En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.
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Artículo de método
Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos
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Resumen
Resumen
La única terapia definitiva para la insuficiencia cardíaca terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100,000 corazones de donantes para los procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos1-2. Debido al número limitado de donantes, solo se realizan aproximadamente 2,400 trasplantes cada año en los EE. UU.2. Se han llevado a cabo numerosos abordajes, desde estudios de terapia celular hasta la implantación de dispositivos de asistencia mecánica, ya sea solos o en combinación, en un intento de persuadir al corazón para que se repare a sí mismo o para que descanse el corazón que falla. A pesar de estos esfuerzos, los dispositivos de asistencia ventricular todavía se utilizan en gran medida con el propósito de tender puentes hacia el trasplante y la utilidad de las terapias celulares, si bien tienen cierta promesa curativa, todavía se limita a los ensayos clínicos. Además, se ha intentado un xenotrasplante directo, pero el éxito ha sido limitado debido al rechazo inmunitario. Claramente, se requiere otra estrategia para producir órganos adicionales para trasplante y, idealmente, estos órganos serían autólogos para evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida. La descelularización es un proceso de eliminación de células residentes de los tejidos para exponer la matriz extracelular nativa (MEC) o andamio. La descelularización por perfusión ofrece la preservación completa de la estructura tridimensional del tejido, al tiempo que deja intacta la mayor parte de las propiedades mecánicas del tejido4. Estos andamios se pueden utilizar para la repoblación con células sanas para generar modelos de investigación y, posiblemente, órganos muy necesarios para el trasplante. Hemos expuesto los andamios de ratones neonatos (P3), conocidos por conservar notables capacidades regenerativas cardíacas5-8, a la descelularización mediada por detergentes y hemos repoblado estos andamios con células cardíacas murinas. Estos estudios respaldan la factibilidad de diseñar una construcción de corazón neonatal. Además, permiten investigar si la MEC de los corazones postnatales tempranos puede albergar señales que resulten en mejores estrategias de recelularización.
Introducción
La insuficiencia cardíaca es común y mortal. Es una enfermedad progresiva que da como resultado la contractilidad disminuida del corazón, lo que impide el flujo de sangre a los órganos y las hojas de las demandas metabólicas de la insatisfecha cuerpo. Se estima que 5,7 millones de estadounidenses tienen insuficiencia cardiaca y es la primera causa de hospitalización en los Estados Unidos 9. El costo colectiva de tratamiento de los pacientes en la insuficiencia cardíaca en los Estados Unidos excede $ 300 mil millones de dólares por año 9-10. El único tratamiento definitivo para la insuficiencia cardíaca en fase terminal es el trasplante ortotópic....
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Minnesota.
1. Método para el ratón El aislamiento del corazón
- La eutanasia a un ratón neonatal por decapitación con una sola pala uso.
- Hisopo el tórax con 70% de etanol.
- Diseccionar la piel del pecho por el corte lejos de la pared del pecho con unas tijeras estándar, mientras que tirando de la piel lateralmente con un par de fórceps # 5.
- Perforar el abdomen justo por debajo del esternón con las tijeras de corte a través de la pare....
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Resultados
descelularización
En promedio, el tiempo para la descelularización de un corazón P3 usando este protocolo es de aproximadamente 14 hr. dado el peso del corazón promedio de 23 mg para el recién nacido P3.
Acellularity
La figura 3a muestra un corazón neonatal P3 completamente intacto (todo el montaje). La Figura 3b muestra el mismo corazón después de descelularizac.......
