Artículo de método

Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos

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DOI:

10.3791/54484

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28 de julio de 2016

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1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el enriquecimiento rápido de leucocitos a partir de pequeñas muestras de sangre para una posterior determinación específica de la actividad de la peroxidasa halogenante dentro de las células. El método puede aplicarse a material humano y no humano y puede contribuir a la evaluación de nuevos marcadores inflamatorios.

Resumen

En este trabajo se describe un protocolo para el enriquecimiento rápido y estandarizado de los leucocitos de pequeñas muestras de sangre entera. Este procedimiento se basa en la lisis hipotónica de los eritrocitos y se puede aplicar a las muestras de humanos, así como a la sangre de origen no humano. El pequeño volumen de muestra inicial de alrededor de 50 a 100 l hace que este método es aplicable a muestras de sangre recurrente de pequeños animales de laboratorio. Por otra parte, el enriquecimiento de leucocitos se logra en cuestión de minutos y con esfuerzos materiales bajos en relación con los productos químicos y la instrumentación, por lo que este método aplicable en múltiples entornos de laboratorio.

Purificación estandarizada de los leucocitos se combina con un método altamente selectivo tinción para evaluar la actividad peroxidasa de halogenación de las peroxidasas heme, la mieloperoxidasa (MPO) y la peroxidasa de eosinófilos (EPO), es decir, la formación de hipocloroso y ácido hipobromoso (HOCl y HOBr). Mientras MPO se expresa fuertemente en neutrophils, el tipo de célula inmune más abundante en la sangre humana, así como en los monocitos, la enzima relacionada EPO se expresa exclusivamente en los eosinófilos. La actividad de halogenación de estas enzimas se aborda mediante la fluoresceína casi HOCl- y HOBr específica colorante aminofenil (APF) y el peróxido de hidrógeno sustrato de peroxidasa primaria. Tras el análisis de citometría de flujo subsiguiente todas las células peroxidasa positiva (neutrófilos, monocitos, eosinófilos) son distinguibles y su actividad peroxidasa de halogenación pueden ser cuantificados. Desde tinción APF se puede combinar con la aplicación de marcadores de superficie celular, este protocolo se puede extender para tratar específicamente de leucocitos subfracciones. El método es aplicable para detectar la producción de HOCl y HOBr tanto en humanos y en los leucocitos de roedores.

Dado el papel inmunológica ampliamente y diversamente discutido de estos productos enzimáticos en enfermedades inflamatorias crónicas, este protocolo puede contribuir a una mejor comprensión de larelevancia inmunológica de peroxidasas heme derivadas de leucocitos.

Introducción

Los leucocitos polimorfonucleares (PMNs, también llamados granulocitos) y los monocitos representan importantes componentes celulares del sistema inmune innato en el 1,2 sangre. Contribuyen a la principal defensa contra los patógenos, así como a la activación del sistema inmune adquirido y la iniciación de una respuesta inflamatoria sistémica 2-4. Sin embargo, especialmente neutrófilos, el tipo más abundante de los granulocitos y monocitos también contribuyen significativamente a la regulación y la terminación de los eventos inflamatorios agudos 5. Por lo tanto estas células también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide 6,7. De hecho, el asma, una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias, se caracteriza por una apoptosis alterada de eosinófilos, el segundo tipo más de granulocitos en la sangre 8. Sin embargo, la apoptosis de los granulocitos y su rápida eliminación por macrófagos son dos pasos esenciales durante la terminación celularde la inflamación 9-11.

En las células inmunes con nombre dos enzimas estrechamente relacionadas, a saber, mieloperoxidasa (MPO, neutrófilos y monocitos) y eosinófilos peroxidasa (EPO, eosinófilos) se puede encontrar 12,13. Estos peroxidasas hemo están clásicamente relacionadas con la respuesta inmune humoral como se oxidan de dos electrónicamente (pseudo-) haluros a la hipo correspondiente (pseudo) ácidos halosos que son conocidos por sus propiedades bactericidas 14-16. En condiciones fisiológicas MPO principalmente forma ácido hipocloroso (HOCl) y hipotiocianito (- OSCN) mientras que el segundo y hipobromoso ácido (HOBr) están formados por EPO 17-19. Los nuevos resultados sugieren que este (pseudo-) la actividad enzimática de halogenación también puede contribuir a la regulación de las respuestas inflamatorias y para la terminación de las reacciones inmunes 20,21. De hecho, la producción de HOCl mediante MPO y los productos derivados, se mostró a suprimir T respuestas inmunitarias adaptativas basadas en células 22-24.

