Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

7.5K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/54459

⸱

5 de noviembre de 2016

 ,  , 
1Lillehei Heart Institute, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.

Resumen

La única terapia definitiva para la insuficiencia cardíaca terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100,000 corazones de donantes para los procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos1-2. Debido al número limitado de donantes, solo se realizan aproximadamente 2,400 trasplantes cada año en los EE. UU.2. Se han llevado a cabo numerosos abordajes, desde estudios de terapia celular hasta la implantación de dispositivos de asistencia mecánica, ya sea solos o en combinación, en un intento de persuadir al corazón para que se repare a sí mismo o para que descanse el corazón que falla. A pesar de estos esfuerzos, los dispositivos de asistencia ventricular todavía se utilizan en gran medida con el propósito de tender puentes hacia el trasplante y la utilidad de las terapias celulares, si bien tienen cierta promesa curativa, todavía se limita a los ensayos clínicos. Además, se ha intentado un xenotrasplante directo, pero el éxito ha sido limitado debido al rechazo inmunitario. Claramente, se requiere otra estrategia para producir órganos adicionales para trasplante y, idealmente, estos órganos serían autólogos para evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida. La descelularización es un proceso de eliminación de células residentes de los tejidos para exponer la matriz extracelular nativa (MEC) o andamio. La descelularización por perfusión ofrece la preservación completa de la estructura tridimensional del tejido, al tiempo que deja intacta la mayor parte de las propiedades mecánicas del tejido4. Estos andamios se pueden utilizar para la repoblación con células sanas para generar modelos de investigación y, posiblemente, órganos muy necesarios para el trasplante. Hemos expuesto los andamios de ratones neonatos (P3), conocidos por conservar notables capacidades regenerativas cardíacas5-8, a la descelularización mediada por detergentes y hemos repoblado estos andamios con células cardíacas murinas. Estos estudios respaldan la factibilidad de diseñar una construcción de corazón neonatal. Además, permiten investigar si la MEC de los corazones postnatales tempranos puede albergar señales que resulten en mejores estrategias de recelularización.

Introducción

La insuficiencia cardíaca es común y mortal. Es una enfermedad progresiva que da como resultado la contractilidad disminuida del corazón, lo que impide el flujo de sangre a los órganos y las hojas de las demandas metabólicas de la insatisfecha cuerpo. Se estima que 5,7 millones de estadounidenses tienen insuficiencia cardiaca y es la primera causa de hospitalización en los Estados Unidos 9. El costo colectiva de tratamiento de los pacientes en la insuficiencia cardíaca en los Estados Unidos excede $ 300 mil millones de dólares por año 9-10. El único tratamiento definitivo para la insuficiencia cardíaca en fase terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100.000 corazones de donantes para procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos 1-2. Debido al limitado número de donantes, sólo aproximadamente 2.400 trasplantes se realizan cada año en los EE.UU. 2. Claramente, esta escasez de órganos debe ser abordado ya que se requieren otras estrategias para producir órganos adicionales para Transplantala e, idealmente, estos órganos sería autólogo a fin de evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida.

Cardiomiocitos adultos de mamíferos demuestran una capacidad regenerativa limitada después de la lesión, pero la evidencia reciente sugiere que los corazones neonatales de mamíferos mantienen una notable capacidad de regeneración después de la lesión 5-8. En concreto, después de la resección quirúrgica parcial, una ventana regenerativa ha descubierto entre el nacimiento y postnatal día 7. Este período de regeneración se caracteriza por una falta de cicatriz fibrótica, formación de neovascularización, liberación de factores angiogénicos del epicardio, y la proliferación de los cardiomiocitos 5-8 , 11. Esta ventana de regeneración de tiempo proporciona la posibilidad de utilizar el corazón neonatal como una nueva fuente de material para el desarrollo de un corazón bioartificial.

La matriz extracelular es conocido proporcionar señales importantes para promover cardiomyocytproliferación e y el crecimiento. Claras diferencias en la disponibilidad de las moléculas en las matrices neonatales y adultos 12 y su capacidad para promover la regeneración se han explorado 13. matrices adultos descelularizado se han utilizado en varios estudios para proporcionar un andamio ECM para la repoblación celular y la generación de un corazón bioartificial. Si bien estos estudios, y los nuevos descubrimientos en tecnologías de células madre, están avanzando rápidamente, varios obstáculos aún no se han cumplido. Por ejemplo, las limitaciones en la preservación de la estructura nativa de la matriz, la integración celular en la pared de la matriz, y la capacidad para apoyar la proliferación y el crecimiento de todos limitan el éxito de este enfoque. Mientras que los atributos regenerativos superiores se han atribuido al corazón neonatal, los aspectos prácticos del uso de un pañuelo de papel tales han limitado su exploración.

Sobre la base de la capacidad de regeneración demostrado del corazón neonatal, hemos desarrollado nuevas matrices mediante el desarrollo de unatécnica de descelularización para el corazón P3 ratón. El corazón P3 fue elegido para estos estudios, ya que se encuentra dentro de la ventana de la regeneración cardiaca como se determina previamente 6 pero el corazón es lo suficientemente grande para la cosecha, decellularize y recellularize. El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de crear una matriz de un corazón neonatal de ratón. Nuestros estudios proporcionan evidencia de la viabilidad de decellularizing un minuto, corazón neonatal mientras se mantiene la integridad estructural y proteico de la ECM. También demostramos la capacidad de recellularize este ECM cardiaca con mCherry cardiomiocitos expresan y hemos examinado estos cardiomiocitos para la expresión de diversos marcadores cardíacos siguientes recelularización. Esta tecnología permitirá para la prueba de la superioridad de una matriz neonatal para el desarrollo de un corazón bioartificial.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Minnesota.

1. Método para el ratón El aislamiento del corazón

  1. La eutanasia a un ratón neonatal por decapitación con una sola pala uso.
  2. Hisopo el tórax con 70% de etanol.
  3. Diseccionar la piel del pecho por el corte lejos de la pared del pecho con unas tijeras estándar, mientras que tirando de la piel lateralmente con un par de fórceps # 5.
  4. Perforar el abdomen justo por debajo del esternón con las tijeras de corte a través de la pared abdominal. Agarrando el proceso xifoides con # 5 pinzas, retraer el esternón rostral del cuerpo durante el corte, aunque los nervios de cada lado del pecho con las tijeras. La caja torácica se refleja superiormente con las pinzas para revelar el corazón.
  5. Sin rodeos diseccionar los dos lóbulos principales del timo tirando lateralmente con # 5 pinzas, exponiendoel arco de la aorta, así como las venas cavas y pulmonares.
  6. Seccionar las arterias principales de la arco aórtico, y la propia aorta, con las tijeras de primavera 10 cm. Conservar la aorta entre la base del corazón y la arteria braquiocefálica. Agarre los extremos de los vasos cortados con el # 5 fórceps para reflejar el corazón hacia delante, separándola de la tráquea y el esófago.
  7. Seccionar la vasculatura pulmonar y otras venas principales, mediante el corte entre los pulmones y el corazón en ambos lados del corazón con las tijeras de primavera 10 cm. Las venas permanecen abiertos para proporcionar un drenaje.
  8. Retire el corazón del mediastino con el # 5 pinzas, agarrando los extremos cortados de los grandes vasos. Coloque el corazón en una placa de cultivo de 60 mm que contiene solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para la cateterización.

2. Método para la descelularización por perfusión de Langendorff

  1. Preparar el conjunto de catéter con antelación. Dibuje una sección de 4 cmde PE 50 tubos en una pequeña llama de alcohol para crear un catéter más pequeño, más delgado. Recorte los extremos con una cuchilla para cumplir con las dimensiones (aprox. 300 m OD diámetro exterior con una brida de aprox. OD 500 micras) que se muestra en la Figura 1. Esto proporcionará dos catéteres simétricas a cada lado de la lengüeta de arrastre.
  2. Apunte el extremo cortado de la tubería en la llama brevemente, para fundir una brida en la abertura en el extremo delgado.
  3. Llene la jeringa 12 ml con PBS y montar el catéter mediante la colocación de una llave de paso de 3 vías en la jeringa. Añadir un 22 G x 1 aguja a la llave de paso y empujar la aguja a través del septum. Deslizar el catéter tubo de PE dibujado en la aguja (Fig. 1).
  4. El riego de las piezas ensambladas con PBS, asegurando que todas las burbujas de aire se han eliminado.
  5. Insertar el catéter, preparado como se describe anteriormente, en la aorta del corazón aislado, que no se extiende más allá de la válvula aórtica y se liga con un lazo de sutura 7-0. Descansar la brida de tél catéter proximalmente contra el lazo, haciendo un sellado hermético y evitando que el corazón se salga del catéter.
  6. Observe el cateterismo con una lupa, mientras que la perfusión suavemente el corazón usando la jeringa que contiene PBS. Asegúrese de que no hay fugas en el sistema y el tejido blanches homogéneamente como se extrae la sangre latente.
  7. Coloque el septum en el cuello del adaptador de entrada y sellarlo por plegado de los lados sobre el cristal.
  8. Una el depósito lleno con 60 ml de 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS) en agua destilada (dH 2 O) a través de una línea de longitud suficiente para producir una columna que genera 20 mm Hg de presión como se muestra en la Fig. 1. Calcular la presión de la altura de la columna de líquido basado en la relación de 1 mm Hg es igual a 1,3595 cm H 2 O.
    Precaución: El SDS es un polvo altamente floculante con propiedades irritantes. Contacto debe ser evitado. Manejar el polvo usando la ropa protectora adecuada.
  9. Perfundir el corazón con SDS al 1% durante 14 horas. El corazón será transparente en apariencia sin tejido restante observable.
  10. Enjuague el sistema hasta la llave de paso de la solución de SDS restante y reemplazarlo con 10 ml de dH2O Perfundir el corazón con 10 ml 1% de Triton X-100 (diluido en agua destilada), seguido de 10 ml dH 2 O, seguido de 60 ml de PBS que contenía penicilina estreptomicina 1x (Pen-Strep).
  11. Almacenar el corazón en PBS con 1 Pen-Strep a 4 ° C. Si la aplicación de post descelularización destinado requiere perfusión entonces el catéter en la aorta se debe mantener, de lo contrario cortar el lazo de sutura y retirar el catéter.

Determinación 3. ADN

  1. Preparar un resumen del corazón ECM o control descelularizada utilizando 200 mg / ml de proteinasa K en KCl 50 mM, MgCl 2,5 mM 2, 0,45% de Tween 20 en Tris 10 mM (pH 8,3).
  2. Incubar el tejido en 55 ° C con agitación hasta que se disuelve el tejido,típicamente 4-5 horas.
  3. Cuantificar el contenido de ADN del homogeneizado con un ensayo de unión al ADN 4,11.

