnica

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matraz filtrante 2 LPyrex5340
Tapón de goma tamaño 6Sigma-AldrichZ164534
Nalgene 180 Tubo de plástico transparenteThermo Scienfitic8001-1216
Bomba de aire Whisper 60Tetra
Standard flexible Tubo de línea de airePenn PlaxST25
0,25 pulgadas Tubo de cobreLowes Home Improvement23050
Lengüeta de manguera machoGrainger5LWH1
Conector hembraGrainger20YZ22
Medidor de oxígeno disuelto de alta resistenciaExtech407510
Gas nitrógenoMatheson TRIGAS
Radnor AF150-580 ReguladorAirgasRAD64003036

Referencias

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