Con el fin de ganar más conocimientos sobre la función inmunológica de los leucocitos del sistema inmune innato en enfermedades inflamatorias crónicas y para determinar la contribución de MPO y EPO a esta función fisiológica, hemos desarrollado un método para enriquecer rápidamente leucocitos de pequeñas muestras de sangre para un posterior específica determinación de la actividad de halogenación peroxidasa en estas células. Para el agotamiento de eritrocitos hemos elegido un método estandarizado incluyendo dos posteriores etapas de lisis hipotónica con agua destilada, lo que conduce a un enriquecimiento de leucocitos rápida a bajas costes de material. Para la determinación posterior de la MPO de halogenación y actividad de la EPO se utilizó el colorante fluoresceína aminofenil HOCl- y HOBr-específica (APF) 25-27. En contraste con la aplicación de métodos de tinción de peroxidasa no específica 28,29, este enfoque permite la detección selectiva de la actividad de halogenación peroxidasa, que a menudo se deteriora en infl severainflamación 30,31.

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Protocolo

Todas las muestras de sangre humana se obtuvieron de voluntarios sanos, y el protocolo de leucocitos enriquecimiento aplicado sigue las directrices de la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Leipzig. Los experimentos con sangre de rata fueron aprobados por el comité de ética local responsable (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), de acuerdo con las directrices alemanas sobre el cuidado y uso de animales.

1. Configuración Experimental

NOTA: Como el procedimiento de lisis hipotónica para el agotamiento de los eritrocitos de las muestras de sangre es un procedimiento crítico en el tiempo, preparar todo el equipo necesario (por ejemplo, tampones) para esta parte del protocolo de antemano.

  1. Etiquetar un tubo de centrífuga de 15 ml para la lisis hipotónica y un tubo de muestra de 1,5 ml para su posterior fluoresceína aminofenil (APF) tinción por muestra de sangre.
    1. Si el enriquecimiento de leucocitos se llevará a cabo en condiciones estériles, realice este etiquetado bajo un flujocaja.
  2. Preparar sobre 12 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM) por muestra. Dependiendo de si los leucocitos se pueden aislar en condiciones estériles o no, preparar PBS, ya sea mediante el uso de solución lista estéril de un proveedor o por disolución de los comprimidos de PBS en agua destilada. Comprobar el valor del pH y, si es necesario, ajustar el pH a 7,4 mediante el uso de pequeñas cantidades de soluciones 0,1 M de HCl y NaOH.
    1. Disuelva las tabletas de PBS (véase la tabla de los Materiales) en 200 ml de agua destilada para obtener una solución tampón no estéril suficiente para alrededor de 16 muestras. Si se desea, esterilizar esta solución mediante filtración estéril.
  3. Preparar sobre 1 ml de solución de Hanks de sal equilibrada (HBSS) suplementado con Ca2 + por muestra.
    1. Disolver 970 mg de sal de HBSS en 100 ml (volumen final) de agua bidestilada. Antes de llenar hasta el volumen final, comprobar el valor de pH y ajustarlo a pH 7,4. Debido a su capacidad de amortiguación baja, la elaboración de este tampón recién cada día unad realizar el ajuste de pH con un cuidado especial mediante el uso de pequeñas cantidades de 0,1 M soluciones de HCl y NaOH.
      NOTA: la solución estéril se puede utilizar, dependiendo del experimento. La solución se puede esterilizar por filtración estéril.
  4. Además de los dos tampones, etiqueta y preparar un tubo (por ejemplo, 50 ml tubo de centrifugación) o frasco (por ejemplo, 250 ml del vaso dosificador) con agua bidestilada para el procedimiento de lisis hipotónica de antemano. Preparar aproximadamente 10 ml de agua por muestra.
  5. Preparar un recipiente con hielo picado para la tinción APF (sección 3), que se realiza en el hielo.
  6. Preparar alícuotas de APF con antelación para permitir la rápida preparación de soluciones de trabajo utilizados durante la tinción (paso 3.2) y para evitar la congelación y descongelación repetida de la solución APF.
    NOTA: APF se obtiene habitualmente como 5 mg / ml (11,81 mM) solución madre en acetato de metilo.
    1. Congelar alícuotas de 10-100 l en tubos de 0,5 ml. Para la tinción de una final de la APFconcentración de colorante de 10 mM se utiliza (paso 3.8).

2. hipotónica de lisis de los eritrocitos

NOTA: Realice los pasos lisis hipotónica (excepto los pasos de centrifugación) bajo un banco de flujo laminar para evitar la contaminación. Realice todo el procedimiento a temperatura ambiente. A medida que la lisis hipotónica es un proceso crítico tiempo, ajustar las pipetas para el agua (2 ml) y PBS (5 ml) la adición de antemano y abrir el agua y frascos de PBS antes de iniciar el procedimiento. Almacenar la solución de PBS y el agua destilada a temperatura ambiente antes de su uso.

  1. De cada muestra de sangre de transferencia de 100 l al tubo de centrifugación de 15 ml apropiado.
    NOTA: En nuestros experimentos muestras de sangre por lo general contienen de 10 U / ml de heparina para evitar la coagulación. Sin embargo, debido a las diferentes fuentes de material de la muestra de la naturaleza y la concentración del anticoagulante pueden ser diferentes. Su influencia en la tinción APF debe ser probado por comparing los resultados con los resultados obtenidos a partir de muestras de sangre suplementadas con otros tipos o concentraciones de anti-coagulante.
  2. Añadir 2 ml de agua destilada y mezclar las muestras mediante el uso de un mezclador de vórtice establecido en un nivel medio. Se incuban las muestras durante 60 segundos, a continuación, añadir 5 ml de PBS por muestra y mezclar con el mezclador de vórtice.
    NOTA: Hasta unos 5 muestras se puede preparar en paralelo. Mantenga el orden de la muestra de la misma para la adición de agua y PBS para alcanzar tiempos de incubación comparables.
  3. Después de la regeneración de las condiciones isotónicas mediante la adición de PBS (paso 2.2) sedimentar las células intactas restantes en todas las muestras por centrifugación durante 6 minutos a temperatura ambiente y 450 x g.
  4. Eliminar el sobrenadante por verterlo en un cubo de basura tabla. Eliminar la mayor cantidad de líquido posible invirtiendo el tubo de centrifugación y aprovechando la apertura en una toalla de papel. Asegúrese de que el sedimento celular es tan seco como sea posible.
  5. Repetir el procedimiento de lisis hipotónica como se ha descrito antes (paso 2.2).
    norteOTA: En principio, este procedimiento de lisis hipotónica (pasos 2.3 a 2.5) se puede repetir más de una vez, dependiendo de la pureza de la fracción de leucocitos mixta a obtener. Después de dos pasos de lisis la proporción de eritrocitos restante en la fracción celular mixto obtenido es de aproximadamente 25%.
  6. Sedimentar las células intactas restantes por centrifugación durante 6 minutos a temperatura ambiente y 450 x g. Eliminar el sobrenadante (véase el paso 2.4). Añadir 500 l HBSS al sedimento y suavemente disolverlo hasta que se obtiene una solución homogénea. Transferir cada muestra al tubo de muestra 1,5 ml en consecuencia etiquetado.
  7. Dependiendo del experimento analizar directamente las muestras obtenidas (por ejemplo, a través de citometría de flujo) 25, mancha con anticuerpos marcados con fluorescencia (para la identificación de tipos de células individuales) 32, incubar con estímulos de células (para los experimentos de activación de células) 33 o almacenado en el hielo y el uso luego. Dependiendo del objetivo del estudio, realizar inmediatamente posteriores experimentos enla fracción de leucocitos mixta desde los granulocitos tienen una bastante corta vida media de alrededor de 20 hr.
    NOTA: Esto también es válido para la tinción de actividad de la peroxidasa se describe a continuación.

3. Actividad peroxidasa de halogenación tinción

NOTA: HOCl- y HOBr-producción por las peroxidasas hemo derivados de la sangre de la MPO y la OEP se cuantifica mediante el uso de la APF, que se oxida a la fluoresceína por los ácidos hipohalosos con nombre. Por lo tanto si el etiquetado de células con anticuerpos marcados con fluorescencia se lleva a cabo en combinación con la tinción de APF, evitar fluoróforos que interfieren con la señal de emisión de la fluoresceína.

  1. Realizar tinción APF a 4 ° C en hielo.
  2. Para la preparación de una solución de trabajo de APF descongelar una alícuota apropiada del colorante (por ejemplo, 10 l, 11,81 mM) y diluir con HBSS a exactamente 1 mM (por ejemplo, agregar 108,1 l de tampón a la 10 l).
    1. Para cada muestra (500 l solución de células) preparar 5 μl de la solución de trabajo APF descrito. De acuerdo con ello, utilice uno 10 l de alícuota APF (11,81 mM), lo que da 118,1 l de solución de trabajo APF (1 mM) para preparar aproximadamente 20 muestras. Debido a la pérdida durante el pipeteado preparar aproximadamente 10% más de la solución de trabajo APF que el calculado.
  3. Con el fin de comprobar la especificidad de la tinción de peroxidasa APF, preparar muestras de control con el inhibidor de la peroxidasa heme hidrazida de ácido 4-aminobenzoico (4-ABAH) 35.
    1. Preparar una solución madre 1 M de 4-ABAH (151,17 g / mol) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) por dilución de 75,6 mg de 4 ABAH en 500 l de disolvente. a diluir 4-ABAH décimo en HBSS.
  4. Para la preparación de una etiqueta de solución H 2 O 2 de trabajo de dos tubos de 1,5 ml de centrifugación con "70 mM H 2 O 2" y "7 mM H 2 O 2", respectivamente.
    1. En el tubo con la etiqueta "70 mm de H 2 O 2", recién diluida 10 lde una solución madre 30% (8,8 mM) de H 2 O 2 usando 990 l de agua destilada para obtener una concentración de aproximadamente 88 mM. Almacenar en hielo y el uso dentro de 4 horas.
      NOTA: H 2 O 2 se suministra típicamente como un 30% de solución de stock de los proveedores. Cuando se almacena a 4 ° C, es estable durante unos 3 años. Realizar diluciones de H 2 O 2 en agua destilada para evitar la descomposición. H 2 O 2 diluciones también podrían prepararse en solución 0,1 M de NaOH.
    2. Para la determinación de la H exacta concentración 2 O 2 Preparar una dilución adicional 1 a 10 de la primera H 2 O 2 solución madre (aproximadamente 88 mM) mediante la adición de 100 l de esta solución a 900 l de agua destilada en el tubo de 1,5 ml etiquetados "mM H 2 O 2 7".
    3. Grabar un espectro en el rango de cerca de UV (por ejemplo, 200 a 300 nm) utilizando un fotoespectrómetro UV-Vis y utilizar la absorbancia a 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) para determinar la concentración real H 2 O 2 en el segundo H 2 O 2 solución madre 34. Asegúrese de que la cubeta de referencia contiene sólo agua destilada. Para las cubetas de cuarzo de medición uso como se registra un espectro en la gama UV.
    4. A partir de este resultado, el cálculo de las concentraciones exactas de ambos H 2 O 2 soluciones madre. Ajustar la concentración de la primera solución madre en el "mM H 70 2 O 2" tubo de muestra a exactamente 70 mM mediante la adición de una cantidad apropiada de agua destilada. Almacenar la solución de trabajo obtenida en hielo y el uso dentro de una hora.
  5. Añadir 5 l de la solución de trabajo de 4-ABAH (100 mM) a las muestras adecuadas para una concentración final de 1 mM. Se incuban las muestras durante 15 minutos a 37 ° C en la incubadora antes de la adición APF.
  6. Añadir 5 l de solución de trabajo APF (1 mM) a cada500 muestra l para obtener una concentración de colorante final de 10 mM. Mezclar suavemente las muestras (por ejemplo, mediante el uso de la mezcladora de vórtice en una posición media) y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
  7. Añadir 5 l H solución de trabajo 2 O 2 (70 mM) a cada muestra de 500 l para una concentración final de 700 mM. Mezclar suavemente las muestras y se incuban durante 60 minutos a 37 ° C. Realizar medidas de control apropiadas en paralelo.
    NOTA: Las medidas de control mostraron que 700 mM H 2 O 2 no son tóxicos para las células. Tampoco se observaron las respuestas celulares importantes.
    NOTA: La tinción APF también puede ser realizada por la omisión de la adición de H 2 O 2, dependiendo de la pregunta científica. En ausencia de peróxido de hidrógeno sólo el MPO de cloración basal y la actividad de EPO se determina mientras que la adición de H 2 O 2 permite la detección de la máxima producción de HOCl y HOBr por las células. TEsto último significa que una señal fluorescente significativamente mayor.
  8. Para la granulación de las células, centrifugar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente y 400 x g. Eliminar completamente el sobrenadante sin destruir el sedimento y añadir 250 l de HBSS para volver a suspender las células.
    NOTA: Las muestras están ya listos para su análisis mediante citometría de flujo 25.
  9. Almacenar las muestras en la oscuridad hasta el análisis para evitar la decoloración. Después de excitación a 480-490 nm detectar la emisión de fluoresceína en alrededor de 525 nm 37.