4. La fijación y seccionamiento de Tejido

  1. Fijar descelularizado corazones, recelularizado o P3 de control en 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Lavar el tejido en PBS 3x.
  3. Coloque el tejido en una solución de 7,5% de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M a 4 ° C hasta que se hunde.
  4. Cambie la solución a 15% de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M a 4 ° C, de nuevo, hasta que se hunde.
  5. Calentar el tejido a 37 ° C, sustituir la mitad del volumen con una solución de gelatina en 15% de sacarosa y tampón fosfato 0,1 M y equilibrar durante la noche. Las concentraciones de gelatina se incrementan por etapas a través de 1%, 2,5%, 5% y finalmente 7,5% dos veces.
  6. Colocar las muestras en criomoldes utilizando fresca 7,5% de gelatina. Para restaurar la forma de las muestras descelularizados, gelatina líquida se puede perfundió en las cámaras como tél corazones se moldean. Congelar flotando los criomoldes en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C.
  7. Cut (10 m de espesor) secciones con un criostato. Llevar la corredera cerca de la superficie de la sección y observe la sección de moverse fuera de la cuchilla sobre la superficie debido a la carga de los portaobjetos tratados electrostáticamente. Se secan los portaobjetos durante la noche y almacenar a -80 ° C para su posterior análisis.
  8. Retire los portaobjetos del congelador, se equilibre a temperatura ambiente y luego se coloca en un frasco Coplin con PBS durante 20 minutos a 37 ° C para disolver la gelatina.
  9. Manchar las secciones de corte desde el paso 4.7 con hematoxilina y eosina. Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin. Exponer las diapositivas hidratados en el paso 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, el agua del grifo durante 1,5 min, tampón durante 3 minutos, el agua del grifo durante 1 minuto, agente de azulado durante 1,5 minutos, etanol al 80% durante 1 min, alcohólica eosina Y durante 8 s, 80% de etanol durante 1 min, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de eliminación (sustituto xileno) durante 1 min 3x, cubreobjetos con resinaMedio de montaje basado. Examinar los portaobjetos al microscopio.
  10. Para confirmar la retención de proteínas ECM reactividad de la ECM corazón, mancha para las proteínas estructurales de ECM tales como colágeno IV mediante la colocación de las diapositivas hidratados en una cámara humidificada y se trata con 10% de suero normal de burro (NDS) en solución salina tamponada con fosfato con 0,1% Triton -X100 (PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Utilizar un volumen suficiente para cubrir las secciones de tejido.
  11. Reemplazar la solución con el anticuerpo primario de elección a una dilución determinada empíricamente en 5% NDS / PBST. Por ejemplo, el anticuerpo de colágeno IV se diluyó en 1: 150. Incubar toda la noche a 4 ° C.
  12. Lavar los portaobjetos con PBST 3 veces y aplicar un anticuerpo secundario de elección conjugado con un colorante fluorescente. Diluir el anticuerpo en una cantidad determinada empíricamente. Incubar durante 1 hora a RT. Lavar 3x con PBS.
  13. Tinción de los portaobjetos con un tinte de unión al ADN tales como DAPI para verificar la ausencia de núcleos de células mediante el uso de un mounti DAPI que contieneng medio cuando la cubierta se deslice las diapositivas.
  14. Examinar los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia de 50 a 400X.

