A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La evolución natural implica diversidad genética, como el cambio ambiental y una selección entre pequeñas poblaciones. La evolución adaptativa de laboratorio (ALE) se refiere a la situación experimental en la que se observa la evolución utilizando organismos vivos en condiciones controladas y factores estresantes; De este modo, los organismos se ven obligados artificialmente a realizar cambios evolutivos. Los microorganismos están sujetos a una variedad de factores estresantes en el medio ambiente y son capaces de regular ciertas proteínas inducibles por estrés para aumentar sus posibilidades de supervivencia. Las mutaciones espontáneas que ocurren naturalmente provocan cambios en el genoma de un microorganismo que afectan sus posibilidades de supervivencia. La exposición a largo plazo al cultivo de quimiostatos provoca una acumulación de mutaciones espontáneas y hace que la cepa más adaptable sea dominante. En comparación con los métodos de transferencia de colonias y transferencia en serie, el cultivo de quimiostatos implica el mayor número de divisiones celulares y, por lo tanto, el mayor número de poblaciones diversas. Aunque el cultivo de quimiomostáticos para el ALE requiere dispositivos de cultivo más complicados, es menos laborioso una vez que comienza la operación. Los análisis genómicos y del transcriptoma comparativos de la cepa adaptada proporcionan pistas evolutivas sobre cómo los factores estresantes contribuyen a las mutaciones que superan el estrés. El objetivo del presente trabajo es lograr una evolución acelerada de los microorganismos en condiciones controladas de laboratorio.
Introducción
Los microorganismos pueden sobrevivir y adaptarse a diversos ambientes. En situaciones de estrés severo, la adaptación puede ocurrir a través de la adquisición de fenotipos beneficiosos por mutaciones genómicas al azar y la selección positiva posterior 1-3. Por lo tanto, las células microbianas se pueden adaptar cambiando metabólica o las redes de regulación para un crecimiento óptimo, que se denomina "evolución adaptativa". microbianas tendencias recientes importantes, tales como brotes de superbacterias y la aparición de cepas microbianas resistentes, están muy estrechamente relacionados con la evolución adaptativa en condiciones de estrés. En condicione....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación del equipo
- Obtener un frasco quimiostato (150-250 ml) o un matraz Erlenmeyer (250 ml) que contiene un orificio de entrada y un puerto de salida. Conectar los puertos con tubo de silicona que permite velocidades de flujo de 10 a 100 ml / hr. Opcionalmente, utilizar una salida de aire, un puerto de salida de aire, y puertos de entrada y salida de agua de temperatura controlada.
- Obtener un dispositivo adecuado para el frasco chemostat que proporciona para el control de la agitación y la temperatura (o utilizar una incubadora de agitación rotatoria).
- Obtener dos bombas peristálticas con el fin de entregar medio fresco ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para la adaptación de alta tensión succinato, la de tipo salvaje E. coli cepa W3110 se cultivó en un quimiostato a D = 0,1 h-1 por 270 días (Figura 2).
Figura 2: High-succinato de adaptación al estrés de E. coli W3110 uso de la cultura quimiostato. flechas delgadas indican los momentos en que se aumentó la concentración de fac.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los microorganismos son capaces de adaptarse a casi todos los entornos debido a su rápida tasa de crecimiento y la diversidad genética. la evolución adaptativa de laboratorio permite a los microorganismos a evolucionar en condiciones diseñadas, lo que proporciona una manera de seleccionar los organismos individuales que albergan mutaciones espontáneas que son beneficiosos en las condiciones dadas.
La técnica quimiostato es más robusta para lograr la evolución impulsada artificialmente que la.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura de Corea (programa del Centro de Biología Sintética Inteligente 2012M3A6A8054887). P. Kim fue apoyado por una beca de la Universidad Católica de Corea (2015).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fermentador de mini-quimiostato | Biotron Inc. | - | fabricado por pedido especial |
| , tubo de silicona | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | el tamaño del tubo se puede variar en función de la tasa de dilución y del tamaño del frasco del fermentador. |
| tarro de depósito | Bellco | Media botella de almacenamiento | 20 L |
| productos químicos | Sigma-Aldrich-glucosa | de grado reactivo | |
| Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reactivo | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | para biología molecular, apto para cultivo celular, ≥ 99,5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | reactivo ACS, ≥ 99 |
| %Na2HPO4· 2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | reactivo ACS, ≥ 99% |
| MgSO4· 7H2O | 230391 | Sigma-Aldrich | , ≥ 98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | reactivo ACS, ≥ 96% |
| tiamina y middot; HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | grado de reactivo, ≥ 99% |
| Na2· succinato · 6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥ 99% |
Referencias
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
