Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos

Resumen

Este protocolo describe el enriquecimiento rápido de leucocitos a partir de pequeñas muestras de sangre para una posterior determinación específica de la actividad de la peroxidasa halogenante dentro de las células. El método puede aplicarse a material humano y no humano y puede contribuir a la evaluación de nuevos marcadores inflamatorios.

Resumen

En este trabajo se describe un protocolo para el enriquecimiento rápido y estandarizado de los leucocitos de pequeñas muestras de sangre entera. Este procedimiento se basa en la lisis hipotónica de los eritrocitos y se puede aplicar a las muestras de humanos, así como a la sangre de origen no humano. El pequeño volumen de muestra inicial de alrededor de 50 a 100 l hace que este método es aplicable a muestras de sangre recurrente de pequeños animales de laboratorio. Por otra parte, el enriquecimiento de leucocitos se logra en cuestión de minutos y con esfuerzos materiales bajos en relación con los productos químicos y la instrumentación, por lo que este método aplicable en múltiples entornos de laboratorio.

Purificación estandarizada de los leucocitos se combina con un método altamente selectivo tinción para evaluar la actividad peroxidasa de halogenación de las peroxidasas heme, la mieloperoxidasa (MPO) y la peroxidasa de eosinófilos (EPO), es decir, la formación de hipocloroso y ácido hipobromoso (HOCl y HOBr). Mientras MPO se expresa fuertemente en neutrophils, el tipo de célula inmune más abundante en la sangre humana, así como en los monocitos, la enzima relacionada EPO se expresa exclusivamente en los eosinófilos. La actividad de halogenación de estas enzimas se aborda mediante la fluoresceína casi HOCl- y HOBr específica colorante aminofenil (APF) y el peróxido de hidrógeno sustrato de peroxidasa primaria. Tras el análisis de citometría de flujo subsiguiente todas las células peroxidasa positiva (neutrófilos, monocitos, eosinófilos) son distinguibles y su actividad peroxidasa de halogenación pueden ser cuantificados. Desde tinción APF se puede combinar con la aplicación de marcadores de superficie celular, este protocolo se puede extender para tratar específicamente de leucocitos subfracciones. El método es aplicable para detectar la producción de HOCl y HOBr tanto en humanos y en los leucocitos de roedores.

Dado el papel inmunológica ampliamente y diversamente discutido de estos productos enzimáticos en enfermedades inflamatorias crónicas, este protocolo puede contribuir a una mejor comprensión de larelevancia inmunológica de peroxidasas heme derivadas de leucocitos.

Introducción

Los leucocitos polimorfonucleares (PMNs, también llamados granulocitos) y los monocitos representan importantes componentes celulares del sistema inmune innato en el ^1,2 sangre. Contribuyen a la principal defensa contra los patógenos, así como a la activación del sistema inmune adquirido y la iniciación de una respuesta inflamatoria sistémica ^2-4. Sin embargo, especialmente neutrófilos, el tipo más abundante de los granulocitos y monocitos también contribuyen significativamente a la regulación y la terminación de los eventos inflamatorios agudos ^5. Por lo tanto estas células también pueden desempeñar un papel importante en las enferme....

Protocolo

Todas las muestras de sangre humana se obtuvieron de voluntarios sanos, y el protocolo de leucocitos enriquecimiento aplicado sigue las directrices de la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Leipzig. Los experimentos con sangre de rata fueron aprobados por el comité de ética local responsable (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), de acuerdo con las directrices alemanas sobre el cuidado y uso de animales.

1. Configuración Experimental

NOTA: Como el procedimiento de lisis hipotónica para el agotamiento de los eritrocitos de las muestras de sangre es un procedimiento crítico en el tiem....

Resultados

Como se informó anteriormente el método descrito anteriormente resultó ser aplicable tanto al ser humano y a los materiales no humano ^32. Por otra parte, como se muestra para los ratones con síntomas asmáticos la tinción APF puede ser una herramienta adecuada para detectar diferencias en el estado pro-inflamatoria sistémica. Por lo tanto en un estudio posterior se utilizó este protocolo para evaluar la actividad de halogenación repetidamente de MPO (y EPO) en ratas hembras

Discusión

Como los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana el aislamiento de células peroxidasa positiva a menudo sólo se centra en estas células e incluye una separación de los neutrófilos de otros leucocitos por centrifugación en gradiente de densidad ^38. Sin embargo, como los neutrófilos son mucho menos abundantes en las muestras de sangre murinos ³⁹ para los últimos métodos más complicados tienen que utilizarse ^40. Además ambos métodos también conducen a la eliminació.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales/Equipos
15 ml Tubos de centrifugación	VWR/Corning	734-0451-1,5
ml	VWR/Eppendorf	211-2130DE-Pipetas
para volúmenes de hasta 5 ml	Eppendorf	p. ej., 3120000070	Utilizamos pipetas Eppendorf Resarch plus con volúmenes ajustables en el rango de 1 a 10 y micro; l, 10-100 y micro; l, 100-1.000 y micro; l an 500-5.000 µ l
banco de flujo laminar	Thermo Electron Corperation	HeraSafe-Vortex
mezclador	Bender & Hobein AG	Vortex Genie 2
centrífugas de sobremesa	Kendro Productos de laboratorio	Laborfuge 400R	La centrífuga debe poder utilizarse a 450 x g
Centrífuga pequeña	Eppendorf	5415D	La centrífuga debe poder utilizarse a 400 x g
Incubadora	Heraeus	cytoperm 2	Ajustes: 37 & deg; C, 95% de humedad, 5% de contenido de CO2
espectrofotómetro UV-Vis	Varian	Cary 50 bio	Se debe registrar un espectro entre 200 y 300 nm. Por lo tanto, se deben aplicar cubetas de cuarzo
Citómetro de flujo	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	Se puede utilizar cualquier citómetro de flujo que esté equipado con un láser adecuado para la excitación de fluoresceína ( por ejemplo, < / em>, láser de argón de 488 nm
) Name	Company	Número de catálogo	Comments
Químicos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Amresco	K812	solución estéril, lista para usar
Suero fisiológico tamponado con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	comprimidos para disolver en 200 ml de agua milipora
Solución salina equilibrada Hanks (HBSS) con Ca2+	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml, verifique cuidadosamente y ajuste el valor de pH a 7.4
Ácido clorhídrico	Merck Millipore	1.09057.1000	1 M
solución Hidróxido de sodio	Riedel-deHaë n	30620	Pellets sólidos. Para una solución 1 M, resuelva 4 g/100 ml de agua Millipore
Aminofenil fluoresceína	Cayman	10157	5 mg/ml solución (11,81 mM) en acetato de metilo, alícuotas (p. ej. 100 µ l) debe prepararse y almacenarse a -20 °C; C
Peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich	H1009	Esta solución madre al 30% corresponde a una concentración de aproximadamente 8,8 M. Las diluciones adicionales deben prepararse recién en agua destilada inmediatamente antes de su uso y cuantificarse mediante mediciones de absorbancia
Hidrazida de ácido 4-aminobenzoico (4-ABAH)	Sigma-Aldrich	A41909	Se debe preparar una primera solución madre de 1 M en DMSO, una segunda de 100 mM por dilución 1:10 en productos químicos HBSS,
DMSO	VWR	23500.26	-

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