5. P1 neonatal murino ventricular cardiomiocitos para recelularización

  1. Rociar cada cachorro con un 70% de etanol y decapitar con una sola pala uso.
  2. Mantenga cada cachorro entre el pulgar y el índice, mientras que el tórax se divide en la línea media con pequeñas tijeras estériles para exponer la cavidad torácica. Aplicar presión para permitir que el corazón sobresalga libremente desde el pecho mientras se corta libre de los grandes vasos y las aurículas dejando sólo el tejido ventricular.
  3. Coloque cada corazón directamente en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml de calcio enfriado en hielo, solución salina tamponada de bicarbonato libre de Hank con mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico 20 (CBFHH) hasta que se recogen todos los corazones.
  4. Aspirar el CBFHH y añadir 10 a 15 ml de CBFHH fresco (enfriado con hielo) en el tubo. Lavar el tejido haciendo girar el tejido en tél tubo varias veces.
  5. Decantar la solución que contiene el corazón en una placa de Petri de plástico 60 mm.
  6. Diseccionar cualquier tejido auricular latente de los corazones con una lupa en el hielo por el recorte alejado de los corazones con las tijeras de primavera. Picar los ventrículos en trozos pequeños de tamaño homogénea. Eliminar cualquier tejido no ventricular separado del plato con # 5 pinzas.
  7. Pipet tanto de la solución de CBFHH como se necesita para la transferencia de los fragmentos de tejido en un pequeño vial estéril que contiene una barra de agitación micro estéril.
  8. Permitir que el tejido de sedimento al fondo del vial y eliminar la solución de CBFHH.
  9. Completar hasta 50 ml de una solución de enzima 1,75 mg / ml de tripsina, 20 mg / ml de ADNasa II en CBFHH. Pipeta de 5 ml de esta solución de enzima y añadirlo a un tubo que contiene tejido ventricular picada y el lugar en un agitador magnético. Se agita a una velocidad constante (340 rpm) a temperatura ambiente durante 8 min.
    NOTA: La acción de agitación debe ser suave y sin embargo permitirpara la suspensión de la suspensión.
  10. Retire el vial de la placa de agitación y permitir la suspensión para sedimentar durante 3 min. Pipetear y desechar el sobrenadante inicial de digerir, ya que contiene principalmente células de sangre y restos de tejido.
  11. Pipetear una segunda alícuota de 5 ml de la solución de enzima y añadirlo al ventrículo digestión. Se agita durante 8 minutos y dejar que se sedimente durante otras 3 min. Antes de comenzar las digestiones, preparar dos tubos de 50 ml (marcado 1 y 2) que contienen cada uno 12 ml de suero bovino fetal de hielo frío (FBS). Coloque un filtro de células de 40 micras encima de cada tubo. Pipeta de este sobrenadante a través del filtro en el tubo 1.
  12. Repetir el proceso de digestión adicionales 8 veces, alternando la colocación del sobrenadante digest entre los dos tubos que contienen FBS. Dividir el último sobrenadante por igual entre los tubos 1 y 2 para asegurar volúmenes iguales en cada tubo.
    NOTA: Cada tubo de recogida contendrá ahora 32,5 ml de volumen total de suspensión de células.
  13. Centrifugar los tubos contienening el gx 150 sobrenadante durante 6 min a 4 ° C.
  14. Durante la percepción de las alícuotas de digestión, se preparan cinco placas de cultivo de 100 mm de tejido con 6 ml de medio de Dulbecco (Modificado de Eagle Media (DMEM) con 10% de SFB, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alícuotas a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min para equilibrar los medios de comunicación.
  15. Aspirar la mezcla de enzimas CBFHH y resuspender las células en el 30 ml de medio de cultivo preparado anteriormente, la combinación de las células de ambos tubos de recogida.
  16. Retorno 6 ml de suspensión celular a cada uno de las placas de 100 mm y se incuba durante 45 min a 37 ° C.
  17. Al final de la incubación, transferir las células no adherentes a 5 nuevos platos y volver a incubar durante 45 min (la fracción de fibroblastos habrá comenzado a adherirse a los platos y se puede cultivar por separado si se desea).
  18. Al final de la segunda ronda de pre-recubrimiento, recoger los medios de comunicación y las células no adherentes de los platos y hacer girar los medios de comunicación en 150g durante 6 min.
  19. Dibuje el exceso de medios de comunicación para llevar las células a la concentración aproximada deseada, (4,0 x 10 5 células por constructo en 100 l de líquido de perfusión). Retirar una alícuota para el recuento y la viabilidad o la prueba 14.

6. Bioreactor recelularización de P3 Matrix corazón

  1. Tratar previamente la matriz de corazón aislado con medios de cultivo (véase el paso 5.15) durante la noche antes de añadir las células.
  2. Montar los elementos de un sistema Langendorff como se muestra en la Fig. 2. Autoclave las piezas de vidrio y óxido de etileno esterilizar las piezas de plástico para asegurar la esterilidad. Varias unidades secundarias del sistema se pueden montar en una campana de flujo laminar antes de ser montado en el soporte de apoyo. Baño de agua circulante y la trayectoria del flujo de agua caliente se ha omitido para mayor claridad.
  3. Llenar el sistema ensamblado con 120 ml de medio de cultivo tisular (véase el paso 5.15).
  4. Coloque la matriz corazón sondaje de la Etapa 2,14 en un 60 mm culplato tura bajo ampliación y conectar una jeringa de 1 ml con 22 G x 1 de la aguja cargada con suspensión de células de la Etapa 5,20 al catéter. Asegúrese de que este montaje es libre de burbujas de aire para evitar la embolización del corazón.
  5. perfundir suavemente los 100 l de suspensión de células en la matriz de corazón a través de las arterias coronarias. Una vez completado, desconecte la combinación jeringa / aguja.
    NOTA: Una perfusión lenta de aprox. Se requiere 20 l por min para evitar que las células de las que fluye hacia fuera de las venas, que transitan por el corazón.
  6. Con un trozo romo 22g asegurado a la conexión Luer en la parte inferior de la tapa del frasco corazón biorreactor, empujar el catéter sobre el trozo.
  7. Arrancar la bomba peristáltica y observar que el flujo como se indica en la Figura 2. El flujo avanza desde el depósito a través de la bomba a través de la trampa de burbujas al catéter colocado en la aorta en el paso 2.5 (camino rojo en la Fig. 2). Observar el flujo de la circulación cardiaca de la venas y gotear desde el ápice, de recirculación al depósito de los medios de comunicación.
    NOTA: La velocidad de flujo de perfusión depende de factores individuales, tales como la resistencia vascular de la construcción, y el tamaño del corazón, pero una tasa de 50 a 100 l / min es un buen punto de partida. En los puntos de tiempo intermedios, evaluaciones funcionales se pueden ejecutar. La escala de tamaño del corazón recelularizado neonatal limita las evaluaciones, que se pueden realizar, pero hemos determinado que los sistemas basados ópticamente se pueden utilizar para cuantificar superando el comportamiento de la misma manera que se han utilizado en corazones de ratas adultas. 4 El constructo puede ser perfundido para Extended períodos de tiempo (hasta 23 horas).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