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Resultados

Como se informó anteriormente el método descrito anteriormente resultó ser aplicable tanto al ser humano y a los materiales no humano 32. Por otra parte, como se muestra para los ratones con síntomas asmáticos la tinción APF puede ser una herramienta adecuada para detectar diferencias en el estado pro-inflamatoria sistémica. Por lo tanto en un estudio posterior se utilizó este protocolo para evaluar la actividad de halogenación repetidamente de MPO (y EPO) en ratas hembras

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Discusión

Como los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana el aislamiento de células peroxidasa positiva a menudo sólo se centra en estas células e incluye una separación de los neutrófilos de otros leucocitos por centrifugación en gradiente de densidad 38. Sin embargo, como los neutrófilos son mucho menos abundantes en las muestras de sangre murinos 39 para los últimos métodos más complicados tienen que utilizarse 40. Además ambos métodos también conducen a la eliminació...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue posible gracias a la financiación del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (BMBF, 1315883), así como al proyecto Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 de una financiación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales/Equipos
15 ml Tubos de centrifugaciónVWR/Corning734-0451-1,5
mlVWR/Eppendorf211-2130DE-Pipetas
para volúmenes de hasta 5 mlEppendorfp. ej., 3120000070Utilizamos pipetas Eppendorf Resarch plus con volúmenes ajustables en el rango de 1 a 10 y micro; l, 10-100 y micro; l, 100-1.000 y micro; l an 500-5.000 µ l
banco de flujo laminarThermo Electron CorperationHeraSafe-Vortex
mezcladorBender & Hobein AGVortex Genie 2
centrífugas de sobremesaKendro Productos de laboratorioLaborfuge 400RLa centrífuga debe poder utilizarse a 450 x g
Centrífuga pequeñaEppendorf5415DLa centrífuga debe poder utilizarse a 400 x g
IncubadoraHeraeuscytoperm 2Ajustes: 37 & deg; C, 95% de humedad, 5% de contenido de CO2
espectrofotómetro UV-VisVarianCary 50 bioSe debe registrar un espectro entre 200 y 300 nm. Por lo tanto, se deben aplicar cubetas de cuarzo
Citómetro de flujoBecton, DickinsonBD Facs CaliburSe puede utilizar cualquier citómetro de flujo que esté equipado con un láser adecuado para la excitación de fluoresceína ( por ejemplo, < / em>, láser de argón de 488 nm
) NameCompanyNúmero de catálogoComments
Químicos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)AmrescoK812solución estéril, lista para usar
Suero fisiológico tamponado con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417comprimidos para disolver en 200 ml de agua milipora
Solución salina equilibrada Hanks (HBSS) con Ca2+Sigma-AldrichH1387970 mg/100 ml, verifique cuidadosamente y ajuste el valor de pH a 7.4
Ácido clorhídricoMerck Millipore1.09057.10001 M
solución Hidróxido de sodioRiedel-deHaë n30620Pellets sólidos. Para una solución 1 M, resuelva 4 g/100 ml de agua Millipore
Aminofenil fluoresceínaCayman101575 mg/ml solución (11,81 mM) en acetato de metilo, alícuotas (p. ej. 100 µ l) debe prepararse y almacenarse a -20 °C; C
Peróxido de hidrógenoSigma-AldrichH1009Esta solución madre al 30% corresponde a una concentración de aproximadamente 8,8 M. Las diluciones adicionales deben prepararse recién en agua destilada inmediatamente antes de su uso y cuantificarse mediante mediciones de absorbancia
Hidrazida de ácido 4-aminobenzoico (4-ABAH)Sigma-AldrichA41909Se debe preparar una primera solución madre de 1 M en DMSO, una segunda de 100 mM por dilución 1:10 en productos químicos HBSS,
DMSOVWR23500.26-
,

Referencias

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