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Discusión
La dependencia de esta técnica en repetidas perfusiones del corazón hace que la evitación de una embolia un componente crítico de un resultado exitoso. Desde el cateterismo inicial del corazón en los pasos 2,2-2,6, a los cambios de solución entre pasos 2.8-2.14, existen manipulaciones que pueden permitir la introducción de burbujas de aire que comprometen el flujo de líquido de perfusión en el miocardio. Debido al tamaño diminuto del corazón neonatal, incluso burbujas hora en la vasculatura pueden causar un infarto técn.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Sra. Cynthia DeKay por la preparación de las figuras.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1. Materiales para el aislamiento del corazón del ratón | |||
| P1 (como se muestra; B6; D2-Tg (Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | o equivalente |
| 60 mm Placa de cultivo | BD Falcon | 353004 | o equivalente |
| Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 (estéril) | Hyclone | SH30256.01 | o equivalente |
| Hoja de un solo uso | Stanley | 28-510 | o equivalente |
| Tijeras estándar | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | o equivalente |
| Tijeras de resorte de 10 cm | Herramientas de ciencia fina | 15024-10 | o equivalente |
| Tijeras de resorte Vannas - 3 mm Herramientas | ciencia fina | de corte 15000-00 | o equivalente |
| #5 Pinzas | Dumnot (Herramientas de ciencia fina) | 11295-00 | o equivalente |
| 2. Materiales para la descelularizaciónAdaptador de | |||
| entrada | Chemglass | CG-1013 | tabique esterilizable en autoclave |
| Chemglass | CG-3022-99 | esterilizable en autoclave | |
| 1/8 pulg. ID x Tubo C-Flex de 3/8 de diámetro exterior | Cole-Parmer | EW-06422-10 | en autoclave |
| Luer macho a adaptador de lengüeta de manguera de 1/8" | McMaster-Carr | 51525K33 | esterilizable en autoclave |
| Luer hembra a adaptador de lengüeta de manguera de 1/8" | McMaster-Carr | 51525K26 | esterilizable en autoclave |
| Sutura quirúrgica Prolene 7-0 | Ethicon | 8648G | o equivalente |
| Soporte de anillo | Fisher Scientific | S47807 | o equivalente |
| Abrazadera | Fisher Scientific | 05-769-6Q | o equivalente |
| Abrazadera soporte regular | Fisher Scientific | 05-754Q | o |
| equivalente Barril de jeringa de 60 cc | Coviden | 1186000777T | o equivalente |
| Vaso de precipitados | Kimble | 14000250 | o equivalente |
| 22 G x 1 Jeringa | BD | 305155 o equivalente | |
| Jeringa de 12 cc | Coviden | 8881512878 | o equivalente |
| llave de paso de 3 vías | Smith Medical MX5311L | o equivalente | |
| Tubo PE50 | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Debe ser moldeable por el calor. Se recomienda polietileno. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Se recomienda el grado ultrapuro. Prepare una solución fresca y filtre la esterilización antes de usar. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare una solución fresca a partir de un 10% de caldo y filtre la esterilización antes de usar. |
| Agua purificada estéril con sistema dH2O | Hyclone | SH30538.02 | o MilliQ. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | o equivalente |
| 3. Materiales para la cuantificación de ADN | |||
| proteinasa | K | Fisher BP1700 | >30 U/mg, actividad |
| KCl | , Sigma-Aldrich, | P9333 | o equivalente |
| MgCl2· 6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | o equivalente |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | o equivalente |
| Tris base/clorhidrato | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | o |
| kit de ensayo Pico-Green dsDNA | Life Technologies | P7589 | requiere que el fluorímetro lea |
| 4. Método para la fijación y corte de tejido | |||
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | o gelatina |
| equivalente Tipo A de piel porcina | Sigma-Aldrich | G2500 | debe tener 300 bloom o más |
| 5. Método para la histología de tejidos | |||
| Criomoldes 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | o equivalente |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | o equivalente |
| Portaobjetos de microscopio 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | o |
| equivalente Hematoxilina 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | o equivalente |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | o equivalente |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | o equivalente |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | o equivalente |
| Eosina Alcohólica Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | o equivalente |
| Fórmula 83 Sustituto de xileno | CBG Biotech | CH0104B | o equivalente |
| Permount Mounting Mount | Fisher Chemical | SP15-500 | o equivalente |
| Anticuerpo de colágeno IV | Rockland | 600-401-106.1 | o equivalente |
| α-Anticuerpo de actinina | Abcam | AB9465 | o equivalente |
| mCherry Anticuerpo | Abcam | AB205402 | o equivalente |
| Anticuerpo NKX2.5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | o equivalente |
| Burro anti-ratón AF488 | Anticuerpo Life Technology | A21202 | o equivalente |
| Donkey anti-pollo AF594 Anticuerpo | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | o equivalente |
| Anticuerpo anti-cabra contra burros CY5 | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | o equivalente |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | o equivalente, |
| Prolong, Gold Antifade Mountant con DAPI | ThermoFisher | P36930 | o equivalente |
| 6. Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares neonatales mediante pre-siembra | |||
| (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | o equivalente |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-CL | o equivalente |
| Cell Sfilter | BD Falcon | 352340 | o equivalente |
| 50 ml tubo | BD Falcon | 352070 | o equivalente |
| Primeria 100 mm placas | Corning | 353803 | La superficie de Primeria mejora la adhesión de los fibroblastos promoviendo una mayor pureza de los miocitos |
| Tripsina | Difco | 215240 | o equivalente |
| DNasa II | Sigma-Aldrich | D8764 | o equivalente |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | o equivalente |
| Vitamina B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | o |
| placas equivalentes recubiertas de fibronectina | BD Bioscience | 354501 | o |
| equivalente Suero fetal bovino | Hyclone | SH30910.03 | o equivalente |
| Cristalería de biorreactor cardíaco | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Debe ser esterilizable en autoclave o gas. |
Referencias
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al.
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Reimpresiones y permisos