descelularización
En promedio, el tiempo para la descelularización de un corazón P3 usando este protocolo es de aproximadamente 14 hr. dado el peso del corazón promedio de 23 mg para el recién nacido P3.

Acellularity
La figura 3a muestra un corazón neonatal P3 completamente intacto (todo el montaje). La Figura 3b muestra el mismo corazón después de descelularizac...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La dependencia de esta técnica en repetidas perfusiones del corazón hace que la evitación de una embolia un componente crítico de un resultado exitoso. Desde el cateterismo inicial del corazón en los pasos 2,2-2,6, a los cambios de solución entre pasos 2.8-2.14, existen manipulaciones que pueden permitir la introducción de burbujas de aire que comprometen el flujo de líquido de perfusión en el miocardio. Debido al tamaño diminuto del corazón neonatal, incluso burbujas hora en la vasculatura pueden causar un infarto técn...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Sra. Cynthia DeKay por la preparación de las figuras.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1. Materiales para el aislamiento del corazón del ratón
P1 (como se muestra; B6; D2-Tg (Myh6*-mCherry)2Mik/J)Jackson Laboratories21577o equivalente
60 mm Placa de cultivoBD Falcon353004o equivalente
Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 (estéril)HycloneSH30256.01o equivalente
Hoja de un solo usoStanley28-510o equivalente
Tijeras estándarMoria Bonn (Fine Science Tools)14381-43o equivalente
Tijeras de resorte de 10 cmHerramientas de ciencia fina15024-10o equivalente
Tijeras de resorte Vannas - 3 mm Herramientasciencia finade corte 15000-00o equivalente
#5 PinzasDumnot (Herramientas de ciencia fina)11295-00o equivalente
2. Materiales para la descelularizaciónAdaptador de
entradaChemglassCG-1013tabique esterilizable en autoclave
ChemglassCG-3022-99esterilizable en autoclave
1/8 pulg. ID x Tubo C-Flex de 3/8 de diámetro exteriorCole-ParmerEW-06422-10en autoclave
Luer macho a adaptador de lengüeta de manguera de 1/8"McMaster-Carr51525K33esterilizable en autoclave
Luer hembra a adaptador de lengüeta de manguera de 1/8"McMaster-Carr51525K26esterilizable en autoclave
Sutura quirúrgica Prolene 7-0 Ethicon8648Go equivalente
Soporte de anilloFisher ScientificS47807o equivalente
AbrazaderaFisher Scientific05-769-6Qo equivalente
Abrazadera soporte regularFisher Scientific05-754Qo
equivalente Barril de jeringa de 60 cc Coviden1186000777To equivalente
Vaso de precipitadosKimble14000250o equivalente
22 G x 1 JeringaBD305155 o equivalente
Jeringa de 12 ccCoviden8881512878o equivalente
llave de paso de 3 víasSmith Medical MX5311Lo equivalente
Tubo PE50BD Clay Adams Intramedic427411Debe ser moldeable por el calor. Se recomienda polietileno.
1% SDSInvitrogen15525-017Se recomienda el grado ultrapuro. Prepare una solución fresca y filtre la esterilización antes de usar.
1% Triton X-100 Sigma-AldrichT8787Prepare una solución fresca a partir de un 10% de caldo y filtre la esterilización antes de usar.
Agua purificada estéril con sistema dH2OHycloneSH30538.02o MilliQ.
1x Pen/StrepCorning CellGro30-001-Clo equivalente
 
