Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico E. coli El uso de un sistema fluorescente represor operador

Summary

Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

Abstract

Los obstáculos presentes en el ADN, incluyendo proteínas unidas herméticamente y varias lesiones, pueden inhibir seriamente la progresión de la maquinaria de replicación de la célula. El estancamiento de un replisome puede conducir a su disociación de los cromosomas, ya sea en parte o en su totalidad, lo que lleva al colapso del tenedor de replicación. La recuperación de este colapso es una necesidad para que la célula con precisión completa la duplicación cromosómica y, posteriormente, dividir. diversos mecanismos, por lo tanto, cuando se produce el colapso, la célula ha evolucionado que se realizan para restaurar el tenedor de replicación del ADN y permitir que se completen con alta fidelidad. Anteriormente, estas vías de reparación de replicación en bacterias se han estudiado utilizando los rayos UV, que tiene la desventaja de no ser localizado en un sitio conocido. Este manuscrito describe un sistema que utiliza un sistema de fluorescencia represor de operador (FROS) para crear un bloque de proteína específica de sitio que puede inducir el estancamiento y el colapso de la replicación foRKS en Escherichia coli. Protocolos detalle cómo el estado de la replicación se puede visualizar en las células vivas individuales mediante microscopía de fluorescencia y la replicación del ADN intermedios pueden ser analizados por electroforesis en gel de agarosa al 2-dimensional. Mutantes sensibles a la temperatura de los componentes replisome (por ejemplo DnaBts) se pueden incorporar en el sistema para inducir un colapso síncrono de las horquillas de replicación. Por otra parte, las funciones de las proteínas de recombinación y helicasas que están implicados en estos procesos pueden ser estudiados utilizando knockouts genéticos dentro de este sistema.

Introduction

Durante la replicación del ADN, la replisome se enfrenta a obstáculos en el ADN que deterioran su progresión. Daño del ADN incluyendo lesiones y vacíos, así como estructuras aberrantes pueden prevenir la replisome de proceder ^1. Recientemente, se ha encontrado que las proteínas unidas al ADN son la fuente más común de impedimento a la replicación progresión tenedor ^2. El conocimiento de los eventos siguientes el encuentro de la replisome con un bloque de nucleoproteína previamente ha sido limitado por la incapacidad para inducir un bloque de este tipo en el cromosoma de una célula viva en una ubicación conocida. El análisis in vitro ha ....

Protocol

1. El bloqueo de la replicación con FROS

1. La inducción de la replicación de bloqueo
   1. Diluir un cultivo de una noche fresco de una E. cepa de E. coli que lleva una matriz de tetO y pKM1 ¹⁸ a OD _{600 nm} = 0,01 en un medio complejo diluido (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levadura, 0,1% NaCl, M KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO ₄ 0,17) con antibióticos como se requiere para la selección.
      Nota: No añadir tetraciclina para la selección, ya que no es compatible con este sistema. Hacer que el volumen del cultivo equivalente a 10 ml por muestra requeridos. Por eje....

Results

El FROS es un bloque de nucleoproteína inducible, específico del sitio que permite intermediarios de replicación para ser visualizados en las células vivas ^12,18. Un diseño experimental general para el muestreo de células se ilustra en la Figura 1. El momento de la toma de muestras y variaciones en los antecedentes genéticos hacen de este un sistema versátil para el estudio de la reparación de un bloque de este tipo. El esquema ilustra cómo sensibles a la temp.......

Discussion

Durante la duplicación cromosómica, la maquinaria de replicación encontrará varios impedimentos que impiden su progreso. Para garantizar que se replique todo el cromosoma de origen único, las bacterias tienen numerosas vías para la reparación del ADN que luego permiten que el replisoma se recargue^20,21. Las lesiones, las roturas monocatenarias, las roturas bicatenarias y las proteínas estrechamente unidas al ADN pueden tratarse utilizando una vía dedicada, aunque es probable que haya una superposición signific.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triptona	Sigma-Aldrich	16922	Componente del medio
de crecimiento Cloruro de sodio	VWR	27810.364	Componente del medio de crecimiento
Extracto	de levadura Sigma-Aldrich	92144	Componente del medio de crecimiento
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P9791	Componente del medio de crecimiento; Componente tampón de potasio
Fosfato de potasio dibásico	Sigma-Aldrich	P3786	Componente del medio de crecimiento; Componente tampón de potasio
L-arabinosa	Sigma-Aldrich	A3256	Para la inducción de la producción de TetR-YFP
Clorhidrato de anhidrotetraciclina	Sigma-Aldrich	37919	Liberación de bloackage de replicación
Axioskop 2 Microscopio de fluorescencia	Zeiss	452310	Visualización de células
Juego de filtros eYFP	Chroma Technology	41028	Visualización de la cámara CCD YFP
	Hamamatsu	Orca-AG	Visualización de células
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Versión 7.8.0.0 utilizado en la preparación de este manuscrito
Agarose	Bioline	BIO-41025	Para tapones de agarosa y electroforesis en gel
Vidrio original Repelente al agua (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	Para la fabricación de tapones de agarosa
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, componente
tampón TBEÁcido etilendiaminotetraacético	Ajax Finechem	AJA180	0,5 M EDTA solución salina disódica ajustada a pH 8,0 con NaOH.
Azida sódica	Sigma-Aldrich	S2002	Agente bacteriostático
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	258148	Componente tampón TE
Desoxicolato de sodio	Sigma-Aldrich	D6750	Componente tampón de lisis celular
N-Lauroilsarcosina sal sódica (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Lisis celular y componente tampón ESP
Rnasa A	Sigma-Aldrich	R6513	Componente tampón de lisis celular
Lisozima	Amresco	6300	Componente tampón de lisis celular
Proteinasa K	Amresco	AM0706	Componente tampón ESP
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Sistema de electroforesis
Transiluminador UV 2000	BioRad	1708110	Visualización del ADN
Bromuro de etidio	BioRad	1610433	Visualización del ADN
Ácido bórico	VWR	PROL20185.360	TBE componente
Hybond-XL nylon Memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) también se puede utilizar papel de
cromatografía Whatman de 3 mm	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blot
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Reticulación de ADN e hibridación
Ácido desoxirribonucleico de esperma de salmón	Sigma-Aldrich	31149	Componente tampón de hibridación
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S5881	Componente tampón de desnaturalización
Citrato trisódico dihidratado	VWR	PROL27833.363	Tampón de transferencia
Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)	Amresco	227	Componente tampón de lavado
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906	Componente tampón de hibridación
Imprimadores de hexámero aleatorio	Bioline	BIO-38028
Fragmento de Klenow	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosina 5'-trifosfato-< sup>32P-ATP	PerkinElmer
	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E pantalla estándar multiusos de 35 cm x 43 cm
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualización de blot
Botella de hibridación	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm