Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.
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Artículo de método
Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las terapias de ARN pequeño dirigidas a los pasos posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1 se encuentran entre los principales candidatos para la terapia génica y tienen el potencial de ser utilizadas como terapias farmacológicas para la infección por el VIH-1. Los inhibidores posteriores a la integración incluyen ribozimas, ARN de horquilla corta (sh), ARN interferentes pequeños (si), ARN de interferencia U1 (U1i) y aptámeros de ARN. Muchos de ellos se han identificado mediante ensayos de cotransfección transitoria con un plásmido de expresión del VIH-1 y algunos han avanzado a ensayos clínicos. Además de las medidas de eficacia, se ha evaluado el potencial de los ARN pequeños para afectar a la expresión de los ARN humanos, alterar el crecimiento y/o la diferenciación celular y provocar respuestas inmunitarias innatas. En los protocolos aquí descritos, se describen un conjunto de ensayos de transfección transitoria diseñados para evaluar la eficacia y la toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1. Hemos utilizado estos ensayos para identificar nuevas ribozimas y optimizar el formato de los shRNAs y siRNAs dirigidos al ARN del VIH-1. Los métodos proporcionan un conjunto rápido de ensayos que son útiles para el cribado de nuevos ARN anti-VIH-1 y podrían adaptarse para cribar otros inhibidores de la replicación del VIH-1 después de la integración.
Introducción
Una limitación de los actuales tratamientos para el VIH-1 es que deben ser administrados crónicamente para prevenir la progresión de la enfermedad. Trasplante de VIH-1 resistentes a los linfocitos T, o células madre hematopoyéticas, tiene el potencial de proporcionar el control a largo plazo del VIH-1 de replicación en ausencia de la terapia con medicamentos 1,2 y también puede ser un enfoque eficaz para alcanzar una cura de VIH-1 3. Una forma de hacer que las células resistentes al VIH-1 de replicación es insertar uno o más genes que codifican anti-VIH-1 ARN o péptidos en células de un individuo infectado durante un trasplante autólogo 4.<....
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Protocolo
1. Las células y transfecciones
- Cultura células HEK 293T en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Preparar una suspensión 2 x 10 5 células / ml en el medio de cultivo celular. Añadir 500, 100 y 1.000 l de la suspensión celular a cada pocillo de 24 pocillos, placas de 96 pocillos y 12 pocillos, para la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente (Figura 2A).
- Hacer girar suavemente las placas y se incuban O / N a 37 ° C con 5% de CO2. Se cultivan las células a 50-70% de confluen....
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Resultados
Un esquema general de los procedimientos se muestra en la Figura 2 con un plan de transfección ejemplo para tres ARN de prueba y un ARN de control proporcionada en la Figura 2B. Para los ensayos de producción y la viabilidad celular virales, La lectura para cada construcción de prueba es normalizada a un control negativo. Las réplicas se transfectan en conjuntos, de modo que cada ARN de ensayo se normalizó a su control negativo adyacente. Esto se hace pa.......
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Discusión
El ensayo de la producción de VIH-1 descrito se realizó utilizando células HEK293T (Figura 2) y es similar a los ensayos utilizados para la detección de VIH-1 RNA de ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, siRNA 30, y ARN U1i sitios 11,31 objetivo. El uso de diferentes métodos para cuantificar la producción de VIH-1, la mayoría de estudios han medido la producción viral 48 horas después de la co-transfección de un plásmido de expresión de VIH-1 con los ARN candidatos.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo presentado aquí fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (otorga DCB-120266, PPP-133377 y 348967 a HBF-AG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicilina/Estreptomicina Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Placas de cultivo celular, 96 pocillos, 24 pocillos, 6 pocillos. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Microtubos Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Poly I:C de bajo peso molecular | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | reactivo de transfección para ARN sintético |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | reactivo de transfección para plásmidos de expresión de |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| plantilla de ARN poli(A) | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 cebador de ADN | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Contador de centelleo de microplacas | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Espectrofotómetro de microplacas | Bio-rad 1706930 | ||
| Lysis comprimidos tampón Roche | 4693159001, 4906837001 | inhibidores de la proteasa y la fosfatasa | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reactivo | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel cámara de funcionamiento | Hoefer | SE600 | |
| Célula de transferencia semiseca | Bio-rad | 1703940 | |
| escalera de proteínas EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Membrana de nitrocelulosa | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Solución de extracción de anticuerpos | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | ||
| Anticuerpo | del Dr. B.L. Bass | ||
| anticuerpo phospho-T446-PKR Anticuerpo | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 | Señalización celular | 4947 | |
| Anticuerpo | del Dr. A. Hovanessian | ||
| Anticuerpo IRF3 | Señalización celular | 11904 | |
| Anticuerpo de actina | Millipore | MAB1501 | |
| Cabra con peroxidasa anti-conejo | KPL | 474-1506 | |
| Cabra con peroxidasa anti-ratón | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
Referencias
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
- Allers, K., et al....
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Reimpresiones y permisos