3. Materiales para la cuantificación de ADN
proteinasaKFisher BP1700>30 U/mg, actividad
KCl, Sigma-Aldrich,P9333o equivalente
MgCl2· 6H2OMallinckrodt5958-04o equivalente
Tween 20 Sigma-AldrichP1379o equivalente
Tris base/clorhidratoSigma-AldrichT1503/T5941o
kit de ensayo Pico-Green dsDNALife Technologies P7589requiere que el fluorímetro lea
4. Método para la fijación y corte de tejido
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148o gelatina
equivalente Tipo A de piel porcinaSigma-AldrichG2500debe tener 300 bloom o más
5. Método para la histología de tejidos
Criomoldes 10 x 10 x 5 mmTissue-Tek4565o equivalente
CryostatHacker/BrightModel OTFo equivalente
Portaobjetos de microscopio  25 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-19o
equivalente Hematoxilina 560 Surgipath/Leica Selectech 3801570o equivalente
EthanolDecon Laboratories2701o equivalente
DefineSurgipath/Leica Selectech 3803590o equivalente
Blue buffer Surgipath/Leica Selectech 3802915o equivalente
Eosina Alcohólica Y 515 Surgipath/Leica Selectech 3801615o equivalente
Fórmula 83 Sustituto de xileno CBG Biotech CH0104Bo equivalente
Permount Mounting Mount Fisher Chemical SP15-500o equivalente
Anticuerpo de colágeno IVRockland600-401-106.1o equivalente
α-Anticuerpo de actininaAbcamAB9465o equivalente
mCherry AnticuerpoAbcamAB205402o equivalente
Anticuerpo NKX2.5Santa Cruz BiotechnologySC-8697o equivalente
Burro anti-ratón AF488 Anticuerpo Life TechnologyA21202o equivalente
Donkey anti-pollo AF594 AnticuerpoJackson Immunoresearch703-585-155 o equivalente
Anticuerpo anti-cabra contra burros CY5Jackson Immunoresearch 705-175-147o equivalente
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), AF594Jackson Immunoresearch111-587-003o equivalente,
Prolong, Gold Antifade Mountant con DAPIThermoFisherP36930o equivalente
6. Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares neonatales mediante pre-siembra
(Ca, Mg Free)HycloneSH30031.02o equivalente
HEPES (1 M)Corning CellGro25-060-CLo equivalente
Cell SfilterBD Falcon352340o equivalente
50 ml tuboBD Falcon352070o equivalente
Primeria 100 mm placasCorning353803La superficie de Primeria mejora la adhesión de los fibroblastos promoviendo una mayor pureza de los miocitos
TripsinaDifco215240o equivalente
DNasa IISigma-AldrichD8764o equivalente
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)HycloneSH30022.01o equivalente
Vitamina B12 Sigma-AldrichV6629o
placas equivalentes recubiertas de fibronectina BD Bioscience354501o
equivalente Suero fetal bovino HycloneSH30910.03o equivalente
Cristalería de biorreactor cardíacoRadnoti Glass Technology120101BEZDebe ser esterilizable en autoclave o gas.
de de filo esterilizable > fuerte, , , : equivalente , , ,

Referencias

  1. Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
  2. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  3. Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
  6. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  7. Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).
  8. Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
  9. Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
  10. Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
  11. Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
  12. Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
  13. Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
  15. Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
  16. Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
  17. Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Andamio cardíaco neonataldescelularización cardíacadescelularización por perfusiónmatriz extracelularrecelularización tisularcorazón de ratón neonatalperfusión con SDSregeneración cardíacainteracción célula-matrizrepoblación del andamio
Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.